גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

Summary

דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד_180-199 (P0) בשילוב עם אדג'וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.

Abstract

לדלקת בעצה חיסון ניסיוני (EAN) הוא מודל ניסיוני היטב להערכה של מחלות אוטואימוניות של המיאלין היקפיים. EAN מחלה הנגרמת על ידי immunizing עכברים עם פפטידים neurogenic לביים מתקפה דלקתיות כלפי מרכיבי מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). התפתחויות אחרונות אפשרו את אינדוקציה של EAN בקו עמיד יחסית C57BL/6 העכבר באמצעות חלבון המיאלין אפס (P0)_106-125 או פפטידים_180-199 P0 יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של הרעלן שעלת. היכולת לגרום EAN בנימה זו C57BL/6 מאפשר השימוש בכלים גנטיים רבים הקיימים על רקע זה העכבר, ובכך מאפשר חקר המחלה פתוגנזה מתוחכמים והחקירה של הפעולה מכניסטית של הרומן הרפוי ב בשילוב עם גישות מהונדס. במחקר זה, נדגים בגישה פשוטה לזירוז בהצלחה EAN באמצעות פפטיד_180-199 P0 בעכברים C57BL/6. אנחנו גם חלוקה לרמות פרוטוקול להערכה של גירעונות פונקציונלי המתרחשות במודל זה, בליווי מגוון רחב של תכונות neuropathological. לפיכך, המודל הזה הוא מודל ניסיוני עוצמה ללמוד בפתוגנזה של האנושי מחלות עצבים היקפיים המיאלין, וכדי לקבוע את היעילות של טיפולים פוטנציאליים שואפים לקדם את תיקון המיאלין ולהגן מפני נזק עצבי אוטואימוניות לדלקת בעצה.

Introduction

מחלות עצבים היקפיים יכול להיות גנטי במקורם או הנרכש, עם נזקי רכשה שיש גם מטבולית, ischaemic, precipitants דלקתיות או רעילים. מחלות אלו מסווגים גם מועיל או עצב, או demyelinative במקורם. הנפוצות ביותר רכשה demyelinating מחלות עצבים היקפיים הם חריפה דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (AIDP, הידוע גם בשם תסמונת גיליאן, GBS) כרונית דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; שניהם מאופיינים שאינן קשורות pathogenetically תגובה אוטואימונית נגד למעטפת מיאלין, גורם demyelination של העצבים ההיקפיים. במחלות אלה, תאי T מופעל לחצות את מחסום הדם העצבים וליצור תגובה חיסונית בתוך מערכת העצבים ההיקפית. הפעלה של מקרופאגים בתוך העצב ואז גורם demyelination או ישירות באמצעות התקפה phagocytic או בעקיפין באמצעות מופרשים מתווכים דלקתיים, והתוצאה היא מגבלה קליניים כגון שיתוק ובעיות תפקוד חושי⁵. ואילו האקסונים demyelinated לשמור על היכולת להיות remyelinated בעקבות demyelination, remyelination מתעכבת לעיתים קרובות או שלם, וכתוצאה מכך הרגישות של האקסונים עירום כדי נזק בלתי הפיך, שהיא הגורם הקבוע קליני נכות. כיום, הטיפולים היעילים ביותר הם immunomodulatory, אבל למרות היעילות שלהם, במקרים רבים ההתאוששות הוא לרוב איטי, ~ 25% מהחולים יחוו שיורית גירעונות פונקציונלי זה להפחית באופן משמעותי את איכות החיים שלהם^{6, 7}.

EAN הוא מודל בעלי חיים בשימוש נרחב של demyelinating נוירופתיה אשר סיפקה תובנות לתוך פתוגנזה ואת אמצעי כדי להעריך את הרומן סוכני טיפולית⁴. מודל זה יכול להיגרם מינים שונים כגון ארנבות, חולדות, עכברים, שרקנים, הנגרמת על ידי חיסון עם אנטיגנים neurogenic. עם זאת, בסופו של דבר אינדוקציה EAN מוצלח תלוי תגובה חיסונית המתאים למחלה להתרחש. בהתחשב הווריאציות מינים (וגם בין-species/זן) בתפקוד המערכת החיסונית, צירופים מרובים של אנטיגנים וחיסונים adjuvants פותחו לזירוז בהצלחה EAN. מבחינת כלים גנטיים מאתר, C57BL/6 היא הנפוצה ביותר; עם זאת, פפטיד חלבון P2 מסורתי 57-81 (P2_57-81) זה גורם למחלה רגישים SJL העכבר זן⁸ אין אפשרות פתוגנזה איליקיט שמוביל לגירעונות פונקציונלי המתח C57BL/6. למרבה המזל, פרדיגמות רגישות עולה באמצעות P0_106-125 או פפטידים_180-199 P0, יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של שעלת ניתן הרעלן להתגבר על מכשול זה הפעלת כלים גנטיים מתוחכמים להיות מנוצל מודל EAN מאתר.

כאן מוצגת שיטה פשוטה עבור אינדוקציה של EAN בעכברים C57BL/6. בנוסף, מסופק בגישה מפורט מקיף מאת בו יש להעריך את גירעונות neuropathological פונקציונלי הקשורים במחלה. פפטיד⁹ _{199 180–}P0 נבחר העדפה P0_57-81 חלופי¹⁰. המודל₁₉₉ P0_180–שתיארנו לייצר סימנים קליניים חמורים פחות בהשוואה P0_57-81 אלטרנטיבית¹⁰ולכן נוטים לספוג את ההקדמה של פוטנציאל לפליטת גנטי ברישול, להתאושש הליכים כירורגיים (כגון משאבת osmotic השרשה), והוא נוטה הליכון בהליכה פונקציית בדיקת⁴. עם זאת, ההליכון הילוך תפקודי והפרוטוקולים היסטולוגית המתוארים כאן יכול בקלות להיות מיושם כשלמדתי המחלה ב- variant_57-81 המושרה P0.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן ואושרו על ידי מכון Florey Neuroscience, ועדת האתיקה של בריאות הנפש (מרכז המוח מלבורן) חיה ופעל קוד האוסטרלי של התרגול עבור שימוש של בעלי החיים עבור מדעי מטרות.

1. EAN אינדוקציה

הערה: EAN יכולה להיגרם בהצלחה בעכברים C57BL/6 גברים בגילאי 6-8 שבועות. פרוטוקול אינדוקציה לוקח 9 ימים בסך הכל. יום 0 מתייחס ביום התחסנות הראשון. עבור פרוטוקול זה, נערכו זריקות תחת הרדמה (ראה שלב 1.1.2 להלן).

1. על יום-1:
   1. להכין את הרעלן שעלת (ראה טבלה של חומרים) פתרון של 1.6 µg/mL באמצעות פוספט העכבר-מול סטרילי של 0.1 M buffered תמיסת מלח (MT-PBS).
   2. ההרדמה עם איזופלוריין:
      1. הנח את העכבר (C57BL/6, זכר, 6-8 שבועות) בבית הבליעה ההרדמה ולהתאים את זרימת החמצן 1 ליטר לדקה
      2. להדליק את מכשיר אידוי איזופלוריין, להתאים אותו ל- 2.5% עבור ההרדמה, והצג נושם, לחכות 2 דקות, או עד ראשי רפלקסים (האיבר הקרנית, האחוריות) הם כבר לא מגיבה
   3. להסיר את העכבר מן החדר ההרדמה ולפקח 250 µL של הפתרון שעלת הרעלן לעיל באמצעות הזרקה בקרום הבטן (i.p.) בעזרת מזרק 0.5 mL עם מחט 30 ^1/2 G.
   4. להכין את inoculum בזריקות חיסון:
      1. להכין פתרון A באמצעות 2 מ"ג/מ"ל תמיסת פפטיד _180-199 P0 (עם > טוהר 98%, רצף S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) ב- saline 0.9%.
      2. הכן B פתרון באמצעות 20 מ"ג/מ"ל תמיסת שחפת Mycobacterium (ראה טבלה של חומרים) בפרוינד ' s אדג'וונט מלאה (FCA, הכוללת: monoolate mannide 15% + 85% שמן פרפין, 0.5 מ"ג/מ"ל של שבבי נהרג ויבשים מ' Mycobacterium butyricum).
      3. לעשות את inoculum הסופית על הזרקת, לשלב חלקים שווים נפח של פתרונות A ו- B מכה חרוז ומערבבים אותם במהירות מקסימלית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
         הערה: פתרונות A ו- B יכול להיות שמר בתור מניות ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש אבל inoculum הסופית משולב חייב להיות מוכן טרי ביום של הזריקה העכבר.
2. ביום 0, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית באמצעות מחט 23 גרם-
   הערה: הזרקת וניתן לשים בין השכמות, או בין הגפיים האחוריות הזנב סימטרית dorsum.
3. -1 יום, להפוך את הפתרון שעלת הרעלן של 1.2 µg/mL (ב- MT-PBS) ולפקח 250 µL לתוך עכבר באמצעות הזרקת i.p. באמצעות מזרק 0.5 mL עם מחט 30 ^1/2 G.
4. על יום 3, חזור על שלב 1.3 לעיל.
   הערה: פתרונות מניות A ו- B יכול להיות מורכב ומאוחסנים ב 4 הלעפה תרוטרפמט לתקופה מקסימלית של חודש אחד. עם זאת, inoculum להזרקה הסופי, המיוצר על ידי שילוב של פתרונות מניות A ו- B, חייב להיעשות ביום של הזריקה.
5. ביום 8, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית (ראה שלב 1.2 לעיל), באותו אתר הזרקת כמו שלב 1.2 (עבור כל חיה)

2. הניקוד קלינית

1. לבצע קליניים ניקוד יומי החל ביום 0-
2. לתת את העכבר כל ציון של 0, 1, 2, 3 או 4 לפי הקריטריונים שפורסמו ⁴. ראה טבלה 1 עבור ניקוד קליניים EAN.
   הערה: עקביות, מאמץ כדי להבקיע עכברים באותו זמן מדי יום על ידי החוקר אותו.

3. מנוע הערכת פונקציה

הערה: ביצועי המנוע שקובעת במקביל הבקיע קליניים עבור אותה קבוצה של בעלי חיים. מנגנון הערכה המוטורית חייב להיות מחובר למחשב כי מערכת הדמיה של הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים) התקין. מומלץ גם כי עכברים כל לפנות לבדיקה צריך להיות בלתי לפעילות פועל לפני EAN אינדוקציה. כדי לעשות זאת, תרגולים (2 הרצפים מבחן לכל עכבר) מבוצעים שלושה ימים לפני המחלה אינדוקציה (יום-3)-

1. להפעיל מנגנון הערכה המוטורית ולעבור על כפתור קלה.
2. עורפה העכבר בחוזקה, דיו רגליה על ידי הורדתו לתוך מיכל מלא דיו אדום תוך החזקת זנבו.
   הערה: שלב זה נדרש עבור המתח C57BL/6, אך ניתן לדלג אם זן עכבר עם צבע החלוק הלבן משמש.
3. הנח את העכבר לתוך תא הליכה ו להגדיר את מהירות הליכון-15 ס מ/s.
4. להפעיל את ההליכון ולחץ " שיא " כפתור כדי ללכוד את התנועה המצטבר של העכבר באמצעות הפונקציה הילוך מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
5. השתמש טיימר ולמדוד כל ריצה ל-36 s. לאחר 36 s, הקלטת עצור, עצור ההליכון.
   הערה: עכברים אין אפשרות להשלים בהצלחה המשימה הפועלת עבור מרווח זמן 36 זה s נחשבים נכשלו.
6. לשמור את קובץ הווידאו בתיקיה המיועדת.
7. חזור על השלבים שלעיל עבור כל עכבר לפנות לבדיקה. מבחן העכברים עם המשימה הפועלת באותו כל 3 ימים.
8. לנתח את קבצי הווידאו הערוכות באמצעות תוכנה עבור פרמטרי הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: הפרטים של כיצד לנתח פרמטרים מוטוריים שונים להשתנות בין תוכנה אז נא לפנות ליצרן ' s הדרכה לפני ניתוח. כדי לקבל עדות היסטולוגית של עצב נזק המיאלין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיה רקמות ניתן לקחת על כל שלב פוסט המוטורית ההערכה בהתאם מטרות ספציפיות של מחקר או אימונוהיסטוכימיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

P0_180-199 פפטיד המושרה EAN ב- C57BL/6 הפניות עכברים במחלה monophasic עם הציון הקליני תחילת ממוצב 6 ימים חומרת הציון הראשונה של חיסון (dpi), מרבי נצפית של 25 dpi ואחריו את הציון הקליני כמה שיפור של 40 dpi משך (איור 1)^4,9. מבחינת תפקוד ההליכה, עכב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דו ח זה מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום EAN באמצעות פפטיד_180-199 P0 בעכברים C57BL/6, המאפשר כימות של גירעונות neuropathological ופונקציונליים מפתח בעכברים המושרה עם EAN. ברורים בפרוטוקול אינדוקציה EAN המתוארים כאן הוא השימוש של הרדמה תוך כדי ביצוע זריקות חיסון. השימוש איזופלוריין הרדמה משפר באופן משמעותי את ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc