Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Resumen

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Resumen

Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.

Introducción

En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión^1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la hermana chromatids del genoma duplicado son condensado (profase) y son capturadas en sus cinetocoros por microtúbulos del huso mitótico ensamblado (Prometafase), que impulsa su alineación en la placa de la metafase (metafase) seguida por su igual segregación cuando hermana cromátides se divide hacia y transportados en el eje opuesto postes (anafase). Las dos células hijas se separan físicamente por la actividad de un anillo contráctil de actina-basado (telofase y citocinesis). El cinetocoro es una estructura proteica especializada que reúne en la región centromérica de cromátides hermanas y servir como sitios de fijación para los microtúbulos del huso. Su función principal es la captura de cromosoma, alineación, y ayuda en la corrección de accesorio de microtúbulos del huso indebido, al mediar el puesto de control de ensamblaje del huso para mantener la fidelidad de cromosoma segregación^3,4.

La técnica de sincronización celular sirve como una herramienta ideal para la comprensión de los eventos moleculares y estructurales implicados en la progresión del ciclo celular. Este enfoque se ha utilizado para enriquecer poblaciones de células en fases específicas de diversos tipos de análisis, incluyendo perfiles de expresión génica, análisis de los procesos bioquímicos celulares y la detección de la localización subcelular de las proteínas. Las células mamíferas sincronizadas pueden utilizarse no sólo para el estudio de productos de genes individuales, sino también de enfoques de análisis de genomas enteros, incluyendo análisis de microarray del gene expresión⁵, de patrones de expresión de miRNA⁶, regulación traduccional⁷y análisis proteómico de proteína modificaciones⁸. Sincronización puede utilizarse también para estudiar los efectos de genes o proteínas precipitación o knock-out, o de productos químicos en la progresión del ciclo celular.

Las células se pueden sincronizar en las diferentes etapas del ciclo celular. Métodos físicos y químicos son ampliamente utilizados para la sincronización celular. Los criterios más importantes para la sincronización de la célula son que la sincronización debe ser fotoefecto y reversible. Debido a las potenciales consecuencias adversas celulares de la sincronización de las células por agentes farmacológicos, métodos de química dependiente pueden ser ventajosos para el estudio de eventos del ciclo celular clave. Por ejemplo, hidroxiurea, amphidicolin, mimosina y lovastatina, pueden utilizarse para la sincronización de la célula en fase G1/S, pero, debido a su efecto sobre las vías bioquímicas que inhibir, activar mecanismos de control del ciclo celular y matar a un importante fracción de las células^9,10. Por otra parte, inhibición de la regeneración de la replicación del ADN mediante la adición de timidina a los medios de crecimiento, conocidos como "bloque de timidina", puede detener el ciclo celular en ciertos puntos^11,12,13. Las células también pueden sincronizarse en fase G2/M por tratar con nocodazole y RO-3306^9,14. Nocodazole, que previene el montaje del microtubule, tiene una relativamente alta citotoxicidad. Por otra parte, las células nocodazole detenido puedan volver a interfase precozmente por deslizamiento mitotic. Doble timidina bloque detención en fase G1/S y después de la liberación del bloque, las células se encuentran células actuar sincrónicamente a través de G2 y mitosis. La progresión normal del ciclo celular de células de bloque de timidina puede observarse bajo microscopia confocal de alta resolución por fijación de la célula o en proyección de imagen. El efecto de la perturbación de las proteínas mitotic puede estudiarse específicamente cuando las células entraran y proceden a través de mitosis después del lanzamiento del bloque doble de timidina. Cdt1, una proteína multifuncional, está involucrado en licencias de origen de replicación de ADN en la fase G1 y se necesita para archivos adjuntos de microtúbulos cinetocoros durante mitosis¹⁵. Para estudiar la función de Cdt1 durante la mitosis, es necesario adoptar un método que evita el efecto de su agotamiento en licencias de replicación durante la fase G1, mientras que al mismo tiempo efectuar su agotamiento específicamente durante la fase G2/M solamente. Aquí, presentamos protocolos detallados basados en el bloque de timidina doble para estudiar la función mitótica de proteínas múltiples funciones durante las diferentes etapas del ciclo celular por proyección de imagen fija y células vivas.

Protocolo

1. doble bloque de timidina y liberación: preparaciones de reactivos

1. Tomar 500 mL que Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, penicilina y estreptomicina.
2. Hacer caldo de 100 mM de timidina en agua estéril y conservar en alícuotas a-80 ° C.

2. Protocolo para la proyección de imagen de celular fijo de progresión mitótica (figura 1A)

1. El día 1, semilla ~ 2 x 10⁵ células de HeLa en los pocillos de una placa de 6 pozos con un cubreobjetos (esterilizado con etanol al 70% y la radiación ultravioleta) y 2 mL de medio DMEM. Crecen las células en una incubadora humidificada durante 24 h a 37 ° C y 5% CO₂.
2. a 1 cuadra de timidina^st : en el día 2, mezclar bien el volumen requerido de timidina en el medio DMEM fresco (concentración de 2 mM stock, final de 100 m m).
3. Añadir 2 mL de timidina contiene medios a las células en cada pozo del pozo 6 de la placa e incubar durante 18 h.
4. El día 3, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM precalentado fresco; crecen las células en medio DMEM precalentado fresco de 9 h liberar células del bloque.
5. 2 bloque de timidina^nd : otra vez, añadir 2 mL de timidina contiene medios (concentración final de 2 mM) a las células en cada pocillo de la placa de la pozo 6.
6. Incubar durante 18 h otro.
7. El día 4, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM fresco de precalentado.
8. SiRNAs diluidos (control y Cdt1) y el reactivo de transfección en medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclan juntos e incuban por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
9. Incube las células a 37 ° C durante 9-10 h para liberar del bloqueo y fijar las células en el cubreobjetos con el 4% PFA por 20 min a TA.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.
10. Immunostain células, después permeabilizing con detergente de 0,5% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente y lavado las células dos veces con PBS 1 x durante 5 minutos.
    1. Bloque de celdas con 1% BSA (w/v) de 1 x PBS para 1 h a temperatura ambiente, seguido por el tratamiento de células con 50 μl de anticuerpos primarios (anticuerpo de ratón anti-α-tubulina diluido 1:1, 000, anticuerpos anti-Zwint1 diluido al 1: 400 y mouse anti-phospho-ɣ H2AX diluido en 1:300) en el 1% (p/v) BSA en PBS 1 x por 1 h a 37 ^oC.
    2. Después de lavar las células con 1 x PBS tres veces, tratar las células con 50 μl de anticuerpos secundarios para cada cubierta de vidrio (Alexa 488 y rojo rodamina en diluciones de 1: 250 en el 1% (p/v) BSA en 1 PBS de x) por 1 h a TA.
    3. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, tratar las células con DAPI (0.1µg / mL en PBS 1 x) por 5 min a TA.
    4. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, colocar el cubreobjetos frente a las células a los medios de montaje apropiados en un portaobjetos microscópico claro.
11. Imagen de las células de las proteínas immunostained con 60 X o con objetivo de inmersión de aceite de 100 X 1.4 NA Plan apocromática DIC montadas en un microscopio confocal invertido de alta resolución equipado con una cámara apropiada según sea necesario para la calidad de las imágenes necesarias.
12. Adquisición de imágenes a temperatura ambiente como z-pilas de 0.2 μm de espesor utilizando el software apropiado para el microscopio.

3. Protocolo para la proyección de imagen de células vivas de progresión mitótica (Figura 3A)

1. El día 1, aproximadamente 0.5-1 x 10⁵ células de HeLa expresando estable mCherry H2B y GFP-α-tubulina (ligeramente variable basada en el tipo de la célula y las proteínas que expresan) en platos de fondo de cristal de 35 mm con 1,5 mL de medio DMEM de semillas y cultivarlas en un humidificado incubadora para 24 h a 37 ^oC y 5% CO₂.
2. a 1 cuadra de timidina^st : en el día 2, agregar 1,5 mL de timidina contiene los medios de comunicación a las células en el plato (timidina 100 mM, concentración final de 2 mM,).
3. Incubar durante 18 h.
4. El día 3, Aspire el medio que contenía timidina y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado.
5. SiRNAs diluidos (control y Hec1) reactivo de transfección con medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclar juntos e incubar por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
6. Cultivar células en 1,5 mL de medio DMEM precalentado fresco de 8 h liberar células del bloque.
7. 2 bloque de timidina^nd : Añadir 1,5 mL de contiene timidina media (concentración final de 2 mM) a las células en el plato.
8. Incubar durante 18 h otro.
9. El día 4, Aspire el medio y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado. Luego crecen las células en fresco precalentado Leibovitz de medio (L-15) suplementado con 10% FBS y 20 mM HEPES pH 7.0 durante 8 h para liberar células del bloque.
10. Coloque el plato en la cámara de control de temperatura en el microscopio confocal de alta resolución que ya ha conectado al menos 30 minutos antes de comenzar la proyección de imagen para estabilizar las temperaturas experimentales y escenario.
11. Enfoque en campo brillante con el objetivo x 60 hasta que las células son visibles, luego tamizar manualmente el escenario a la región de elección.
12. Configurar la luz y energía láser, exposición, parámetros de adquisición de imagen y duración del experimento usando el software de adquisición de imagen de microscopio de elección. Utilice filtros para GFP (excitación 488; 385 emisión nm) y mCherry (561 excitación nm y 385 nm emisión) para adquirir imágenes.
13. Realizar el experimento de Time-lapse por separado adquiriendo pulsada luz transmitida y fluorescencia imágenes cada 10 minutos durante un período hasta 16 h.
14. Adquisición de imágenes como doce 1.0 μm separado z aviones a las 9 h después de la liberación del bloque doble timidina utilizando software apropiado al microscopio.
15. Analizar las imágenes de progresión mitótica las células individuales de seguimiento y finalmente montar la película correspondiente con el software ImageJ/Fiji.

Resultados

Estudio de la progresión mitótica y estabilidad de los microtúbulos en células fijas después del lanzamiento de doble bloque de timidina
Cdt1 participa en la concesión de licencias de origen de replicación del ADN en la fase G1. Se degrada durante la fase S, pero nuevamente se acumula en la fase G2/M. Para estudiar su papel en la mitosis, Cdt1 endógeno debe agotarse en la fase G/M usando la técnica de sincronización más adecuada de células, la timidina dobl...

Discusión

La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.

Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión n...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments