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Resumen

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

Resumen

Demostrar un método usando Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar la interacción microbiana. Microbios se introducen a través de la dieta haciendo que el intestino la ubicación primaria de la enfermedad. El intestino nemátodo estructural y funcionalmente imita los intestinos mamíferos y es transparente lo que es susceptible de estudio microscópico de la colonización. Aquí mostramos que el patógeno pueden causar enfermedad y muerte. Somos capaces de identificar a mutantes microbianos que muestran alteración de la virulencia. Su respuesta innata conservado a estreses bióticos hace C. elegans un excelente sistema para sondear facetas de interacción inmune innata de host. Mostramos que hosts con mutaciones en el gen de la oxidasa dual no pueden producir especies reactivas de oxígeno y son incapaces de resistir el insulto microbiano. Además demostramos la versatilidad del ensayo de supervivencia presentado mostrando que puede ser utilizado para estudiar los efectos de los inhibidores del crecimiento microbiano. Este ensayo también puede ser usado para descubrir factores de virulencia de hongos como dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos, así como proporcionar una oportunidad para descubrir otras interacciones host-microbio. El diseño de este ensayo presta bien a alto rendimiento pantallas de todo el genoma, mientras que la capacidad de gusanos de crio-conservar para uso futuro, es un modelo rentable y atractivo todo animal para el estudio.

Introducción

C. elegans se ha utilizado como organismo modelo de gran alcance para más de 50 años. En la década de 1960, biólogo sudafricano Sydney Brenner pionero en el uso de C. elegans a estudiar desarrollo neuronal, allanando el camino para un largo linaje de científicos para estudiar diversos aspectos de la biología celular y animal de nematodos. Este linaje incluye a galardonados con el Premio Nobel Craig Mello y Andrew Fire para su trabajo de ARNi1, Robert Horvitz y John Sulston por su trabajo en el desarrollo de órganos y apoptosis2,3,4, Martin Chalfie por sus trabajos sobre la proteína fluorescente verde5. Aunque este organismo modelo se ha utilizado tradicionalmente para el estudio de biología molecular y del desarrollo, en los últimos 15 años, los investigadores han comenzado a utilizar C. elegans para investigar la biología de los patógenos humanos diversos incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericay Serratia marcescens6,7,8,9,10. Estos estudios revelaron que muchos de los mecanismos implicados en la interacción de patógenos humanos se conservan en nemátodos, pero también que hay algunos mecanismos de inmunidad que son exclusivos de este organismo modelo11,12. En la naturaleza, C. elegans se encuentra con una variedad de amenazas de los agentes patógenos presentes en el suelo y esto ha proporcionado una fuerte presión selectiva para evolucionar y mantener un sistema inmune innato sofisticado en su lumen intestinal. Muchos de los genes y mecanismos involucrados en la protección de la luz intestinal están orquestados por elementos altamente conservadas que también existen en los mamíferos superiores11,13. C. elegans , por tanto, representa un gran modelo para el estudio de patógenos gastrointestinales como Salmonella enterica14, Shigella boydii15o16de cólera del vibrión.

Aquí destacamos la notable versatilidad de C. elegans como anfitrión modelo para el estudio de agentes infecciosos tales como C. albicans. C. elegans como anfitrión modelo permite la detección de alto rendimiento de virulencia que es menos costoso y desperdiciador de tiempo que un modelo de ratón, que se utiliza comúnmente para el estudio de la candidiasis42.

En este estudio, mostramos que este modelo y el análisis de supervivencia assosiated pueden ser confiablemente utilizados para estudiar efectores inmune innata del huésped importantes para contrarrestar infecciones, determinantes patógenos que virulencia, y compuestos farmacológicos que pueden intervienen en la patogénesis. Diferentes ensayos anteriormente descritos, este método proporciona un medio de estudiar la exposición a un patógeno durante la vida del animal, desde el estado larvario a la edad adulta, en lugar de sólo la edad adulta a muerte43,44. En Resumen, nuestro C. elegans - modelo de C. albicans es una herramienta versátil y poderosa que puede utilizarse no sólo para estudiar las bases genéticas que conducen a la infección y la inmunidad, sino para identificar nuevos compuestos para la intervención terapéutica.

Protocolo

1. preparación de medio de crecimiento nematodo (NGM)

  1. para 1 L de medios de comunicación combinan agar 20 g, 2,5 g fuente de nitrógeno orgánico (e.g., bacto-peptona) y 3 g de cloruro de sodio en un matraz de 2 L. Añadir 975 mL de agua estéril.
    1. Agregar en una barra de agitación estéril. Si se utiliza un dispensador automático de medios de comunicación, tubería de autoclave y media durante 15 min; los medios de comunicación deben ser esterilizado para ya si es un volumen más alto.
  2. Establecer los medios de comunicación en remover la placa y deje para enfriar.
    1. Una vez que los medios de comunicación está caliente al tacto (aproximadamente 60 ° C) asépticamente añada 1 mL de 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL de 1 M de CaCl 2, 25 mL de KPO 4 y 1 mL de colesterol de 0,5% en etanol.
    2. Vierta media (manualmente o por bomba automática) bajo flujo laminar en 35 x 10 mm placas de petri estériles. Deje que se seque bajo campana por 1-2 días antes de su uso.
      Nota: Las placas deben guardarse a 4 ° C para evitar la contaminación.

2. Hacer un gusano Pick

  1. corte un pedazo de 1,5 cm de alambre de aluminio. Cuidadosamente Inserte la punta de una pipeta Pasteur aproximadamente 0,5 cm de esta longitud.
    1. Usando un quemador de Bunsen o lámpara de alcohol, fundir la punta de la pipeta de cristal girando lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiere firmemente a la pipeta, sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta.

3. Preparación de la cultura de e. coli

  1. utilizando un asa estéril, inocular una colonia de e. coli cepa OP50 en 200 mL de caldo Luria. Incubar durante una noche con agitación a 37 ° C.
  2. El cultivo líquido está listo para usar al día siguiente y pueden ser almacenada a 4 ° C cuando no esté en uso.
    Nota: La cepa de e. coli, OP50, se utiliza como fuente de alimento para C. elegans. Este cultivo puede ser utilizado por hasta varios meses si se almacena a 4 ° C.

4. Esencial C. elegans mantenimiento

  1. semilla preparada las placas de agar NGM con e. coli por manchas aproximadamente 50-100 μl de preparados OP50 cultivo líquido en el centro de la placa de.
  2. Placas y déjelos secar a temperatura ambiente durante 24 h. Una vez seco, colocar las placas a 37 ° C durante la noche para un rápido crecimiento o mantener a temperatura ambiente, si se desea un crecimiento más lento.
  3. Añada gusanos a la placa o " trozos, " (ver protocolo paso 5 " Chunking y recogiendo gusanos "), recogiendo gusanos individualmente o colocar huevos de gusano directamente sobre la placa (ver protocolo paso 6 " huevo preparación ").

5. Chunking y recogiendo gusanos

Nota: " trozos, " se refiere a una práctica que es común en el mantenimiento de C. elegans. Se trata de cortar una sección de la placa de agar NGM que contiene gusanos y así también transferir esta pieza en un plato nuevo, transferir un gran número de gusanos en el proceso. La contaminación también puede cortar de la placa de esta manera. Cuando recogiendo gusanos, es importante mantener la integridad del agar porque gusanos pueden ser perdidos en los agujeros en el agar. Además, es importante permitir que la hoja se enfríe antes de tocar la placa para evitar fundir el agar o quema los gusanos.

  1. Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos en las nuevas placas, cortar un trozo de agar NGM que contiene las lombrices seleccionadas con una espátula. Retirar la pieza cortada y poner cara abajo en el borde del césped de OP50 en un plato nuevo.
  2. Transferencia de gusanos individualmente como se describe a continuación en el paso de protocolo 8.2, " Análisis de la supervivencia, " utilizando un gusano pick. La llama el alambre en la recogida del gusano hasta que esté rojo. Retire del fuego y deje que se enfríe durante unos segundos.
  3. Con el cable en la selección, raspar suavemente el césped de la cultura OP50 crecido en la placa de nuevo, cubriendo el hilo en el pico.
  4. La cultura viscosa que cubre la punta del alambre hace gusanos se pegan a la punta de la ganzúa, así suavemente recoger gusanos seleccionados con un movimiento de swiping.
  5. Una vez que las lombrices se reúnen, colocarlos en un plato nuevo deslizando suavemente la cultura en el agar. Coloque el alambre en la llama para eliminar la cultura restantes en la selección.

6. Preparación del huevo

  1. colocar aproximadamente 20 animales adultos (aproximadamente 2-3 días después de la eclosión, cuando se cultiva a 20 ° C) por cosecha o por trozos como se describe en el paso 5, de protocolo " Chunking y recogiendo gusanos, " en una placa sembrada con 50 Μl de cepa de e. coli, OP50.
  2. a recoger los huevos, inundar la placa con 10 mL de buffer M9 después de 1-2 días. Utilizando una pipeta serológica de vidrio, agitar y agitar suavemente el contenido sobre la placa de agar para lanzar huevos atascados OP50 o animales adultos. Recoger todo el líquido que contiene los huevos y adultos.
    3. Tubo de
  3. solución de transferencia M9 y OP50 en un cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo cónico de 15 mL a 2.100 x g durante 2 min
  4. Aspirar aproximadamente 9 mL del sobrenadante sin perturbar el pellet OP50.
  5. Resuspender el precipitado en 2 mL de agua estéril, 1 mL de blanqueador y 1 mL de NaOH M 0.25.
  6. Mezclar suavemente por inversión hasta que la mayoría (aproximadamente el 70 por ciento) de los animales adultos aparece sometidas a lisis, por lo general, huevos permanecen intactos durante este tratamiento blanqueador corto debido a su cáscara. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante 2 min
  7. Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspenda el sedimento en 10 mL de buffer M9.
  8. Centrifugar el tubo cónico en 990 x g para 2 min aspirar sobrenadante sin pellets inquietante. Vuelva a suspender los pellets con 200 μL de buffer M9.
    Nota: La preparación de huevo puede requerir múltiples ensayos. Huevos pueden ser destruidos si se exponen para blanquear demasiado. Si no salen de los huevos, disminuir la concentración de cloro en solución o disminuir la duración de la exposición a bleach.

7. Instalación de placa de infección

  1. distribuir 3-5 mL de YPD en un tubo de ensayo estéril y sembrar con una sola Colonia de Candida albicans utilizando un asa estéril.
    1. Coloque el tubo en un tambor rotatorio para aproximadamente 16-18 h a 30 ° C.
  2. Etiqueta un 1,5 mL tubo de microcentrífuga para contener C. albicans y otro para contener OP50. Registrar el peso de cada tubo de vacío.
    1. Lugar 500 μl de la noche a la mañana cultura de C. albicans en el tubo con la etiqueta C. albicans y 1.500 μl de la noche a la mañana OP50 cultura (paso 3.1) en el tubo etiquetado OP50.
    2. Centrifugar 10 min a 16.100 x sobrenadante de aspirado g. sin pellets inquietante.
    3. Resuspender cada pellet con 500 μl de agua estéril. Centrifugar durante 5 min a 16.100 x g.
    4. Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Registrar el peso final de los tubos del microfuge.
    5. Determinar el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microcentrífuga del peso final.
  3. Con agua estéril, Resuspender el pellet de C. albicans a 10 mg/mL y el sedimento OP50 a 200 mg/mL. Hacer una infección principal mezcla combinando 10 μl de una solución de 50 mg/mL de estreptomicina, 2.5 μl de cultivo OP50, 0,5 μl del cultivo de C. albicans y 7 μl de agua estéril.
    1. Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta.
      Nota: Se necesitan aproximadamente 100 gusanos para determinar significación estadística durante el análisis. Este ensayo se ejecuta normalmente por triplicado. Por lo tanto, se hace un 3.2 x mezcla de infección, así como a 3.2 x solución de control. Estas mezclas se hacen para ser un poco sobre 3 x el original para asegurarse de que se siembra un total de 20 μl en cada plato, permitiendo espacio para error. Esta mezcla principal se crea porque la faringe del gusano es insuficiente durante las primeras etapas larvales (L1-L3) consumir C. albicans. La exposición a agentes farmacológicos como el fluconazol ( figura 3B), el agente se introduce en la mezcla de la infección. Empíricamente se determina la concentración del agente. Por ejemplo, en la figura 3B, 50 μm fluconazol está representado, sin embargo 0, 12,5, 25, 50 y 100 μm fluconazol también fueron probados usando el mismo protocolo de.

8. Análisis del fenotipo de deforma la región Anal (Dar) y análisis de supervivencia

  1. Visualize el fenotipo de Dar
    Nota: Dar mejor se visualiza en la fase L3 y más allá. Dar se presenta como una pequeña protuberancia en la región anal post del gusano ( figura 2A), que llega a ser más prominente con el tiempo.
    1. Confirmar si un animal tiene Dar rápidamente tocando la placa en la etapa del microscopio de disección, animales sin Dar voluntad mover hacia atrás inmediatamente, mientras que animales con Dar cualquier necesidad repetidas rondas de tapping para invertir su dirección, o no lo hará en todo.
  2. Análisis de supervivencia
    1. preparación de huevo completo, como se describió anteriormente en el paso del Protocolo 6, " huevo preparación ". Contar los huevos bajo el alcance de la disección y diluir la solución de huevo con M9 hasta alcanza una concentración de aproximadamente 5-6 huevos sanos por μl. Utilizando una pipeta, dispensar 20 μl de muestra que contenga aproximadamente 30 huevos en plato NGM preparado, en el área entre el cultivo bacteriano y el lado de la placa (huevos y comida de gusano, OP50, están en dos lugares distintos).
    2. Incubar las placas a 20 ° C durante 48 h. Debajo de un microscopio de disección, cuenta el número de gusanos vivos y muertos adultos en cada plato, así como el número de gusanos con Dar. Registrar el porcentaje con Dar.
    3. Considerar un animal muerto si no responde al ser golpeada en la cabeza por un alambre de aluminio o golpear ligeramente en la plancha.
    4. Día, transferencia gusanos adultos restantes por selección como se describe en el paso 5, de protocolo " Chunking y recogiendo gusanos, " en un plato nuevo de infección o control. En este punto, si es necesario, realizar un análisis de supervivencia mediante el seguimiento del número de gusanos vivos, muertos y desaparecidos cada día.
      Nota: Este ensayo puede funcionar durante dos semanas, comenzando con la preparación de huevo. Además, la solución de huevo debe no distribuirá en el cultivo bacteriano, como la solución puede contener trazas de cloro que puede matar el OP50. La solución también debe ser despachado aproximadamente 0,5 cm del borde de la placa, como huevos pueden atorarse entre los lados de la placa y el agar. Además, debido a la rápida proliferación de gusanos adultos en nuevas placas de transferencia es fundamental para separarlos de su progenie.
  3. Analizar la supervivencia
    1. analizar los resultados utilizando el software de análisis de curva de supervivencia (véase lista de materiales).
      2. Curvas de
    2. compara la supervivencia mediante el método de Breslow-Grehan-Wilcoxon (suponiendo que los datos de los primeros tiempos de supervivencia son más precisos que tiempos posteriores, los datos de peso por consiguiente) así como herramientas estadísticas de rango logarítmico 45.
      Nota: Por ejemplo, en la Figura 4B -C, la supervivencia de gusanos tratados con mutantes de C. albicans es comparada con aquellos tratados con controles de tipo salvaje isogénicas o complementarystrains.

Resultados

Un análisis de la patogenia (figura 1) con C. albicans y C. elegans se ha descrito previamente por nuestro laboratorio17,18 y otros laboratorios19,20. Demostramos la receptividad del uso de C. elegans para el estudio de virulencia de C. albicans que demuestran que las células de C. albicans son in...

Discusión

Los métodos de ensayo de infección de C. elegans y supervivencia sobre exposición de por vida a C. albicans que hemos descrito pueden ser modificados para probar otro patógeno. Cultivos líquidos de otra bacteria u hongo pueden hechos y alimenta a C. elegans de manera similar. Además, pueden ensayarse la serie infecciones exponer primero la larva a un patógeno como se describe, y luego transferir los animales en un nuevo plato que contiene un patógeno independiente después de alcanzar l...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue realizado en y apoyado por el Instituto Politécnico de Worcester.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Products20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted MicroscopeAxiovision Zeiss
Bacto-PeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans strain Bli-3Caenorhabditis Genetics CenterBli-3(e767) CB767
Calcium ChlorideFisher ScientificBP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%SigmaC8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)GraphPad Software
LB Broth (Miller's)Apex BioResearch Products11-120
Magnesium SulfateFisher Scientific10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Wildtype C. albicans SC5314ATCCSC5314
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2

Referencias

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