JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.

Özet

Nörodejeneratif hastalıklar sık ilerici kaybı hareket yeteneği, düşük yaşam süresi ve yaş bağımlı ateş ile ilişkilidir. Bu hücresel mekanizmasını anlamak için olaylar ve onların nedensel birbirleriyle ilişkisi, Drosophila melanogaster, Gelişmiş genetik araçlar ve çeşitli davranış özellikleri ile hastalık modelleri değerlendirmek için kullanılır nörodejeneratif fenotipleri. Burada Drosophila yetişkin negatif geotaxis davranış, ateş ile ilişkili olası motor kusurları için bir göstergesi olarak analiz etmek için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır. Otomatik bir makine tasarlanmış ve daha sonra saniye dakika için bir ders üzerinde negatif geotaxis davranış kayıt sağlayan bir ilk elektrik dürtü kullanarak sürücü sinek eşitleme için geliştirilmiştir. Dijital olarak kaydedilmiş video görüntüleri daha sonra istatistiksel veri işleme için kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılımı ile işlenir. Tek anında göre el ile kontrollü negatif geotaxis tahlil farklı, bu kesin, hızlı ve yüksek üretilen iş iletişim kuralı veri toplama devamını sağlar sinekler yüzlerce aynı anda, ilerlemek için verimli bir yaklaşım sağlamak bizim Lokomotor açıkları ateş ile ilişkili temel mekanizması anlama.

Giriş

İletişim kuralları ve yöntemleri çeşitli Drosophila yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için geliştirilmiştir. Oldukça zahmetli, geleneksel analiz çoğunlukla bir tek sinek bireysel bir şişe koyarak içerir ve sinekler eşitleme1,2,3için,4aşağı dokunun için el ile bir güç kullanır. Bu sıkıcı ve zaman alıcı, büyük yüksek üretilen iş çalışmaları için uygun olmayan ve sinekler gibi diğer sınırlamalar dokunun eskiden el ile kuvvet potansiyel farklılıklar vardır. Tahlil geliştirmek için hızlı yinelemeli negatif Geotaxis (yüzük) tahlil hangi aynı saat5' te üzerinden çok sayıda yüksek üretilen iş analiz sağlar geliştirilmiştir. Ancak, tahlil hala sinek eylem eşitlemek için el ile uygulamakla bir kuvvet gerektirir. Bizim sürümü önceki tahlil revize yüzük tahlil, birden çok sinek içeren şişeleri sinek eşitleme6sürücü için bir elektrik motoru ile otomatik olarak kontrol hosting bir metal Bankası içerir. Kayıt üzerine hemen eşitleme sonra kaydedildikten sonra tırmanma anında kendini tasarlanmış bir yazılım kullanılarak analiz. Bizim otomatik yüzük tahlil bir tek sinek, teker teker, üzerinden veri toplama sıkıcı ve emek yoğun işlem ortadan ve daha verimli olması verileri edinme işlemi etkin. Buna ek olarak, otomatik yüzük tahlil mekanizması temel Alzheimer aydınlatmak için çalışmalar ve Parkinson Hastaligi, yüksek verim7,8,9 yaklaşımla doğrulama bir sayısında istihdam .

Bu makalede, RNAi sinekler tahrik DDC-Gal4 kullanarak otomatik yüzük tahlil göstermektedir. DDC-Gal4 özellikle dopaminerjik (DA) ve serotonerjik nöron, ifade bir Gal4 böylece ateş10eşlik eden Lokomotor açıkları ile ilişkili hedef gen etkileri analiz etmek için harika bir araç gösteren çizgidir. Buna ek olarak, biz UAS-Dicer2, UAS-Dicer2 oluşturmak için RNAi verimliliği artırır bir sinek çizgi dahil; DDC-Gal4 aracı satır. Kullanmak için seçtiğimiz RNAi sinekler olduğunu auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), biz daha önce üzerinde bir etkisi sergilemek belirledik bir gen sinek Lokomotor aktivite8. auxGFP uçar Ayrıca aux overexpression üzerine etkilerini çözümlemek için hazırlanır. Biz otomatik yüzük tahlil sinek negatif geotaxis ölçmek, sonuçları sunmak ve sonuçları elde herhangi bir etkileri görüşmek için nasıl kullanılacağını gösterir.

Protokol

1. fly toplama

  1. 25 ° C, % 70 nem ve 12 h/12 h açık/koyu döngüsü standart sinek Gıda sinekler korumak.
  2. UAS-Dicer2 toplamak; DDC-GAL4 sinek virginsunder karbondioksit (CO 2) anestezi.
  3. İçin 2 gün eski yetişkin erkek sinek aşağıdaki genotip taşıyan bu bakireler cross: UAS-mCD8GFP (kontrol), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux overexpression), ve auxR 16182; auxGFP (kurtarmak, bir erkek ile): kadın oranı 1:2.
  4. Ayrı toplamak yeni eclosed kadın ve erkek her düzenli sinek flakon 25 standart gıda ile 10 sinekler yerleştirerek her grup deney, başına 3 şişe içinde ° C.
  5. Bağlı olarak deneme, tutmak toplanan 35 gün uçar ve günde 5, 15, 25 ve 35 otomatik yüzük analiz için kullanýn.

2. Yüzük tahlil otomatik

  1. Transfer her genotip başına toplanan sinekler (unisex) şişe, sonra şişe bir vida ile güvenli 10. Denetim sinek ve sinek birlikte deneyler her kümesi için farklı genotip taşıyan analiz (en çok 10 şişe aynı anda, her şişeyi 10 sinekli).
  2. Önünde cihazları yerleştirilen dijital kamera açmak ve bir kez sinek kaydetmeye başlayın tüm yüklendi ve hazır.
  3. 1dk sinekler şişeleri yerleşmek için izin sonra adım sürücü kontrol eder adım denetleyicisinde açın; bu böylece arka arkaya yükselir ve cihaz 4 kez 2 musluklar bağlı kolu denetlemek için küçük elektrikli motor sürücüler s. Bkz: şekil 1.
    1. Dokunarak sonra sinekler duvar yükselmeye başlar dikkat edin. Kayıt devam etmesini sağlamak.
  4. 3-5 ardışık denemeler için 2.3 içinde 60-s aralığı adımda anlatıldığı gibi eşitleme yineleyin.
  5. 5, 15, 25 ve 35 gün eski sinekler için denemeyi tekrarlamak. Her grup için en az 3 bağımsız deney, en az 30 toplanan ile her deneme (3 şişe) uçar.

3. Veri analizi

  1. bilgisayara kaydedilen videoyu içe.
  2. 6'video fotoğrafını çeker her deneme için dokunarak sonra s.
  3. Anlık görüntü görüntü ithalat RflyDetection yazılım kullanarak (bkz: Şekil 2), ' dosya ' menü.
  4. Flakon üst ve alt taban tam olarak araç çubuğunda temel simgesini kullanarak ve sonra üst ve alt taban görüntü üzerinde işaretlemek için imleci kullanarak belirlediği.
  5. İçine şişe (örneğin, 10 işte) başına sinekler sayısı giriş ' rect Flys ' alan ve flakon uzunluğu (örneğin, 14 cm) ' tüp yükseklik ' alan ayarları bar içinde.
    1. Tek tek sinek pozisyonları tespit ve her şişe için ekranda noktalı etiketli Not.
      Not: Resim 2 tüm menü düğmesini tıklama konumlarını gösterir.
  6. Not yazılım otomatik olarak tırmanma her sinek belirler ve bir tablo sağ panelde her şişede 10 sinekler üzerinden ortalama değerleri görüntüler. (Bkz: Şekil 2)
  7. Daha fazla istatistik analiz istatistiksel yazılım (örneğin, prizma) tırmanma numarasıyla işlemek.
  8. ± SEM ortalama olarak veri mevcut
  9. p hesaplamak-değerleri önem (yıldız ile belirtilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) tek yönlü ANOVA Bonferroni ile birden fazla karşılaştırma testini kullanarak

Sonuçlar

Bu makalede sinek negatif geotaxis davranış değerlendirirken otomatik bir yüzük tahlil kullanımını gösterir. Önceki yüzük tahlil bizim tahlil sinek eylem eşitlemek için bir elektrik güç sağlar ve sinek kadar yüzlerce çözümleyen bir otomatik cihaz aynı anda içerir (şekil 1). Dicer2 analizi; DDC > auxR16182 DA nöronların ifadede aux sinek Lokomotor aktivite için çok önemli olduğunu düşündüren u...

Tartışmalar

Burada açıklanan otomatik yüzük tahlil aynı anda yüzlerce sinekler sinek negatif geotaxis davranışının yüksek üretilen iş çözümleme sağlar. Daha önce bir tek sinek bireysel bir şişe içinde gözlemleri yetişkin tırmanma analiz etmek için mevcut stratejileri içerir ve sinek konumu el ile göz tarafından algılanır. Bu oldukça sıkıcı oluşum bazen yanlış okuyup veya veri, hem de emek yoğun iş yanlış yorumlanmasına yol açabilir. Bizim otomatik yüzük tahlil basit bir tıklama ile başl...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Bloomington stok merkezi ve Viyana Drosophila RNAi Merkezi sinek hisse senetleri için teşekkür ederim. Yüzük cihazları için patent için Shanghai gelişmiş Araştırma Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi ait. RflyDetection yazılım Fu-de Huang yapılmalıdır için İstekler (yazar listeye bakın). Bu eser Ulusal temel araştırma programı, Çin'den hibe tarafından desteklenmiştir (973 Program 2013CB945602) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31270825 ve 31171043). Ho laboratuvar üyeleri tartışma ve Yorumlar için teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Forma Environmental ChamberThermo3949
Carbon dioxide cylindersFuLian GAS TechnologyGB/T6052
HDR-CamcorderSONYHDR-CX220E
Binocular stereomicroscopeXin ZhenSMZ-168BL
Electronic scalesMinQiaoSL1002N
RefrigeratorHaierSC-350
Agar-agar powderSinopharm10000561
GlucoseSinopharm10010518
Corn mealSinopharm5464654
Brown sugarLiuCaiYuan45467936
Instant dry yeastAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4A gift from Fude Huang
AuxGFPA gift from Henry Chang

Referanslar

  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Davransay 127Drosophilat rmanmaParkinson hastalya ba mlatenegatif geotaxisLokomotor davran Yeti kin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır