נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

Summary

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

Abstract

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Introduction

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi¹, רוברט הורביץ, ג'ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-^2,-^3,-⁴, מרטין צ'לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק⁵. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens^6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים^11,זה אורגניזם מודל¹². בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר^11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica¹⁴, שיגלה boydii¹⁵או ויבריו כולרה¹⁶.

כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה⁴².

במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות^43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans - מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

Protocol

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM)

1. עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר' נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל'. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים.
   1. הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדיה צריך להיות בלוק עבור יותר אם נפח גבוה יותר עשוי.
2. להגדיר את המדיה בצלחת מערבבים ולאחר להתקרר.
   1. לאחר מדיה חם למגע (כ 60 ° C) גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO ₄ ● H ₂ O, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl ₂, 25 מ של KPO ₄ ו- 1 מ"ל של 0.5% כולסטרול באתנול.
   2. שופכים מדיה (ידנית או על ידי משאבת אוטומטית) תחת זרימה שכבתית לתוך 35 מ"מ x 10 מ"מ עקר פטרי. אפשר להתייבש תחת מכסה המנוע של 1-2 ימים לפני השימוש.
      הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C כדי למנוע זיהום.

2. ביצוע של תולעת לבחור

1. לחתוך חתיכה 1.5 ס מ של חוט אלומיניום. בזהירות להוסיף כ 0.5 ס מ באורך הזה לתוך קצה פיפטה פסטר.
   1. באמצעות מבער בונזן או אלכוהול המנורה, להמיס את הטיפ פיפטה מזכוכית ידי סובבים לאיטם זה ב הלהבה עד הכבל הוא מאובטח דבקה הפיפטה מבלי להתפשר על הצורה המקורית של קצה פיפטה.

3. הכנה של e. coli תרבות

1. באמצעות לולאה סטרילי, לחסן שמושבה בודדת של e. coli זן OP50 ב 200 מ ל מרק לוריא. דגירה בין לילה ברעידות-37 מעלות צלזיוס.
2. התרבות נוזלי מוכן לשימוש ביום המחרת, ניתן לאחסן ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.
   הערה: המתח e. coli, OP50, משמש כמקור מזון עבור C. elegans. תרבות זו עשוי לשמש עד כמה חודשים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס

4. חיוני C. elegans תחזוקה

1. זרע שהכין NGM פלטות אגר עם e. coli אכון כ 50-100 µL של תרבות נוזלי מוכן OP50 במרכז הצלחת.
2. מכסה צלחות, לאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לאחר יבש, במקום צלחות בגיל 37 ° C בלילה לצמיחה מהירה או לשמור בטמפרטורת החדר, אם צמיחה איטית יותר רצוי.
3. להוסיף תולעים לצלחת על-ידי " chunking, " (ראה פרוטוקול שלב 5 " Chunking ותולעים איסוף "), אוסף תולעים בנפרד או הצבת ביצי התולעת ישירות לצלחת (ראה פרוטוקול שלב 6 " ביצה הכנה ").

5. Chunking ותולעים איסוף

הערה: " Chunking, " מתייחס שיטה אשר נפוץ ב- C. elegans תחזוקה. זה כרוך חיתוך מקטע של צלחת אגר NGM המכיל תולעים, מעביר את החתיכה הזאת על גבי צלחת חדשה, וכך גם העברת כמות גדולה של תולעים בתהליך. הזיהום עשוי גם לגזור את הצלחת באופן זה. כאשר בוחרים תולעים, חשוב לשמור על היושרה של אגר כי תולעים יכולים ללכת לאיבוד בתוך חורים אגר. בנוסף, חשוב לאפשר האיסוף להתקרר, לפני שתיגע הלוח כדי למנוע התכה של אגר. או לשרוף את התולעים.

1. על מנת להעביר במהירות כמויות גדולות של תולעים על גבי לוחיות הרישוי, לחתוך חתיכה של אגר NGM המכיל את התולעים שנבחר בעזרת מרית. להסיר את החלק הגזור ולמקם אותו הפרצוף למטה בקצה הדשא של OP50 על צלחת חדשה.
2. העברת תולעים בנפרד כמתואר להלן פרוטוקול שלב 8.2, " Assay הישרדות, " באמצעות תולעת לבחור. להבה החוט של התולעת לבחור עד שזה אדום. להסיר אותה הלהבה ולאפשר לו להתקרר למשך כמה שניות.
3. בעדינות באמצעות הכבל על האיסוף, לגרד את הדשא של התרבות OP50 גדל על הלוח החדש, המכסים את החוט על האיסוף.
4. התרבות צמיגה המכסים את קצה החוט גורם תולעים לדבוק קצה האיסוף, ובכך בעדינות להרים תולעים שנבחר באמצעות תנועה swiping.
5. ברגע שנבחר תולעים אסופים, למקם אותם על צלחת חדשה על-ידי העברת בעדינות תרבות מעבר אגר. מניחים את החוט הלהבה כדי להסיר הנותרים תרבות על האיסוף.

6. ביצה הכנה

1. במקום כ 20 למבוגרים בעלי חיים (כ 2-3 ימים לאחר הבקיעה כאשר גדל ב- 20 ° C) על ידי איסוף או chunking כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, " Chunking ותולעים איסוף, " על צלחת עם 50 µL של e. coli זן, OP50.
2. כדי לאסוף את הביצים, להציף את הצלחת עם 10 מ"ל M9 מאגר לאחר 1-2 ימים. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, מערבולת, בעדינות להתסיס את תוכנו בצלחת אגר לשחרר ביצים תקוע OP50 או חיות למבוגרים. לאסוף את כל הנוזל המכיל ביצים עם מבוגרים.
צינור
3. M9 להעביר פתרון OP50 לתוך חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל-2,100 g x עבור 2 דק
4. האחות כ 9 מ של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר OP50.
5. Resuspend בגדר 2 מיליליטר מים סטריליים, 1 מ"ל של אקונומיקה ו 1 מ"ל של 0.25 M NaOH.
6. לערבב בעדינות על ידי היפוך עד הרוב (כ 70 אחוז) של בעלי חיים למבוגרים מופיעות lysed; בדרך כלל, ביצים נשארים בעינם במהלך טיפול קצר אקונומיקה זה בגלל המעטפת שלהם. Centrifuge צינור חרוטי ב 990 g x עבור 2 דק
7. וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ"ל של מאגר M9.
8. Centrifuge את צינור חרוטי 990 g x עבור 2 דק וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות גלולה עם 200 µL מאגר M9.
   הערה: הכנת ביצה עשויים לדרוש ניסויים מרובים. ביצים עלול להיהרס אם הם נחשפו אקונומיקה יותר מדי זמן. אם לא בוקעות, או להקטין את הריכוז של אקונומיקה בתמיסה או להקטין את משך החשיפה מלבין.

7. הגדרת צלחת זיהום

1. לוותר על 3-5 מ של YPD לתוך מבחנה סטרילית ולא לחסן אותו עם מושבה בודדת של קנדידה אלביקנס באמצעות לולאה סטרילי.
   1. למקם את הצינורית על תוף על כל ההזמנות עבור-16-18 h ב- 30 ° C.
2. תווית 1.5 mL microfuge שפופרת אחת להכיל אלביקנס ג, ועוד אחד להכיל OP50. להקליט את המשקל של כל שפופרת ריק.
   1. 500 המקום µL של הלילה אלביקנס ג תרבות לתוך צינור הנקרא אלביקנס ג ו- 1,500 µL של התרבות OP50 לילה (מתוך שלב 3.1) לתוך הצינור הנקרא OP50.
   2. צנטריפוגה 10 דקות ב 16,100 x ג וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטריד.
   3. מחדש להשעות כל גלולה עם 500 µL של מים סטריליים. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- g x. 16,100
   4. וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להקליט את המשקל הסופי של צינורות microfuge.
   5. לקבוע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של הצינורות microfuge לפי המשקל הסופי.
3. שימוש במים סטריליים, מחדש להשעות בגדר אלביקנס ג ל 10 מ"ג/מ"ל, בגדר OP50 200 מ ג/מ ל. לגרום זיהום ראשי לערבב על ידי שילוב של µL 10 של פתרון 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, 2.5 µL התרבות OP50, 0.5 µL של תרבות אלביקנס ג ו µL 7 מים סטריליים.
   1. עבור לוחות בקרה, ליצור שילוב אב על-ידי החלפת הנפח של תרבות אלביקנס ג במים סטריליים. זרע µL 20 של זיהום ערבוב או OP50 פתרון שליטה על גבי הלוחות מרכז של NGM באמצעות micropipette.
      הערה: תולעים כ-100 נחוצים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית במהלך ניתוח. זה וזמינותו מנוהל בדרך כלל כן. לפיכך, של 3.2 x מיקס זיהום, כמו גם של 3.2 x שליטה פתרון מורכב. תערובות אלה עשויים להיות מעט מעל 3 x המקורי כדי להבטיח כי µL מלא 20 הוא נזרע על כל צלחת, ומאפשר מקום לטעויות. מיקס מאסטר זה נוצר בגלל הלוע של התולעת הוא קטן מדי הזחל הראשונית (L1-L3) לצרוך אלביקנס ג. חשיפה סוכנים תרופתי כגון תהליך הזיקוק ( איור 3B), הסוכן הוא הציג את התערובת זיהום. הריכוז של הסוכן של נקבעת מדעית. לדוגמה, ב- 3B איור, 50 מיקרומטר פלוקונאזול מיוצג, אולם 0, 12.5, 25, 50, 100 מיקרומטר פלוקונאזול היו גם נבדק באמצעות פרוטוקול אותו.

8. ניתוח של פנוטיפ מעוותים אזור אנאלי (Dar) ואת וזמינותו להישרדות

1. Visualize פנוטיפ דאר
   הערה: דאר בצורה הטובה ביותר הוא מדמיין בשלב L3 ומעבר. דאר מציג כמו בליטה קטנה באזור פי הטבעת פוסט של התולעת ( איור 2 א), אשר הופך להיות בולט יותר לאורך זמן.
   1. אשר אם חיה דאר על-ידי הקשה במהירות את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ לנתיחה; בעלי חיים ללא דאר להזיז לאחור באופן מיידי, בעוד בעלי חיים דאר יהיה עליך לחזור על סבבי הקשה להיפוך הכיוון שלהם, או שהם לא יעשה כן בכלל.
2. Assay הישרדות
   1. הכנת ביצה מלאה כאמור שמתואר פרוטוקול בשלב 6, " ביצה הכנה ". לספור את הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, לדלל את הפתרון ביצה עם M9 עד ריכוז של 5-6 ביציות בריאות לכל µL מושגת. באמצעות פיפטה של, לוותר על 20 מדגם µL המכיל כ- 30 ביצים על גבי צלחת NGM מוכן, באזור בין התרבות חיידקי לצד צלחת (ביצים, מזון לתולעים, OP50, נמצאים בשני מקומות נפרדים).
   2. Incubate צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לספור את מספר תולעים מתים מבוגרים וחיים על כל צלחת, כמו גם את המספר של תולעים עם דאר. להקליט את האחוז עם דר.
   3. לשקול חיה מתה, אם זה אינו מגיב שמצותתים על הראש על ידי חוט אלומיניום או הקשה על הצלחת.
   4. כל יום להעביר תולעים בוגרות שנותרו על ידי איסוף כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, " Chunking ותולעים איסוף, " על צלחת זיהום או הפקד החדש. בשלב זה, במידת הצורך, לבצע וזמינותו של הישרדות על-ידי מעקב אחר מספר תולעים בשידור חי, מת, חסר כל יום.
      הערה: assay זו עשויה לפעול במשך שבועיים, החל מהכנת ביצה. בנוסף, הפתרון ביצה צריכה לא לפי ראות עיניך אל התרבות חיידקי, הפתרון עשוי להכיל עקבות של אקונומיקה אשר יכול להרוג את OP50. הפתרון צריך להיות גם לפי ביצים יכול להיות תקוע בין צידי הלוח, אגר כ 0.5 ס מ מהקצה של הצלחת, ראות עיניך. בנוסף, עקב התפשטות מהירה של תולעים, העברת מבוגרים על גבי לוחיות הרישוי הוא קריטי כדי להפריד אותם הצאצאים שלהם.
3. לנתח הישרדות
   1. לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח עקומת הישרדות (עיין רשימת חומרים).
   2. השווה הישרדות עקומות בשיטת Grehan-Breslow-Wilcoxon (בהנחה כי הנתונים מכל הזמנים הישרדות המוקדמים מדויקות יותר מאשר מאוחר יותר פעמים, משקל הנתונים בהתאם) כמו גם כלים סטטיסטיים Logrank ⁴⁵.
      הערה: כך למשל, ב איור 4B -C, ההישרדות של תולעים מטופלים עם מוטציה אלביקנס ג הוא בהשוואה לאלו שטופלו פקדים פראי-סוג isogenic או complementarystrains.

תוצאות

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד^17,שלנו במעבדה¹⁸ ו-^19,אחרים מעבדות²⁰. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג...

Discussion

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade)	Apex BioResearch Products	20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)	Genesee Scientific	59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope	Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone	Fisher BioReagants	BP1420-500
C. elegans strain Bli-3	Caenorhabditis Genetics Center	Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%	Sigma	C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)	FIsherBrand	14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)	Nikon Instrument Inc.
E. coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)	GraphPad Software
LB Broth (Miller's)	Apex BioResearch Products	11-120
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)	Falcon	353001
Potassium Phosphate monobasic	Sigma	P0662-500G
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314	ATCC	SC5314
Wildtype C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center	N2