שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

Abstract

חקר האירועים הרגולציה השונים של מחזור התא באופן תלוי-שלב מספק הבנה ברורה לגבי צמיחת תאים וחלוקה. הסינכרון של אוכלוסיות תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא כבר מצאו להיות מאוד שימושי לנסיונות ניסיוני כאלה. סינכרון של תאים על ידי טיפול בכימיקלים רעילים יחסית פחות יכול להיות יתרון על השימוש בתרופות מעכבות תרופתי לחקר אירועי מחזור התא הסוגר וכדי להשיג העשרה ספציפי של שלבים mitotic שנבחרו. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור סינכרון תאים אנושיים בשלבים שונים של התא מחזור, כולל שני ב S שלב ושלב מ' עם בלוק תימידין זוגי ולשחרר את נוהל לומד את הפונקציונליות של חלבונים mitotic במערך כרומוזום סגרגציה. פרוטוקול זה היה שימושי ביותר ללמוד את התפקידים mitotic של חלבונים רב תכליתי אשר בעלי פונקציות הוקמה לאטמוספרה. במקרה שלנו, התפקיד mitotic של Cdt1, חלבון קריטי עבור שכפול מקור רישוי בשלב G1, ניתן יהיה ללמוד בצורה יעילה רק כאשר Cdt1 G2/M-ספציפי יכול להיות מרוקנים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור דלדול של Cdt1 G2/M-ספציפי באמצעות סינכרון תימידין כפול. אנחנו גם להסביר את הפרוטוקול של קיבוע תא, ולחיות תא הדמיה באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שחרורו תימידין. השיטה היא שימושית גם עבור ניתוח תפקידו של חלבונים mitotic בתנאים פיסיולוגיים והן מודאג כגון עבור Hec1, מרכיב Ndc80 מורכבים, כמו זה, המאפשר לקבל גודל מדגם גדול של תאים mitotic תא קבוע ולחיות ניתוח כפי שנראה כאן.

Introduction

במחזור התא, התאים עוברים סדרה של אירועים מאוד מוסדר ומבוקר חנותם עבור שכפול מדויק הגנום שלהם והתפשטות. ביונקים, מחזור התא מורכב לאטמוספרה, M-פאזי. ב. לאטמוספרה, אשר כוללת שלושה שלבים - G1, S, ו G2, התא משכפלת את הגנום שלו עובר הצמיחה כי הוא הכרחי עבור מחזור תא נורמלי התקדמות^1,2. בשלב ז-, אשר מורכב של מיטוזה (prophase prometaphase, מפה של, "אנאפאזה", אשהה) וציטוקינזה, תא הורים מייצרת שני תאים זהים גנטית בת. ב מיטוזה, אחותי chromatids של הגנום המשוכפלת מרוכז (prophase) הינם בשבי ב שלהם kinetochores על ידי microtubules בכישור mitotic שהורכב (prometaphase), שמניע את היישור שלהן למשטח מפה של (כל) ואחריו שלהם שווה סגרגציה כאשר אחותי chromatids פיצול לכיוון והועברו לאתר פלך מול הפולנים ("אנאפאזה"). שני התאים הבת מופרדים פיזית באמצעות הפעילות של מבוססי אקטין כויץ טבעת (אשהה וציטוקינזה). קינטוכור מבנה proteinaceous מיוחדים אשר מרכיבה על האזור centromeric של chromatids, לשמש אתרי מצורף עבור ציר microtubules. הפונקציה העיקרית היא לנהוג כרומוזום לכידת, יישור, וסיוע בתיקון מצורף microtubule פלך פסולים, בעוד תיווכה במחסום מכלול ציר כדי לשמור על אמינות של כרומוזום סגרגציה^3,4.

הטכניקה של סינכרון תא משמש כלי אידיאלי להבנת האירועים מבניים המולקולריים המעורבים בהתקדמות מחזור התא. גישה זו שימש כדי להעשיר את אוכלוסיות תאים-שלבים ספציפיים עבור סוגים שונים של ניתוחים, כולל בניית פרופיל של ביטוי גנים, ניתוח של תהליכים ביוכימיים הסלולר, וזיהוי של לוקליזציה subcellular של חלבונים. תאים בתרבית של מסונכרן יכול לשמש לא רק לצורך המחקר של מוצרים גנים בודדים, אלא גם עבור גישות הכוללים ניתוח של הגנום כולו כולל ניתוח microarray של ביטוי גנים⁵, דפוסי ביטוי miRNA⁶, translational בתקנה⁷, וניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון שינויים⁸. סינכרון יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של ביטוי גנים או חלבון דפיקה למטה או הנוק-אאוט, או של כימיקלים על התקדמות מחזור התא.

ניתן לסנכרן תאים בשלבים שונים של מחזור התא. השיטות הפיסיקליות והכימיות נמצאים בשימוש נרחב עבור תא סינכרון. הקריטריונים החשובים ביותר עבור סינכרון תא הם כי סינכרון צריך להיות noncytotoxic ולא הפיך. בגלל תופעות לוואי הסלולר ההשלכה הפוטנציאלית של סינכרון תאים על ידי סוכנים תרופתי, שיטות תלויי-כימי יכול להיות יתרון ללימוד אירועי מפתח מחזור התא. לדוגמה, הידרוקסיוראה, amphidicolin, mimosine ו- lovastatin, יכול לשמש עבור סינכרון תא בשלב G1/S אבל, בגלל השפעתם על המסלולים הביוכימי שמונעים, הם להפעיל מנגנוני הביקורת מחזור התא להרוג חשובה שבר של תאי ה-^9,10. מצד שני, משוב עיכוב של שכפול ה-DNA על-ידי הוספת תימידין התקשורת צמיחה, המכונה "תימידין בלוק", יכולים לעצור את מחזור התא בגיל^12,11,13מסוימים נקודות. תאים גם ניתן לסנכרן בשלב G2/M על-ידי טיפול עם nocodazole,^9,RO-3306¹⁴. Nocodazole, אשר מונע microtubule הרכבה, כולל של cytotoxicity גבוה יחסית. יתר על כן, נעצר nocodazole תאים באפשרותך לחזור לאטמוספרה precociously על ידי גלישה mitotic. כפול תימידין בלוק מעצר תאים בשלב G1/S, לאחר שחרורו מן הרחוב, נמצאו תאים כדי להמשיך באופן סינכרוני דרך G2 ולתוך מיטוזה. התקדמות נורמלי של מחזור התא עבור תאים שוחררו תימידין בלוק יכול להיות שנצפו תחת קונפוקלית ברזולוציה גבוהה על ידי קיבוע תאים או הדמיה בשידור חי. ניתן יהיה ללמוד את השפעת ההפרעות של חלבונים mitotic במיוחד כאשר תאים הזן והמשך דרך מיטוזה לאחר שחרורו של תימידין זוגי בלוק. Cdt1, חלבון רב תכליתיים, מעורב מקור שכפול ה-DNA רישוי בשלב G1 ויש גם צורך קינטוכור microtubule מצורפים במהלך מיטוזה¹⁵. ללמוד את הפונקציה של Cdt1 במהלך מיטוזה, אחד צריך לאמץ שיטה זה מונע את השפעת המחסור שלה על שכפול רישוי במהלך שלב G1, בזמן בו זמנית שמצריכות שלה דלדול במיוחד במהלך שלב G2/M בלבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורט המבוסס על הבלוק תימידין זוגי ללמוד את התפקיד mitotic של חלבונים ביצוע פונקציות מרובות בשלבים שונים של מחזור התא על ידי הדמיה קבוע והן לחיות תאים.

Protocol

1. כפול תימידין בלוק ושחרור: ריאגנט ההכנות

1. להפוך 500 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS פניצילין, סטרפטומיצין.
2. להכין מלאי 100 מ מ של תימידין במים סטריליים, בחנות aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול עבור תא קבוע הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 1 א')

1. יום 1, זרע ~ 2 x 10 תאים הלה⁵ לתוך הבארות של צלחת 6-ובכן עם מכסה (עיקור עם 70% אתנול וביו -הקרנת UV) ו- 2 מ של DMEM בינונית. לצמוח התאים חממה humidified במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%₂.
2. רחוב אחד של תימידין^st : ביום 2, ביסודיות מערבבים את אמצעי האחסון הדרושים של תימידין בתקשורת DMEM טרי (100 מ מ מניות, 2 מ מ הסופי ריכוז).
3. להוסיף 2 מ של תימידין המכילות תאים כל טוב של הבאר-6 צלחת ומדיה תקופת דגירה של 18 h.
4. יום 3, תשאף המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של 1 x PBS ופעם עם טרי DMEM prewarmed; לגדל תאים טרי בינוני DMEM prewarmed עבור h 9 לשחרר תאים בבלוק.
5. בלוק 2 של תימידין^nd : שוב להוסיף 2 מ של תימידין המכילות מדיה (ריכוז סופי 2 מ מ) על התאים היטב כל צלחת 6-. טוב.
6. תקופת דגירה של עוד 18 h.
7. יום 4, תשאף המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של 1 x PBS ופעם DMEM prewarmed טריים.
8. שתדללו siRNAs (שליטה ו- Cdt1), תרביות תאים ריאגנט בסרום מדיום הגידול ללא תשלום בנפרד עבור 10 דקות מערבבים אותם ביחד, תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT. הריכוז הסופי של siRNA בשימוש כל תרביות תאים היה 100 ננומטר. להוסיף את התערובת תגובת התאים נשטפו החוצה תימידין.
9. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 9-10 h כדי לשחרר מחסימת ולתקן את התאים על שער גולשת עם 4% מחברים עבור 20 דקות ב- RT.
   התראה: PFA רעיל, לענוד הגנה הולמת.
10. תאים Immunostain, לאחר permeabilizing עם חומר ניקוי 0.5% (v/v) למשך 10 דקות ב RT ושטיפת התאים פעמיים עם 1 x PBS למשך 5 דקות.
    1. לחסום תאים עם 1% BSA (w/v) ב- PBS x 1 על 1 h ב- RT ואחריו טיפול תאים עם 50 µL של ראשי נוגדנים (העכבר אנטי-α-טובולין נוגדן מדולל ב- 1:1, 000, נוגדן anti-Zwint1 הארנב מדולל ב 1:400, ועכבר אנטי-פוספו-ɣ H2AX מדולל ב 1:300) 1% (w/v) BSA ב- PBS 1 x עבור h 1-37 ^oC.
    2. לאחר הכביסה החוצה את התאים עם 1 x PBS שלוש פעמים, לטפל תאים עם 50 µL של נוגדנים משניים עבור כל כוס כיסוי (אלקסה 488 ואדום Rhodamine-1:250 דילולים 1% (w/v) BSA ב- 1 x PBS) עבור h 1-RT.
    3. לאחר שטיפת התאים עם PBS 1 x פעמיים במשך 5 דקות, יטפל בתאים עם דאפי (0.1µg / מ ל 1 x PBS) עבור 5 דקות ב- RT.
    4. לאחר שטיפת התאים עם PBS 1 x פעמיים במשך 5 דקות, מקום בתגית כיסוי מול לתאים התקשורת המתאימה הרכבה בשקופית ברור מיקרוסקופיים.
11. תמונת התאים של החלבונים immunostained עם 60 X או 100 X 1.4 נה DIC תוכנית-Apochromatic שמן טבילה המטרה רכוב על מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה הפוכה מצויד עם מצלמה המתאים לפי הצורך עבור איכות התמונות הנדרשות.
12. לרכוש תמונות בטמפרטורת החדר כמו z-ערימות של 0.2 µm עובי באמצעות תוכנה מתאים של המיקרוסקופ.

3. פרוטוקול עבור תא חי הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 3 א)

1. יום 1, זרע כ 0.5-1 x 10⁵ הלה תאים stably לבטא mCherry-ויזת עבודה H2B ו- GFP-α-טובולין (מעט משתנה לפי סוג התא ואת החלבונים שהם מבטאים) 35 מ מ זכוכית התחתון מנות עם 1.5 מ של DMEM בינוני, לגדל אותם בבית humidified החממה במשך 24 שעות ביממה-37 ^oC ו- 5% CO₂.
2. רחוב אחד של תימידין^st : ביום 2, להוסיף 1.5 מ של תימידין המכילות מדיה על התאים בצלחת (100 מ מ תימידין, ריכוז סופי 2 מ מ,).
3. תקופת דגירה של 18 h.
4. ביום 3, תשאף המדיום המכיל תימידין ולשטוף את התאים שלוש פעמים, פעמיים עם 2 מ ל 1 x PBS ופעם אחת עם DMEM prewarmed טריים.
5. שתדללו siRNAs (שליטה ו- Hec1), תרביות תאים מגיב עם סרום מדיום הגידול ללא תשלום בנפרד עבור 10 דקות מערבבים אותם ביחד, תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT. הריכוז הסופי של siRNA בשימוש כל תרביות תאים היה 100 ננומטר. להוסיף את התערובת תגובת התאים נשטפו החוצה תימידין.
6. לגדל תאים ב- 1.5 מ של טרי prewarmed בינוני DMEM עבור 8 שעות לשחרר תאים בבלוק.
7. בלוק 2 של תימידין^nd : להוסיף 1.5 מ של תימידין המכילות מדיה (ריכוז סופי 2 מ מ) על התאים בצלחת.
8. תקופת דגירה של עוד 18 h.
9. ביום 4, תשאף המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים, פעמיים עם 2 מ ל 1 x PBS ופעם אחת עם DMEM prewarmed טריים. ואז לגדל תאים בליבוביץ prewarmed טריים של בינוני (L-15) בתוספת 10% FBS ו 20 מ מ HEPES ב- pH 7.0 עבור 8 שעות לשחרר תאים מהגוש.
10. מקם את המנה בבית הבליעה בקרת הטמפרטורה להגדיר במיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה אשר החליף כבר לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה לייצב את הטמפרטורות על הבמה ו ניסיוני.
11. להתרכז בתחום בהיר עם המטרה 60 x עד תאים גלויים, ואז באופן ידני לנפות את הבמה לאזור של הבחירה.
12. להגדיר את האור ואת כוח/חשיפה ללייזר, פרמטרים רכישת התמונה ומשך של הניסוי באמצעות התוכנה רכישת תמונת מיקרוסקופ של בחירה. השתמש במסננים GFP (עירור 488; פליטת nm 385), mCherry (561 עירור nm ו פליטה nm 385) כדי לרכוש תמונות.
13. לבצע את הניסוי בצילום מואץ על ידי בנפרד רכישת פעמו המשודרת זריחה ואור תמונות כל 10 דקות במשך תקופה של עד 16 שעות.
14. לרכוש תמונות כפי 1.0 12 מיקרומטר מופרדים z מטוסים ב h 9 לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין כפול באמצעות תוכנה מתאימה כדי המיקרוסקופ.
15. לנתח את התמונות לאתר תאים בודדים עבור התקדמות mitotic ולהרכיב בסופו של דבר את הסרט המתאים בתוכנת ה-מקור פיג ' י/ImageJ.

תוצאות

מחקר של התקדמות mitotic ויציבות microtubule בתאים קבוע לאחר שחרור כפול תימידין בלוק
Cdt1 מעורב רישוי ממוצא שכפול ה-DNA בשלב G1. זה יורד במהלך שלב S אבל מצטברת בשלב G2/M. כדי ללמוד תפקידה מיטוזה, Cdt1 אנדוגני צריכה להיות דלה במיוחד בשלב G/M בטכניקה המתאימה ביותר תא סינכרון, בלוק תימ?...

Discussion

היתרון הקריטי ביותר של תימידין זוגי הסינכרון הוא שהיא מספקת גודל המדגם מוגברת של תאים mitotic בחלון זמן קצר עם רבים של תאים אלו נכנסים מיטוזה שבסיר, ובכך מאפשר גם ניתוחים של כרומוזום יישור, הפרעה דו קוטבית ציר היווצרות, סגרגציה כרומוזום עם הרבה יעילות גבוהה יותר.

רבים מתחמי חלב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments