Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración

Resumen

Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.

Resumen

Las enfermedades neurodegenerativas se asocia frecuentemente a una progresiva pérdida de capacidad de movimiento, menor vida útil y neurodegeneración dependiente de la edad. Para entender el mecanismo de estos celulares eventos y sus relaciones causales con otros, Drosophila melanogaster, con sus sofisticadas herramientas genéticas y características conductuales diversas, se utilizan como modelos de enfermedades para evaluar fenotipos de neurodegenerativas. Aquí describimos un método de alto rendimiento para analizar el comportamiento de adultos geotaxis negativa de Drosophila , como una indicación de posibles defectos motor asociado a la neurodegeneración. Una máquina automatizada es diseñado y desarrollado para sincronización de mosca en coche mediante un impulso eléctrico inicial, más adelante lo que permite la grabación de comportamiento geotaxis negativa en un transcurso de segundos a minutos. Imágenes de la video grabado digitalmente luego son procesadas con el software de RflyDetection diseñado para la manipulación de datos estadísticos. A diferencia del ensayo manualmente controlados geotaxis negativa basado en volar sola, este protocolo precisa, rápida y de alto rendimiento permite la adquisición de datos más que centenares de moscas al mismo tiempo, proporcionando un enfoque eficiente para avanzar en nuestra comprensión en el mecanismo subyacente del aparato locomotor déficit asociado a la neurodegeneración.

Introducción

Una variedad de protocolos y métodos han sido desarrollados para analizar comportamiento de escalada adultos de Drosophila . Bastante laborioso, el análisis tradicional sobre todo poner una sola mosca en un frasco individual y utiliza una fuerza manual para moscas abajo de sincronización^1,2,3,4. Es tedioso y lento, inadecuado para grandes estudios de alto rendimiento y tiene posibles variaciones de la fuerza manual utilizada para golpear ligeramente las moscas así como otras limitaciones. Para mejorar el análisis, se desarrolló un ensayo rápido iterativo Geotaxis negativa (anillo) que permite el análisis de alto rendimiento en numerosas moscas en el mismo tiempo⁵. Sin embargo, el ensayo requiere todavía una fuerza ejercer manualmente para sincronizar la acción de volar. Nuestra versión de la prueba de anillo, revisada en el ensayo anterior, incluye una base metálica que aloja múltiples frascos que contienen la mosca controlados automáticamente por un motor eléctrico para conducir sincronización mosca⁶. A grabación, la mosca sube inmediatamente después de sincronización se graba entonces analizado usando un software de diseño propio. Nuestro análisis automatizado del anillo ha eliminado el proceso tedioso y requiere mucho trabajo en la recogida de datos de una sola mosca, uno a la vez y permitió el proceso de adquisición de datos ser más eficientes. Además, se ha empleado el análisis automatizado del anillo en un número de estudios para aclarar el mecanismo subyacente enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, validar el enfoque con eficacia alta^7,8,9 .

En este artículo, se demuestra el ensayo de anillo automatizado usando el DDC-Gal4 impulsado por moscas de RNAi. DDC-Gal4 es una línea de Gal4 expresando específicamente en dopaminérgicas (DA) y de neuronas serotoninérgicas, lo que representa una gran herramienta para el análisis de los efectos de gen de destino asociados a déficit locomotor acompañando a neurodegeneración¹⁰. Además, incorporamos Dicer2 UAS, una línea de mosca que mejora la eficacia de ARNi, para generar el UAS-Dicer2; DDC-Gal4 línea de la herramienta. Las moscas de RNAi que decide usar es auxilin (aux) v16182 de RNAi (auxR¹⁶¹⁸²), un gen que previamente hemos identificado para exhibir un efecto de volar locomotor actividad⁸. auxGFP moscas también están preparados para analizar los efectos sobre la sobreexpresión de aux . Mostraremos cómo utilizar el análisis automatizado de anillo para medir fly geotaxis negativos, presentar los resultados y discutir cualquier implicación de los resultados.

Protocolo

1. colección de la mosca

1. mantener las moscas en la comida mosca estándar a 25 ° C, humedad 70% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
2. Recoger UAS-Dicer2; DDC-GAL4 volar virginsunder anestesia de dióxido de carbono (CO ₂).
3. Cruz estas vírgenes a las moscas macho adulto 2 días de edad con los siguientes genotipos: UAS-mCD8GFP (control), auxR ¹⁶¹⁸² (aux ARNi) auxGFP (sobreexpresión de aux), y auxR ¹⁶¹⁸²; auxGFP (de rescate), con un varón: cociente femenino de 1:2.
4. Por separado recientemente recoger eclosed machos y hembras en 3 frascos para cada grupo por experimento, colocando 10 moscas en cada frasco mosca regular con alimentos estándar a 25 ° C.
5. Según el experimento, mantenga la recogida vuela hasta 35 días y utilizarlos para el análisis automatizado de anillo en el día 5, 15, 25 y 35.

2. Automatizado de ensayo de anillo

1. transferencia 10 moscas (unisex) recogidos por genotipo en cada frasco, luego fije el frasco con un tornillo. Analizar el control de moscas y moscas llevar diferentes genotipos para cada conjunto de experimentos (hasta 10 simultáneamente, frascos 10 moscas en cada frasco).
2. Encender la cámara digital situada en frente del aparato, e inicie la grabación una vez moscas es todo cargado y listo.
3. Después de permitir 1 minuto para moscas en frascos, encienda el regulador de paso que controla el conductor paso; esto conduce el pequeño motor eléctrico para el control de la palanca para que consecutivamente se levanta y golpea el aparato 4 veces en 2 s. Vea la figura 1.
   1. Después de golpear ligeramente, tenga en cuenta que las moscas comienzan a ascender a la pared. Asegurarse de que grabación.
4. Repita la sincronización como se describe en el paso 2.3 intervalo 60-s en ensayos consecutivos de 3 a 5.
5. Repetir el experimento para 5, 15, 25 y 35 días de edad moscas. Realizar al menos 3 experimentos independientes para cada grupo, cada experimento con al menos 30 recogidos vuela (3 frascos).

3. Análisis de datos

1. importar el vídeo grabado en el ordenador.
2. Tomar una instantánea del vídeo en 6 s después de golpear ligeramente, para cada juicio.
3. Importar la imagen instantánea en el software de RflyDetection (ver figura 2), usando el ' archivo ' menú.
4. Establecer las líneas de base superiores e inferiores del frasco, precisamente usando el icono de referencia en la barra de herramientas y luego utilizando el cursor para marcar las líneas de base superiores e inferiores en la imagen.
5. De entrada el número de moscas por frasco (p. ej., 10 aquí) en el ' vuela en rect ' campo y vial longitud (p. ej., 14 cm aquí) en el ' altura tubo ' campo dentro de la barra de opciones.
   1. Nota que las posiciones individuales de la mosca son detectadas y marcadas con puntos sobre la pantalla para cada frasco de.
      Nota: La figura 2 indica las posiciones de los clics de botón de menú.
6. Nota que el software automáticamente determina la distancia escalada para cada mosca y muestra los valores promedio de 10 moscas en cada frasco en una tabla en el panel derecho. (Ver figura 2)
7. El número sube con programas estadísticos (por ejemplo, prisma) para su posterior análisis estadístico del proceso.
8. Presente los datos como promedio ± SEM.
9. Calcular la p-valores de importancia (señalados con asteriscos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) con una vía ANOVA Bonferroni test de comparación múltiple

Resultados

Este artículo muestra el uso de un ensayo de anillo automatizado en la evaluación de comportamiento mosca geotaxis negativa. A diferencia del anterior ensayo de anillo, nuestro análisis incluyen un aparato automatizado que proporciona una fuerza eléctrica para sincronizar la acción de moscas y analiza cientos de moscas al mismo tiempo (figura 1). Análisis de Dicer2; DDC > auxR¹⁶¹⁸² moscas demostraron una disminución dependiente...

Discusión

El análisis automatizado de anillo descrito aquí permite un análisis de alto rendimiento del comportamiento de la mosca geotaxis negativa por cientos de moscas al mismo tiempo. Previamente las estrategias existentes para el análisis de escalada adulto implican observaciones de una sola mosca en un frasco individual y posición de volar manualmente es detectado por el ojo. Este proceso algo tedioso a veces puede causar mala interpretación o mala interpretación de los datos, así como trabajos que requieren mucho tra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang