Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Riepilogo

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

Abstract

Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l'interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l'intestino il luogo primario per la malattia. L'intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell'ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l'opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.

Introduzione

C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l'uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi¹, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell'organo e apoptosi^2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde⁵. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens^6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell'interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo^11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi^11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica¹⁴, Shigella boydii¹⁵o vibrione del colera¹⁶.

Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi⁴².

In questo studio, mostriamo che questo modello e l'analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l'esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell'animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell'età adulta a morte^43,44. In sintesi, il nostro c. elegans - modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l'infezione e l'immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.

Protocollo

1. preparazione del Nematode crescita medio (NGM)

1. per 1 L di media, unire 20 g di agar, fonte di azoto organico 2,5 g (ad es., bacto-peptone) e 3 g di cloruro di sodio in un pallone da 2 L. Aggiungere 975 mL di acqua sterile.
   1. Aggiungi in un ancoretta sterile. Se si utilizza un versatore automatico dei supporti, la tubazione di autoclave e la media per 15 min; media dovrebbe essere sterilizzato nell'autoclave per più se viene effettuato un volume più alto.
2. Impostare media sulla piastra di mescolare e lasciare per raffreddare.
   1. Una volta media è calda al tatto in modo asettico (circa 60 ° C) aggiungere 1 mL di 1 M MgSO ₄ ● H ₂ O, 1 mL di 1 M CaCl ₂, 25 mL di KPO ₄ e 1 mL di colesterolo di 0,5% in etanolo.
   2. Versare media (a mano, o di pompa automatica) sotto flusso laminare in 35 x 10 mm Petri sterili. Lasciare per asciugare sotto cappa per 1-2 giorni prima dell'uso.
      Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C per evitare la contaminazione.

2. Facendo un Worm Pick

1. tagliare un pezzo di filo di alluminio 1,5 cm. Inserire la punta di una pipetta di Pasteur attentamente circa 0,5 cm di questa lunghezza.
   1. Utilizza un bruciatore di Bunsen o lampada dell'alcool, sciogliere la punta della pipetta di vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo è rispettato in modo sicuro la pipetta, senza compromettere la forma originale della punta della pipetta.

3. Preparazione della cultura di e. coli

1. con un'ansa sterile, inoculare singola colonia di e. coli ceppo OP50 in 200 mL di brodo di Luria. Incubare per una notte con agitazione a 37 ° C.
2. La coltura liquida è pronta per l'uso il giorno seguente e possono essere conservata a 4 ° C quando non in uso.
   Nota: Il ceppo di e. coli, OP50, viene utilizzato come una fonte di cibo per elegans del c. Questa cultura può essere utilizzata per fino a diversi mesi se conservato a 4 ° C.

4. Essenziale di c. elegans manutenzione

1. seme preparato piatti di agar NGM con e. coli individuando circa 50-100 µ l di preparati OP50 coltura liquida al centro del piatto.
2. Piastre di copertura e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Una volta asciutto, posizionare le piastre a 37 ° C durante la notte per una crescita rapida o conservare a temperatura ambiente, se non si desidera una crescita più lenta.
3. Aggiungere vermi alla piastra da uno " chunking, " (Vedi protocollo passo 5 " Chunking e Picking worm "), picking vermi individualmente o disporre le uova di verme direttamente sulla piastra (Vedi protocollo passo 6 " uovo preparazione ").

5. Chunking e Picking worm

Nota: " Chunking, " si riferisce ad una pratica che è comune nella manutenzione di c. elegans. Si tratta di taglio di una sezione della piastra di agar NGM che contiene worm e trasferendo questo pezzo su un piatto nuovo, trasferendo così anche un gran numero di vermi nel processo. Contaminazione può anche essere tagliato fuori il piatto in questo modo. Quando la raccolta vermi, è importante mantenere l'integrità dell'agar perché vermi possono essere perso in fori nell'agar. Inoltre, è importante consentire il prelievo si raffreddi prima di toccare la piastra per evitare che l'agar di fusione o bruciare i vermi.

1. Al fine di trasferire rapidamente grandi quantità di vermi sulle nuove piastre, tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati utilizzando una spatola. Rimuovere il pezzo tagliato e appoggiarlo sul bordo del prato di OP50 su un piatto nuovo.
2. Trasferimento worm singolarmente, come descritto di seguito nel passaggio di protocollo 8.2, " analisi di sopravvivenza, " usando un verme pick. Fiamma il filo nel verme prendere fino a quando è rosso. Rimuoverlo dal fuoco e lasciarla raffreddare per pochi secondi.
3. Utilizzando il filo nel prelievo, raschiare delicatamente il prato della cultura OP50 coltivata sulla nuova piastra, che copre il filo nel prelievo.
4. La cultura viscosa che copre la punta del filo rende worm bastone fino alla punta del plettro, così delicatamente raccogliere vermi selezionati usando un movimento swiping.
5. Una volta selezionati vermi sono raccolte, metterli su un piatto nuovo scorrendo delicatamente coltura agar. Posizionare il filo in fiamma per rimuovere cultura rimanente nel prelievo.

6. Preparazione di uova

1. posto circa 20 animali adulti (circa 2-3 giorni dopo la schiusa, quando coltivate a 20 ° C) da prelievo o suddivisione in blocchi come descritto nel protocollo passaggio 5, " Chunking e Picking worm, " su un piatto seminato con 50 µ L di e. coli ceppo, OP50.
2. Per raccogliere le uova, inondare la piastra con 10 mL di buffer di M9 dopo 1-2 giorni. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, turbolenza e agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar a rilasciare le uova attaccate alla OP50 o animali adulti. Raccogliere tutto il liquido che contiene le uova e gli adulti.
Tubo di
3. trasferire M9 e OP50 soluzione in un 15 mL conico. Centrifugare la provetta conica da 15 mL a 2.100 x g per 2 min.
4. Aspirare circa 9 mL di surnatante senza disturbare il pellet OP50.
5. Risospendere il pellet in 2 mL di acqua sterile, 1 mL di candeggina e 1 mL di NaOH di 0.25 M.
6. Mescolare delicatamente capovolgendo fino a quando la maggioranza (circa il 70 per cento) di animali adulti appaiono lisata; in genere, le uova rimangono intatte durante questo trattamento breve candeggina a causa delle loro coperture. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per 2 min.
7. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 mL di buffer di M9.
8. Centrifugare la provetta conica in 990 x g per 2 min. aspirare il surnatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con 200 µ l di tampone di M9.
   Nota: Preparazione uovo può richiedere prove multiple. Le uova possono essere distrutte se sono esposti per candeggiare per troppo tempo. Se non si schiudono le uova, o diminuire la concentrazione di candeggina in soluzione o diminuire la durata dell'esposizione alla candeggina.

7. Set-up piatto infezione

1. dispensare 3-5 mL di YPD in una provetta sterile e inoculare esso con una singola colonia di Candida albicans con un'ansa sterile.
   1. Posizionare il tubo su un tamburo rotatorio per circa 16-18 h a 30 ° C.
2. Etichetta uno 1,5 mL microfuge tubo per contenere i albicans del c. e un altro per contenere OP50. Registrare il peso di ogni provetta vuota.
   1. Posto 500 µ l del pernottamento albicans del c. cultura nella provetta etichettata albicans del c. e 1.500 µ l della cultura OP50 durante la notte (dal punto 3.1) nella provetta etichettata OP50.
   2. Centrifuga per 10 min a 16.100 x aspirare il surnatante g. senza pellet inquietante.
   3. Ri-sospendere ogni pallina con 500 µ l di acqua sterile. Centrifugare per 5 min 16.100 x g.
   4. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Registrare il peso finale dei tubi del microfuge.
   5. Determinare il peso di ogni pallina sottraendo il peso iniziale dei tubi dal peso finale del microfuge.
3. Con acqua sterile, risospendere il pellet di albicans del c. a 10 mg/mL e il pellet OP50 a 200 mg/mL. Rendere un'infezione master mix combinando 10 µ l di una soluzione di 50 mg/mL di streptomicina, 2,5 µ l di cultura OP50, 0,5 µ l di albicans del c. cultura e 7 µ l di acqua sterile.
   1. Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta.
      Nota: Circa 100 vermi sono necessari per determinare la significatività statistica durante l'analisi. Questo test viene in genere eseguito in triplice copia. Così, un 3.2 x mix infezione nonché un 3.2 x soluzione di controllo è fatto. Queste miscele sono fatte per essere leggermente oltre 3 volte l'originale per garantire che un pieno 20 µ l è seminato in ogni piatto, lasciando spazio per l'errore. Questo mix master è creato perché la faringe del worm è troppo piccola durante le fasi iniziali di larvale (L1-L3) a consumare c. albicans. Per l'esposizione agli agenti farmacologici quali fluconazolo ( Figura 3B), l'agente è stato introdotto per la miscela di infezione. La concentrazione dell'agente è determinata empiricamente. Ad esempio, in Figura 3B, 50 µM Fluconazole è rappresentata, tuttavia 0, 12,5, 25, 50 e 100 µM Fluconazole erano anche testato usando lo stesso protocollo.

8. Analisi del fenotipo di regione anale deformato (Dar) e analisi di sopravvivenza

1. Visualize il fenotipo di Dar
   Nota: Dar meglio viene visualizzato nella fase L3 e oltre. Dar si presenta come una piccola sporgenza della regione anale post del worm ( Figura 2A), che diventa più evidente nel corso del tempo.
   1. Conferma se un animale ha Dar rapidamente toccando la piastra sul palco del microscopio di dissezione; animali senza Dar volontà spostare all'indietro immediatamente, mentre gli animali con il Dar che verranno sia bisogno ripetuti giri di maschiatura per invertire la loro direzione, o non farlo affatto.
2. Analisi di sopravvivenza
   1. preparazione completa uovo come precedentemente descritto nel protocollo passaggio 6, " uovo preparazione ". Contare le uova nell'ambito di dissezione e diluire la soluzione di uovo con M9 finché non si ottiene una concentrazione di circa 5-6 uova sane per µ l. Usando una pipetta, dispensare 20 µ l di campione contenente circa 30 uova sul piatto preparato di NGM, nella zona tra la coltura batterica e il lato della piastra (uova e vite senza fine alimentare, OP50, sono in due punti distinti).
   2. Piastre Incubate a 20 ° C per 48 h. Sotto un microscopio di dissezione, contare il numero di vermi vivi e morti adulti su ogni piatto, così come il numero di vermi con Dar. Registrare la percentuale con Dar.
   3. Considera un animale morto, se non risponde di essere sfruttato sulla testa di un filo di alluminio o toccando la piastra.
   4. Ogni altro giorno, trasferire i vermi adulti restanti scegliendo come descritto nel protocollo passaggio 5, " Chunking e Picking worm, " su un piatto di infezione o controllo di nuovo. A questo punto, se necessario, eseguire un'analisi di sopravvivenza di rilevamento del numero di vermi dal vivo, morti e mancante ogni giorno.
      Nota: Questo test può eseguire per due settimane, cominciando con preparazione di uova. Inoltre, la soluzione di uovo non dovrebbe essere erogata sulla cultura batterica, come la soluzione può contenere tracce di candeggina che può uccidere il OP50. La soluzione dovrebbe essere erogato circa 0,5 cm dal bordo della piastra, come le uova possono restare bloccate tra i lati della piastra e l'agar. Inoltre, a causa della rapida proliferazione di vermi, trasferendo gli adulti sulle nuove piastre è fondamentale per separarli dalla loro progenie.
3. Analizzare sopravvivenza
   1. analizzare risultati utilizzando software di analisi di sopravvivenza curva (vedere elenco dei materiali).
   Curve di
   2. Confronta sopravvivenza utilizzando il metodo Grehan-Breslow-Wilcoxon (supponendo che i dati dai primi tempi di sopravvivenza sono più accurati di epoche successive, peso di conseguenza i dati) così come di strumenti statistici di Logrank ⁴⁵.
      Nota: Ad esempio, in Figura 4B -C, la sopravvivenza di vermi trattati con mutante c. albicans è rispetto a quelli trattati con isogeni selvaggio-tipo controlli o complementarystrains.

Risultati

Un'analisi di patogenesi (Figura 1) usando i albicans del c. e c. elegans precedentemente è stato descritto dal nostro laboratorio^17,18 e altri laboratori^19,20. Dimostriamo la disponibilità dell'utilizzo di c. elegans per studiare la virulenza di albicans del c. mostrando che le cellule di c. albicans<...

Discussione

I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade)	Apex BioResearch Products	20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)	Genesee Scientific	59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope	Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone	Fisher BioReagants	BP1420-500
C. elegans strain Bli-3	Caenorhabditis Genetics Center	Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%	Sigma	C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)	FIsherBrand	14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)	Nikon Instrument Inc.
E. coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)	GraphPad Software
LB Broth (Miller's)	Apex BioResearch Products	11-120
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)	Falcon	353001
Potassium Phosphate monobasic	Sigma	P0662-500G
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314	ATCC	SC5314
Wildtype C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center	N2