Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração

Resumo

Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

Resumo

Doenças neurodegenerativas são frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento, esperança de vida reduzida e neurodegeneração idade-dependente. Para entender o mecanismo celular esses eventos e suas relações causais com o outro, Drosophila melanogaster, com as suas sofisticadas ferramentas de genéticas e diversas características comportamentais, são usadas como modelos de doença para avaliar neurodegenerativas fenótipos. Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para analisar o comportamento de adultos geotaxis negativo de Drosophila , como uma indicação para possíveis defeitos motor associado a neurodegeneração. Uma máquina automatizada é projetada e desenvolvida para sincronização de mosca de unidade usando um impulso elétrico inicial, mais tarde, permitindo a gravação de comportamento negativo geotaxis sobre um curso de segundos a minutos. Imagens do vídeo digitalmente gravado então são processadas com o software RflyDetection concebido para manipulação de dados estatísticos. Diferente do ensaio geotaxis negativo manualmente controlado com base em uma única mosca, este protocolo preciso, rápido e alta produtividade permite a aquisição de dados de mais do que centenas de moscas simultaneamente, proporcionando uma abordagem eficiente para avançar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de locomoção déficits associados a neurodegeneração.

Introdução

Uma variedade de protocolos e métodos foram desenvolvidos para analisar o comportamento de escalada adulto de Drosophila . Um pouco trabalhosa, a análise tradicional principalmente envolve a colocação de uma única mosca dentro de um frasco de individual e usa uma força manual para tocar voa para baixo para a sincronização^1,2,3,4. É tedioso e demorado, impróprios para grandes estudos de alta produtividade e tem potenciais variações da força manual usado para bater para baixo as moscas, bem como outras limitações. Para melhorar o ensaio, um ensaio rápido iterativo negativo Geotaxis (anel) foi desenvolvido, que permite alta produtividade análise sobre numerosas moscas no mesmo tempo⁵. No entanto, o ensaio ainda requer uma força exercer manualmente para sincronizar a voar para ação. Nossa versão do ensaio do anel, revisado com o ensaio anterior, inclui uma base de metal Hospedagem de vários frascos contendo mosca controlados automaticamente por um motor elétrico para conduzir a sincronização voar⁶. Após a gravação, a mosca subindo imediatamente após a sincronização é gravada então analisados usando um software concebido. Nosso ensaio de anel automatizado eliminou o processo tedioso e trabalho intensivo em coletar dados de uma única mosca, um de cada vez e habilitado para o processo de aquisição de dados para ser mais eficiente. Além disso, o ensaio automatizado do anel tem sido empregado em uma série de estudos para elucidar a mecanismo subjacente a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, validando a abordagem com alta eficiência^7,8,9 .

Neste artigo, vamos demonstrar o ensaio automatizado de anel usando o DDC-Gal4 conduzido RNAi moscas. DDC-Gal4 é uma linha de Gal4 especificamente expressando em dopaminérgico (DA) e neurônios serotoninérgicos, representando assim uma ótima ferramenta para analisar os efeitos do gene alvo associados com déficits locomotoras neurodegeneração¹⁰de acompanhamento. Além disso, incorporamos UAS-Dicer2, uma linha de mosca que aumenta a eficiência de RNAi, para gerar o UAS-Dicer2; DDC-Gal4 ferramenta linha. As moscas de RNAi escolhemos usar é o auxilin (aux), v16182 de RNAi (auxR¹⁶¹⁸²), um gene que anteriormente identificamos para expor um efeito na atividade locomotora⁸de voar. auxGFP moscas também são preparadas para analisar os efeitos sobre a superexpressão de aux . Vamos mostrar como usar o ensaio automatizado do anel para medir mosca geotaxis negativa, apresentar os resultados e discutir quaisquer implicações que adquiriu a partir dos resultados.

Protocolo

1. coleção voar

1. manter as moscas no padrão alimentar de voar em 25 ° C, umidade de 70% e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
2. Recolher UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder voar de dióxido de carbono (CO ₂) anestesia.
3. Atravessar estas virgens para 2 dias de idade moscas machos adultas carregando os seguintes genótipos: UAS-mCD8GFP (controle), auxR ¹⁶¹⁸² (aux RNAi) auxGFP (aux superexpressão), e auxR ¹⁶¹⁸²; auxGFP (rescue), com um macho: fêmea relação de 1:2.
4. Em separado recentemente coletar eclosed machos e fêmeas em 3 frascos para cada grupo, por experiência, colocando 10 moscas em cada frasco de mosca regular com padrão alimentar em 25 ° C.
5. Dependendo do experimento, mantenha o coletados voa até 35 dias e usá-los para análise automatizada de anel no dia 5, 15, 25 e 35.

2. Automatizado do ensaio do anel

1. transferir 10 moscas coletadas (unisex) por genótipo em cada frasco, em seguida, fixe o frasco com um parafuso. Analisar o controle de moscas e moscas carregando diferentes genótipos juntos para cada conjunto de experimentos (até 10 frascos simultaneamente, 10 moscas em cada frasco).
2. Ligar a câmera digital colocada na frente do aparelho, e começar a gravar uma vez moscas está carregados e prontos.
3. Após permitir 1 min para moscas instalar-se em frascos, ligue o controlador de passo que controla o driver passo; isto conduz o pequeno motor elétrico para controlar a alavanca anexada para que consecutivamente sobe e torneiras do aparelho 4 vezes em 2 s. Veja a Figura 1.
   1. Após a batida, note que as moscas começam a subir a parede. Certifique-se de que a gravação continua.
4. Repita a sincronização conforme descrito na etapa 2.3 em intervalo de 60-s para ensaios consecutivos de 3 a 5.
5. Repetir o experimento para 5, 15, 25 e 35 dias de idade moscas. Realizar pelo menos 3 experimentos independentes para cada grupo, cada experimento pelo menos 30 coletados voa (3 frascos).

3. Análise de dados

1. importar o vídeo gravado para o computador.
2. Tirar um instantâneo do vídeo em 6 s depois da batida, para cada julgamento.
3. Importar a imagem do instantâneo para o software RflyDetection (ver Figura 2), usando o ' arquivo ' menu.
4. Definir as linhas de base superiores e inferiores do frasco precisamente por usando o ícone de linha de base na barra de ferramentas e, em seguida, usando o cursor para marcar as linhas de base superiores e inferiores da imagem.
5. o número de moscas por frasco (por exemplo, aqui 10) de entrada no ' Flys em rect ' campo e frasco de comprimento (por exemplo, 14cm aqui) no ' tubo altura ' campo dentro da barra de configurações.
   1. Nota que as posições individuais de mosca são detectadas e rotuladas com pontos na tela para cada frasco.
      Nota: A Figura 2 indica as posições de todos os cliques de botão de menu.
6. Nota que o software automaticamente determina a distância escalada para cada mosca e exibe os valores em média de 10 moscas em cada frasco em uma tabela no painel da direita. (Ver Figura 2)
7. Processo, o número de escalada com software estatístico (por exemplo, prisma) para posterior análise estatística.
8. Presente os dados como média ± SEM.
9. Calcular o p-valores de importância (indicados com asteriscos, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001) usando ANOVA One-Way com Bonferroni teste de comparação múltipla

Resultados

Este artigo demonstra o uso de um ensaio de anel automatizado em avaliar o comportamento de voar geotaxis negativo. Ao contrário o ensaio anterior do anel, nosso ensaio inclui um aparelho automatizado que fornece uma força elétrica para sincronizar a voar para ação e analisa até centenas de moscas simultaneamente (Figura 1). Análise de Dicer2 de ; DDC > auxR¹⁶¹⁸² moscas mostraram uma diminuição de idade-dependente à distânc...

Discussão

O ensaio de anel automatizado descrito aqui permite uma análise do elevado-throughput de comportamento de voar geotaxis negativo para centenas de moscas simultaneamente. Anteriormente estratégias existentes para a análise de escalada adulto envolvem observações de uma única mosca em um frasco individual e posição voar manualmente é detectada pelo olho. Este processo um pouco tedioso às vezes pode causar má interpretação ou má interpretação de dados, bem como trabalho trabalhoso. Nosso ensaio automatizado ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forma Environmental Chamber	Thermo	3949
Carbon dioxide cylinders	FuLian GAS Technology	GB/T6052
HDR-Camcorder	SONY	HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope	Xin Zhen	SMZ-168BL
Electronic scales	MinQiao	SL1002N
Refrigerator	Haier	SC-350
Agar-agar powder	Sinopharm	10000561
Glucose	Sinopharm	10010518
Corn meal	Sinopharm	5464654
Brown sugar	LiuCaiYuan	45467936
Instant dry yeast	AB MAURI	20886
AuxR16182	VDRC	7187
UAS-Dicer2	Bloomington	24650
UAS-mCD8GFP	Bloomington	32185
DDC-Gal4			A gift from Fude Huang
AuxGFP			A gift from Henry Chang