Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Résumé

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Résumé

Étude sur les divers événements de régulation du cycle cellulaire en fonction de la phase fournit une compréhension claire de la division et la croissance des cellules. La synchronisation des populations cellulaires à des stades spécifiques du cycle cellulaire s’est avérée pour être très utile dans ces efforts expérimentaux. Synchronisation des cellules par un traitement avec des produits chimiques qui sont relativement moins toxique peut être avantageuse sur l’utilisation de médicaments inhibiteurs pharmacologiques pour l’étude des événements de cycle de cellules qui en résulte et obtenir l’enrichissement spécifique de certains stades mitotiques. Nous décrivons ici le protocole de synchronisation des cellules humaines à des stades différents de la cellule du cycle, comprenant à la fois en phase S et phase M avec un bloc double thymidine et libérer la procédure pour l’étude de la fonctionnalité des protéines mitotiques dans l’alignement des chromosomes et la ségrégation. Ce protocole a été extrêmement utile pour étudier les rôles mitotiques des protéines multifonctionnelles qui possèdent des fonctions interphase établies. Dans notre cas, le rôle mitotique de Cdt1, une protéine essentielle pour la réplication origine licences en phase G1, peut être étudié efficacement que lorsque Cdt1 G2/M-spécifiques peuvent être épuisés. Les auteurs décrivent le protocole détaillé pour épuisement des Cdt1 G2/M-spécifique à l’aide de la synchronisation de la thymidine double. Aussi, nous expliquer le protocole de la fixation de la cellule et vivre l’imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie confocale haute résolution après la sortie de la thymidine. La méthode est également utile pour analyser la fonction des protéines mitotiques sous des conditions physiologiques et perturbées comme pour Hec1, une composante de la Ndc80 complexe, car elle permet d’obtenir de grands échantillons de taille des cellules mitotiques pour fixe et de cellules vivantes l’analyse que nous montrons ici.

Introduction

Dans le cycle cellulaire, les cellules subissent une série d’événements fortement réglementées et contrôlées dans le temps pour la reproduction exacte de leur génome et leur multiplication. Chez les mammifères, le cycle cellulaire se compose de l’interphase et de la phase M. En interphase, qui se compose de trois phases G1, S et G2, la cellule duplique son génome et subit une croissance qui est nécessaire à la progression de cycle cellulaire normal^1,2. Dans la phase M, qui se compose de la mitose (prophase prométaphase, métaphase, anaphase et télophase) et la cytocinèse, une cellule parentale produit deux cellules filles génétiquement identiques. Lors de la mitose, sœur de chromatides-sœurs de génome dupliqué sont condensée (prophase) et sont capturés à leurs kinétochores par des microtubules du fuseau mitotique assemblé (prométaphase), qui pousse leur alignement à la plaque métaphasique (métaphase), suivie de leur égale à ségrégation lorsque sœur chromatides sont divisés vers et transportés vers l’axe opposé de polonais (anaphase). Les deux cellules filles sont physiquement séparées de l’activité d’un anneau contractile axée sur l’actine (télophase et cytocinèse). Le kinétochore est une structure spécialisée de nature protéique qui assemble dans la région centromérique des chromatides et servent de sites de fixation pour les microtubules du fuseau. Sa fonction principale est de conduire la capture de chromosome, alignement et aide à corriger une mauvaise broche microtubule pièce jointe, tandis que la médiation du point de contrôle Assemblée broche pour maintenir la fidélité du chromosome ségrégation^3,4.

La technique de synchronisation de la cellule est un outil idéal pour comprendre les événements moléculaires et structurales impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Cette approche a été utilisée pour enrichir les populations cellulaires à des phases spécifiques de différents types d’analyses, y compris le profilage de l’expression génique, analyses de processus biochimiques cellulaires et détection de localisation sous-cellulaire des protéines. Des cellules de mammifères synchronisés peuvent être utilisés non seulement pour l’étude des produits des gènes individuels, mais aussi des approches mettant en cause l’analyse des génomes entiers, y compris l’analyse de microarray de gene expression⁵, miRNA expression patterns⁶, régulation traductionnelle⁷et l’analyse protéomique de protéine modifications⁸. Synchronisation peut également être utilisée pour étudier les effets de l’expression des gènes ou des protéines précipitation ou knock out, ou de produits chimiques sur la progression du cycle cellulaire.

Les cellules peuvent être synchronisés aux différents stades du cycle cellulaire. Méthodes physiques et chimiques sont largement utilisés pour la synchronisation de la cellule. Les critères les plus importants pour la synchronisation de la cellule sont que la synchronisation soit photo-effet et réversible. En raison des conséquences indésirables potentiels cellulaires de synchroniser des cellules par des agents pharmacologiques, les méthodes chimiques peuvent être avantageuses pour l’étude des événements de cycle de cellules clés. Par exemple, hydroxyurée, amphidicolin, mimosine et lovastatine, peuvent être utilisés pour la synchronisation des cellules en phase G1/S mais, en raison de leurs effets sur les voies biochimiques, qu'ils inhibent, ils activer des mécanismes de contrôle de cycle cellulaire et de tuent un important fraction des cellules^9,10. En revanche, rétro-inhibition de la réplication de l’ADN en ajoutant thymidine dans les milieux de croissance, appelé « bloc de la thymidine », peuvent arrêter le cycle cellulaire à certains points^11,12,13. Cellules peuvent aussi être synchronisés en phase G2/M en traitant avec la nocodazole et RO-3306^9,14. La nocodazole, qui empêche l’assemblage des microtubules, a une cytotoxicité relativement élevée. En outre, arrêté à la nocodazole cellules peuvent retourner au interphase précocement par glissement mitotique. Double thymidine bloc arrestation des cellules en phase G1/S et après la sortie du bloc, les cellules se trouvent à procéder de façon synchrone par le biais de G2 et en mitose. La progression normale du cycle cellulaire des cellules provenant du bloc de la thymidine peut être observée en microscopie confocale haute résolution par fixation cellulaire ou imagerie live. L’effet d’une perturbation des protéines mitotiques peut être étudiée précisément lorsque les cellules entrer et passer par mitose après la sortie de bloc double thymidine. Cdt1, une protéine multifonctionnelle, participe à l’origine de réplication ADN licence en phase G1 et est également nécessaire pour les pièces jointes de microtubules kinétochores durant la mitose,¹⁵. Pour étudier la fonction des Cdt1 durant la mitose, on a besoin d’adopter une méthode qui évite l’effet de son appauvrissement sur l’autorisation de réplication au cours de la phase G1, alors qu’en même temps effectuer son appauvrissement spécifiquement au cours de la phase G2/M seulement. Nous présentons ici des protocoles détaillés basés sur le bloc de thymidine double pour étudier le rôle mitotique des protéines des fonctions multiples au cours des différentes étapes du cycle cellulaire par l’imagerie fixe et cellules vivantes.

Protocole

1. double bloc de Thymidine et libération : préparations de réactif

1. Faire 500 mL que Dulbecco modified Eagle moyen (DMEM) additionné avec 10 % FBS, la pénicilline et la streptomycine.
2. Faire le stock de 100 mM de la thymidine dans l’eau stérile et magasin en aliquotes à-80 ° C.

2. protocole d’imagerie cellulaire fixe de Progression mitotique (Figure 1 a)

1. Jour 1, semence ~ 2 x 10⁵ les cellules HeLa dans les puits d’une plaque de 6 puits avec une lamelle couvre-objet (stérilisé avec l’éthanol à 70 % et l’irradiation UV) et 2 mL de milieu DMEM. Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. 1 bloc de thymidine^st : au jour 2, mélanger soigneusement le volume requis de la thymidine dans les supports neufs de DMEM (100 mM stock, 2 mM concentration finale).
3. Ajouter 2 mL de thymidine contenant plaque de médias aux cellules dans chaque puits de la 6 puits et incuber pendant 18 heures.
4. Le jour 3, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 2 mL de solution 1 PBS x et une fois avec frais DMEM préchauffée ; la croissance de cellules dans un milieu DMEM préchauffée frais pendant 9 h libérer les cellules du bloc.
5. 2^nd thymidine bloc : encore une fois ajouter 2 mL de thymidine contenant médias (concentration finale de 2 mM) pour les cellules dans chaque puits de la plaque 6 puits.
6. Incuber pendant encore 18 h.
7. Jour 4, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec 2 mL de solution 1 PBS x et une fois avec frais DMEM préchauffée.
8. Réactif de transfection dans un milieu de croissance libre sérique séparément pendant environ 10 minutes et siRNAs diluée (contrôle et Cdt1) mélangez-les ensemble et incuber pendant 20 min à température ambiante. La concentration finale de siARN utilisé dans chaque transfection était de 100 nM. Ajouter le mélange réactionnel aux cellules qui ont été lavés de Thymidine.
9. Incuber à 37 ° C pendant 9-10 h libérer de bloquer et de fixer les cellules sur les feuillets de la couverture avec 4 % des cellules PFA pendant 20 min à température ambiante.
   ATTENTION : PFA est toxique, portez une protection appropriée.
10. Cellules réagissent, après perméabiliser avec du détergent de 0,5 % (v/v) pendant 10 min à RT et laver les cellules deux fois avec du PBS 1 x de 5 min chacun.
    1. Bloquer des cellules avec BSA 1 % (p/v) en solution de 1 PBS x pendant 1 h à RT suivie en traitant les cellules avec 50 µL d’anticorps primaires (anticorps de souris anti-α-tubuline dilué au 1 / 1 000, anticorps anti-Zwint1 de lapin dilué à 1 : 400 et la souris anti-phospho-ɣ H2AX dilué au 1 : 300) à 1 % (p/v) BSA dans du PBS 1 x pendant 1 h à 37 ^oC.
    2. Après avoir lavé les cellules avec solution 1 PBS x trois fois, traiter les cellules avec 50 µL d’anticorps secondaires pour chaque lamelle couvre-objet (Alexa 488 et Rhodamine Red à des dilutions de 1/250 à 1 % (p/v) : BSA en solution 1 PBS x) pendant 1 h à température ambiante.
    3. Après avoir lavé les cellules avec du PBS 1 x deux fois de 5 min chacun, traiter les cellules au DAPI (0.1µg / mL dans du PBS 1 x) pendant 5 min à température ambiante.
    4. Après avoir lavé les cellules avec du PBS 1 x deux fois de 5 min chacun, placez le couvre-objet face à des cellules pour les supports de montage approprié sur une lame microscopique clair.
11. Image les cellules pour les protéines de l’immunomarquage avec 60 X ou objectif à immersion à huile 100 X 1,4 NA Plan-apochromatique DIC montés sur un microscope confocal inversé de haute résolution équipé d’un appareil approprié, nécessaire à la qualité des images requises.
12. Acquisition d’images à température ambiante comme z-piles de 0,2 µm d’épaisseur à l’aide de logiciels appropriés pour le microscope.

3. le protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de Progression mitotique (Figure 3 a)

1. Jour 1, graines d’environ 0,5 à 1 x 10⁵ cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry-H2B et GFP-α-tubuline (légèrement variable basé sur le type de cellules et les protéines qu’ils expriment) en 35 mm verre fond plats avec 1,5 mL de milieu DMEM et cultivez-les dans une humidifié incubateur à 37 ^oC et 5 % de CO₂pendant 24 h.
2. 1 bloc de thymidine^st : au jour 2, ajouter 1,5 mL thymidine contenant des médias aux cellules dans le plat (thymidine 100 mM, concentration finale de 2 mM,).
3. Incuber pendant 18 heures.
4. Le jour 3, aspirer le milieu contenant la thymidine et laver les cellules trois fois, deux fois avec 2 mL de PBS 1 x et une fois avec frais DMEM préchauffée.
5. Réactif de transfection avec milieu de culture libre de sérum séparément pendant environ 10 minutes et siRNAs diluée (contrôle et Hec1) mélangez-les ensemble et incuber pendant 20 min à température ambiante. La concentration finale de siARN utilisé dans chaque transfection était de 100 nM. Ajouter le mélange réactionnel aux cellules qui ont été lavés de Thymidine.
6. La croissance de cellules dans 1,5 mL d’un milieu DMEM préchauffée frais pendant 8 h libérer les cellules du bloc.
7. 2^nd thymidine bloc : ajouter 1,5 mL thymidine contenant des médias (concentration finale de 2 mM) pour les cellules dans le plat.
8. Incuber pendant encore 18 h.
9. Jour 4, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois, deux fois avec 2 mL de PBS 1 x et une fois avec frais DMEM préchauffée. Puis la croissance de cellules en frais Leibovitz préchauffée de médium (L-15) additionné de 10 % FBS et 20 mM HEPES à pH 7,0 pendant 8 h libérer les cellules du bloc.
10. Placer le plat dans la chambre de contrôle de température dans le microscope confocal de haute résolution, qui a déjà été réglé au moins 30 min avant de commencer l’imagerie afin de stabiliser les températures sur scène et expérimentales.
11. Point dans le champ lumineux avec 60 x, objectif jusqu'à ce que les cellules soient visibles, puis tamiser manuellement la sur scène dans la région de choix.
12. Mettre en place la lumière et laser puissance/exposition, paramètres d’acquisition image et durée de l’expérience en utilisant le logiciel d’acquisition image microscope de choix. Utiliser des filtres pour GFP (excitation 488 ; émission à 385 nm) et mCherry (561 nm excitation et 385 nm d’émission) pour acquérir des images.
13. Réaliser l’expérience Time-lapse en acquérant séparément pulsée lumière transmise et fluorescence images toutes les 10 min pour une période allant jusqu'à 16 h.
14. Acquisition d’images comme douze 1,0 µm séparées z-avions à 9 h après la sortie du bloc double thymidine à l’aide de logiciels appropriés au microscope.
15. Analyser les images de progression mitotique des cellules individuelles de suivi et enfin assembler le film correspondant avec le logiciel de source Fidji/ImageJ.

Résultats

Étude de la progression mitotique et de la stabilité des microtubules dans les cellules fixées après la sortie de double bloc de thymidine
Cdt1 est impliqué dans les licences des origines de réplication de l’ADN en phase G1. Elle est dégradée au cours de la phase S mais re-s’accumule en phase G2/M. Afin d’étudier son rôle lors de la mitose, la Cdt1 endogène doit être épuisé spécifiquement à la phase de G/M en utilisant la technique de synchronisat...

Discussion

L’avantage essentiel de la synchronisation de la thymidine double, c’est qu’il fournit un échantillon accrue des cellules mitotiques dans une fenêtre de peu de temps avec plusieurs de ces cellules entrant dans la mitose à l’unisson, également permettant ainsi des analyses de l’alignement du chromosome, bipolaire avec un rendement beaucoup plus élevé d’axe formation et la ségrégation des chromosomes.

De nombreux complexes de protéine régulatrice et voies de signalisation s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 dilution
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Store at 4 °C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B	Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toxic, needs caution
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glass bottom dish	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope	Nikon Instruments
Spinning disc for confocal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser	Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements software	Nikon Instruments