Neurodegeneration의 초파리 모델에서 성인 등반 동작을 분석 하기 위한 자동화 된 신속한 반복 부정적인 Geotaxis 분석 결과

요약

이 단계별 프로토콜 파리의 수백을 접대 하 고 전기 모터에 의해 그들의 행동을 동기화 하는 자동화 된 멀티 실린더 시스템을 사용 하 여 초파리 부정적인 geotaxis 동작을 분석 합니다. 동기화 시 디지털 기록 및 자체 디자인된 RflyDetection 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된 비행 부정적인 geotaxis 동작 분석입니다.

초록

신경 퇴행 성 질환 운동 능력, 감소 된 수명, 및 연령에 따라 neurodegeneration의 진보적인 손실에 자주 연관 된다. 이러한 세포의 메커니즘을 이해 하 이벤트, 그리고 그들의 인과 관계 서로, 초파리 melanogaster, 정교한 유전자 도구와 다양 한 행동 기능으로 사용 된다 질병 모델 평가 신경 고기입니다. 여기는 초파리 성인 부정적인 geotaxis 행동, neurodegeneration와 관련 된 가능한 모터 결함에 대 한 표시로 분석 하는 높은 처리량 방법에 설명 합니다. 자동화 기계 설계 및 드라이브 플라이 동기화 나중 초 분에 걸쳐 부정적인 geotaxis 행동의 녹음 수 있도록 초기 전기 전류를 사용 하 여 개발 되었습니다. 디지털 녹화 된 비디오에서 이미지 다음 통계 데이터 조작에 대 한 자체 설계 RflyDetection 소프트웨어와 함께 처리 됩니다. 다른 하나의 비행에 따라 수동으로 제어 부정적인 geotaxis 분석 결과,이, 빠르고, 정확 하 고 높은 처리량 프로토콜을 사용 하 데이터 수집에서 더 많은 파리의 수백 보다 동시에, 사전에 효율적인 접근 방식을 제공 하 우리 운전 적자 neurodegeneration 연관의 기본 메커니즘을 이해.

서문

다양 한 프로토콜 및 방법 초파리 성인 등반 동작의 분석을 위해 개발 되었습니다. 오히려 힘 드는 전통적인 분석 주로 개별 유리병에 넣어 하나의 비행을 포함를 사용 하 수동 힘 동기화^1,2,3,4내려 파리를 누릅니다. 지루한 및 시간이 걸리는, 큰 높은 처리량 연구에 대 한 부적 절 한 이며 다른 제한 뿐만 아니라 파리 다운 탭을 사용 하는 수동 힘의 잠재적인 변이 있다. 분석 결과 개선 하기 위해, 급속 한 반복 부정적인 Geotaxis (반지) 분석 결과 수많은 파리 같은 시간⁵이상의 높은 처리량 분석을 수 있는 개발 되었다. 그러나, 분석 결과 여전히 비행 행동을 동기화를 수동으로 exerting 힘을 요구 한다. 이전 분석 결과 따라 수정 반지 분석 결과의 우리의 버전 포함 금속 기지 비행 동기화⁶를 전기 모터에 의해 자동으로 제어 하는 여러 비행 포함 하 튜브를 호스팅. 녹음 시 즉시 동기화 다음 기록 후 즉시 등반 자체 설계 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 우리의 자동화 된 반지 분석 결과 지루하고 노동 집약 과정에서 한 번에 하나씩 단일 비행 데이터 수집에 제거 하 고 더 효율적으로 데이터 수집 프로세스를 활성화. 또한, 자동된 링 분석 결과 메커니즘 기본 Alzheimer를 명료 하 게 하는 연구와 파 킨 슨 병, 고효율^{7,8,9 접근 유효성 검사의 수에 고용은} .

이 문서에서 자동된 링 분석 결과를 DDC Gal4 RNAi 파리 구동을 사용 하 여 보여 줍니다. DDC Gal4 따라서 neurodegeneration¹⁰동반 운전 적자와 관련 된 타겟 유전자 효과 분석 하기 위한 훌륭한 도구를 나타내는 dopaminergic (다)와 serotonergic 신경, 특히 표현 Gal4 라인입니다. 또한, 우리 통합 UAS-Dicer2, RNAi 효율성, UAS-Dicer2; 를 생성을 향상 플라이 라인 DDC Gal4 라인 도구. 우리가 사용 하도록 선택 하는 RNAi 파리는 auxilin (보조) RNAi v16182 (auxR¹⁶¹⁸²), 우리가 이전에 효과 전시 하기 위하여 확인 하는 유전자 비행 운동 활동⁸. auxGFP 파리는 또한 보조 overexpression 시 효과 분석에 대 한 준비. 우리는 비행 부정적인 geotaxis 측정, 결과, 결과에서 얻은 어떤 의미를 토론 하 자동된 링 분석 결과 사용 하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 비행 컬렉션

1. 25 ° C, 습도 70%, 그리고 12 h/12 h 명암 주기에서 표준 비행 거리 음식에 파리를 유지.
2. 수집 UAS-Dicer2; DDC GAL4 비행 virginsunder 이산화탄소 (CO ₂) 마 취.
3. 2 일 오래 된 성인 남성 파리 다음 genotypes을 들고 하이 처녀 크로스: UAS-mCD8GFP (제어), auxR ¹⁶¹⁸² (aux RNAi) auxGFP (보조 overexpression), 그리고 auxR ¹⁶¹⁸²; auxGFP (구조), 남자와 함께: 1: 2의 여성 비율.
4. 별도로 수집 새로 eclosed 남성 및 여성 25 표준 음식 각 일반 비행 유리병에서 10 파리 배치 실험, 당 각 그룹에 대 한 3 튜브에서 ° c.
5. 실험, 유지는 수집된 최대 35 일 파리와 하루 5, 15, 25, 35에서 자동된 링 분석에 대 한 그들을 사용.

2. 반지 분석 결과 자동

1. 전송 10 각 유전자 형 당 수집된 파리 (남녀 공통) 유리병, 다음 나사와 유리병을 확보. 제어 파리와 함께 실험의 각 집합에 대 한 다른 genotypes을 들고 파리를 분석 (최대 10 리 바이 알, 동시에 각 유리병에 10 파리).
2. 디지털 카메라 장치, 앞에 설정 하 고 파리 한 번 녹음 시작은 모두 로드 하 고 준비.
3. 허용 튜브에 정착 파리에 대 일 분, 후 단계 드라이버를 제어 하는 단계 컨트롤러 설정;이 연속적으로 상승 하 고 4 회 2에서에서 장치 탭을 연결 된 레버를 제어 하는 작은 전기 모터 드라이브 s. 그림 1을 참조 하십시오.
   1. 도청, 후 파리 벽 승천을 시작 하는 것을 참고. 계속 녹음.
4. 2.3에서 60의 간격 3 ~ 5 연속 재판 단계에서 설명한 대로 동기화 반복.
5. 5, 15, 25, 그리고 35 일 된 파리에 대 한 실험을 반복합니다. 각 그룹에 대 한 적어도 3 독립적인 실험, 적어도 30 수집 된 각 실험 (3 병) 난다.

3. 데이터 분석

1. 컴퓨터에 녹화 된 비디오를 가져올.
2. 6 비디오의 스냅샷을 각 재판에 대 한 감청 후 s.
3. RflyDetection 소프트웨어에 스냅숏 이미지를 가져오는 ( 그림 2 참조)를 사용 하는 ' 파일 ' 메뉴.
4. 도구 모음에서 기본 아이콘을 사용 하 여 다음 이미지에 위와 더 낮은 베이스 라인을 표시 하는 커서를 사용 하 여 정확 하 게는 유리병의 위와 더 낮은 베이스 라인을 설정.
5. 에 유리병 (예를 들어, 여기에 10) 당 파리의 수를 입력은 ' rect에 Flys ' 필드와 유리병 길이 (예를 들어, 여기에 14 cm)에 ' 튜브 높이 ' 설정 표시줄에 필드.
   1. 개별 비행 위치 검색 하 고 각 유리병에 대 한 화면에 표시 됩니다.
      참고: 그림 2는 모든 메뉴 단추 클릭의 위치를 나타냅니다.
6. 소프트웨어 자동으로 각 비행에 대 한 등반 거리를 결정 하 고 오른쪽 패널에 테이블에 각 유리병에 10 파리에서 평균된 값을 표시 합니다. ( 그림 2 참조)
7. 추가 통계 분석을 위해 통계 소프트웨어 (예를 들어, 프리즘) 등반 수 처리.
8. 현재 데이터 의미 ± SEM.
9. P 계산-의미의 값 (별표로 표시 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001)를 사용 하 여 단방향 ANOVA Bonferroni 여러 비교 테스트

결과

이 기사는 비행 부정적인 geotaxis 행동 평가에서 자동된 링 분석 결과의 사용을 보여줍니다. 이전 반지 분석 결과는 달리 우리의 분석 결과 동시에 비행 행동을 동기화 하는 전기 힘을 제공 하 고 파리의 수백까지 분석 하는 자동된 장치 포함 (그림 1). Dicer2;의 분석 DDC > auxR¹⁶¹⁸² DA 뉴런에 보조 식 비행 운동 활동에 대 한 중요 한...

토론

여기에 설명 된 자동된 링 분석 결과 동시에 파리의 수백에 대 한 비행 부정적인 geotaxis 동작의 높은 처리량 분석을 수 있습니다. 이전 성인 등반을 분석 하기 위한 기존 전략 개별 유리병에 하나의 비행의 관측을 포함 하 고 비행 위치 수동으로 눈에 의해 감지. 이 오히려 지루한 과정 잘못 또는 노동 집약 일 뿐만 아니라 데이터의 오해에 때로는 발생할 수 있습니다. 우리의 자동화 된 반지 분석 결...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang