Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Resumo

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Resumo

Estudo dos vários eventos reguladoras do ciclo celular de uma forma dependente da fase fornece um entendimento claro sobre o crescimento celular e divisão. A sincronização de populações de células em estágios específicos do ciclo celular foi encontrada para ser muito útil em tais esforços experimentais. Sincronização de células por tratamento com produtos químicos que são relativamente menos tóxicos pode ser vantajosa sobre o uso de drogas inibidoras farmacológicas para o estudo de eventos consequente ciclo celular e obter enriquecimento específico das fases mitóticas selecionados. Aqui, descrevemos o protocolo para Sincronizando pilhas humanas em diferentes fases da célula o ciclo, incluindo ambos na fase S e fase de M com um bloco de timidina duplo e liberar o procedimento para estudar a funcionalidade das proteínas mitóticas em alinhamento de cromossomo e segregação. Este protocolo tem sido extremamente útil para estudar as funções mitóticas das proteínas multifunctional que possuem funções de interfase estabelecida. No nosso caso, o papel mitótico da Cdt1, uma proteína essencial para o licenciamento de origem de replicação na fase G1, pode ser estudado efetivamente somente quando Cdt1 G2/M-específico pode ser esgotado. Descrevemos o protocolo detalhado para esgotamento de Cdt1 G2/M-específicos usando a sincronização de timidina duplo. Nós também explicar o protocolo de fixação da pilha e viver a imagem latente da pilha usando microscopia confocal de alta resolução após lançamento de timidina. O método também é útil para analisar a função das proteínas mitóticas em condições fisiológicas e perturbadas como para Hec1, um componente do complexo, o Ndc80, que permite um para obter os tamanhos de amostra grande de células mitóticas para celular fixo e ao vivo análise como mostramos aqui.

Introdução

No ciclo celular, as células sofrem uma série de eventos altamente regulamentados e temporalmente controlados para a duplicação exata do seu genoma e proliferação. Nos mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três fases - G1, S, e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para o ciclo celular normal progressão^1,2. Na fase M, que consiste de mitose (prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz duas células-filhas geneticamente idênticas. Em mitose, irmã cromátides irmãs de duplicação do genoma são condensado (prófase) e são capturados em seus cinetócoros por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometafase), que dirige o seu alinhamento na placa metafásica (metáfase) seguida por seus igual a segregação quando irmã cromátides irmãs são divididos em direção e transportados para eixo oposto polos (anáfase). As duas células-filhas são fisicamente separadas pela atividade de um anel contrátil actina-baseado (telófase e citocinese). O cinetócoro é uma estrutura especializada proteicas que monta na região centromérica de cromátides irmãs e servem como locais de fixação para os microtúbulos do fuso. Sua principal função é conduzir a captura do cromossomo, alinhamento, e ajuda na correção de acessório do microtubule imprópria do eixo, enquanto mediando o checkpoint de montagem do eixo para manter a fidelidade do cromossoma segregação^3,4.

A técnica de sincronização do celular serve como uma ferramenta ideal para compreender os eventos moleculares e estruturais envolvidos na progressão do ciclo celular. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo a criação de perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de Localização subcellular das proteínas. Células de mamíferos sincronizadas podem ser usadas não só para o estudo de produtos de genes individuais, mas também para abordagens envolvendo análise de genomas inteira, incluindo análise de microarray de gene expressão⁵, miRNA expressão padrões⁶, Regulamento de translação⁷e análise proteômica de proteína modificações⁸. Sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão do gene ou a proteína knock-down ou mata-mata, ou de produtos químicos na progressão do ciclo celular.

As células podem ser sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular. Métodos físicos e químicos são amplamente utilizados para sincronização do celular. Os critérios mais importantes para a sincronização de célula são que a sincronização deve ser fotoefeito e reversível. Devido as potenciais consequências celulares adversas de Sincronizando pilhas por agentes farmacológicos, métodos químico-dependente podem ser vantajosos para estudar eventos chave ciclo celular. Por exemplo, Hidroxiureia, amphidicolin, mimosine e lovastatina, podem ser usados para sincronização de célula na fase G1/S, mas, por causa de seu efeito sobre as vias bioquímicas que eles inibem, eles ativar mecanismos de ponto de verificação do ciclo celular e matar um importante fração das células^9,10. Por outro lado, feedback inibição da replicação do DNA pela adição de timidina para a mídia de crescimento, conhecida como "bloco" de timidina, pode prender o ciclo celular em certos pontos^11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2/M, tratando com nocodazole e RO-3306^9,14. Nocodazole, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma relativamente elevada citotoxicidade. Além disso, as células nocodazole-preso podem retornar para interphase precocemente por deslizamento mitótico. Dupla timidina bloco prisão células na fase G1/S e após o lançamento do bloco, as células encontram-se proceder de forma síncrona G2 e mitose. A normal progressão do ciclo celular por células liberado do bloco de timidina pode ser observada sob microscopia confocal de alta resolução por fixação da pilha ou imagens ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando células entram e prosseguir através de mitose, após o lançamento do bloco de timidina duplo. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido em licenciamento de origem de replicação do DNA na fase G1 e também é necessária para anexos do microtubule cinetócoro durante a mitose¹⁵. Para estudar a função de Cdt1 durante a mitose, é necessário adoptar um método que evita o efeito de sua redução na replicação de licenciamento durante a fase G1, enquanto ao mesmo tempo efetuar sua redução especificamente na fase G2/M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados baseados no bloco de timidina duplo para estudar o papel mitótico das proteínas executar múltiplas funções durante as diferentes fases do ciclo celular de imagens fixas e viver-pilha.

Protocolo

1. double bloco de timidina e lançamento: preparações de reagente

1. Fazer 500 mL que Dulbecco modificado suplementado com 10% FBS, penicilina e estreptomicina médio (DMEM) águia.
2. Fazer estoque de 100 mM do thymidine em água estéril e loja em alíquotas a-80 ° C.

2. protocolo para a imagem latente de célula fixa de progressão mitótica (figura 1A)

1. No dia 1, semente ~ 2 x 10⁵ células de HeLa em poços de uma placa de 6 com uma lamela (esterilizados com 70% de etanol e irradiação UV) e 2 mL do meio DMEM. Crescem as células em uma incubadora umidificada por 24 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. 1 bloco de timidina^st : no dia 2, misture bem o volume necessário de timidina midiático DMEM fresco (100mm estoque, 2mm concentração final).
3. Adicionar 2 mL de timidina-contendo mídia para as células em cada poço do poço 6-placa e incubar por 18 h.
4. No dia 3, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco; desenvolvem-se células em meio fresco de DMEM escaldado para 9h às células do bloco de lançamento.
5. 2^nd timidina bloco: novamente, adicione 2 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células em cada poço da placa de 6-poços.
6. Encube por outro 18 h.
7. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
8. SiRNAs diluído (controle e Cdt1) e reagente de transfeccao em meio de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
9. Incubar as células a 37 ° C para 9-10 h para liberação de bloqueio e fixe as células sobre as lamínulas com 4% PFA por 20 min no RT
   Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.
10. Células de delgados, depois permeabilizing com detergente de 0,5% (v/v) durante 10 minutos a RT e lavar as células duas vezes com PBS 1x por 5 min cada.
    1. Bloquear células com BSA 1% (p/v) em 1X PBS por 1h no RT, seguido por tratamento de células com 50 µ l de anticorpos primários (anticorpo anti-α-tubulina rato diluído a 1:1, 000, anticorpo anti-Zwint1 diluído a 1: 400 e mouse antifosfo-ɣ H2AX diluído a 1: 300) em 1% (p/v) BSA em PBS 1x por 1h em 37 ^oC.
    2. Depois de lavar as células com 1X PBS três vezes, tratar as células com 50 µ l de anticorpos secundários para cada vidro de tampa (Alexa 488 e vermelho rodamina em diluições de 1: 250 em 1% (p/v) BSA em 1X PBS) por 1h no RT
    3. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, tratar as células com DAPI (0.1µg / mL de 1X PBS) durante 5 min à RT
    4. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, coloque a lamínula enfrentando as células para a mídia de montagem apropriado em um slide clara microscópica.
11. Imagem das células para as proteínas immunostained com 60 X ou 100 objectivo de imersão de óleo X 1.4 at plano-apocromático DIC montadas em um microscópio confocal invertido de alta resolução, equipado com uma câmera apropriada conforme necessário para a qualidade das imagens necessárias.
12. Adquira imagens em temperatura ambiente como z-pilhas de 0,2 µm de espessura utilizando software apropriado para o microscópio.

3. protocolo para a imagem latente de célula viva de progressão mitótica (Figura 3A)

1. No dia 1, cerca de 0,5-1 x 10⁵ células de HeLa estàvel expressando mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (ligeiramente variável com base no tipo de célula e as proteínas que eles expressam) em pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com 1,5 mL de DMEM meio de sementes e cultivá-las em um umidificado incubadora para 24 h a 37 ^oC e 5% de CO₂.
2. 1 bloco de timidina^st : no dia 2, adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia às células no prato (timidina 100mm, concentração final de 2 mM,).
3. Incube por 18 h.
4. No dia 3, Aspire o meio contendo timidina e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
5. SiRNAs diluído (controle e Hec1) e reagente de transfeccao, com média de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
6. Desenvolvem-se células em 1,5 mL de meio fresco de DMEM escaldado para 8h às células do bloco de lançamento.
7. bloco de timidina^nd 2: adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células no prato.
8. Encube por outro 18 h.
9. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco. Desenvolvem-se células em fresca escaldada Leibovitz é (L-15) meio suplementado com 10% FBS e 20 mM HEPES pH 7.0 para 8h às células do bloco de lançamento.
10. Coloca o prato na câmara de controle de temperatura definida na alta resolução do microscópio confocal que já tem ligado pelo menos 30 min antes de iniciar a geração de imagens para estabilizar as temperaturas no palco e experimentais.
11. Concentre-se em campo claro, com o objectivo de 60 x até que as células são visíveis e, em seguida, manualmente, Peneire o palco para a região de escolha.
12. Configure a luz e energia/exposição do laser, parâmetros de aquisição de imagem e duração do experimento usando o software de aquisição de imagem do microscópio de escolha. Use filtros de GFP (488 excitação; 385 emissão nm) e mCherry (561 excitação nm e 385 nm de emissão) para adquirir imagens.
13. Realizar o experimento de lapso de tempo adquirindo separadamente a transmissão da luz pulsada e fluorescência imagens cada 10 min por um período até 16 h.
14. Adquira imagens como doze 1.0 separada µm z-aviões às 9 horas após o lançamento do bloco duplo timidina usando o software apropriado para o microscópio.
15. Analisar as imagens de rastreamento células individuais para progressão mitótica e finalmente montar o filme correspondente com o software de fonte Fiji/ImageJ.

Resultados

Estudo de progressão mitótica e estabilidade de microtúbulos nas células fixo após o lançamento do bloco de timidina dobro
Cdt1 está envolvido no licenciamento das origens de replicação do DNA na fase G1. Ela é degradada durante a fase S, mas re-acumula-se na fase G2/M. Para estudar o seu papel na mitose, o Cdt1 endógeno precisa estar esgotado especificamente na fase de G/M, usando a técnica de sincronização de célula mais adequada, o dobro de timidina b...

Discussão

A vantagem mais crítica da sincronização de timidina duplo é que fornece um tamanho de amostra maior das células mitóticas em uma janela de tempo curto com muitas dessas células entrando em mitose em uníssono, permitindo assim também análises de alinhamento de cromossomo, bipolar eixo de formação e de segregação de cromossomas com eficiência muito maior.

Muitos complexos de proteína reguladora e vias de sinalização dedicam-se a garantir a progressão normal através de mitose...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments