JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, describimos un método de cultivo tridimensional para analizar la morfología de primario de mama las células cancerosas, así como para estudiar sus interacciones directa e indirecta con los monocitos y los resultados tales como la degradación de colágeno, reclutamiento de células inmunes de la célula invasión y la promoción de la inflamación relacionada con el cáncer.

Resumen

Incrustado en la matriz extracelular (MEC), células epiteliales normales y neoplásicas comunican íntimamente con las células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, así influir en gran medida resultado de homeostasis y enfermedad de tejido normal. En el cáncer de mama, los macrófagos asociados a tumor (TAMs) juegan un papel crítico en la progresión de la enfermedad, metástasis y recurrencia; por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de monocito chemoattraction el microambiente del tumor y sus interacciones con las células del tumor es importante para controlar la enfermedad. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de un sistema tridimensional (3D) de cocultivo de células de mama cancerosas (BrC) y monocitos humanos. BrC células producen altos niveles basales de la regulada en la activación, célula T normal expresado y secretado (RANTES), monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (G-CSF), mientras que en co-cultivo con monocitos, citoquinas proinflamatorias interleucina (IL) -1 beta (IL-1β) y IL-8 se enriquecieron con metaloproteinasas de matriz (MMP) -1, MMP-2 y MMP-10. Este microambiente del tejido conectador tumoral promovido resistencia a anoikis en MCF-10A 3D acinos-como las estructuras, chemoattraction de monocitos y la invasión de células agresivas de BrC. Los protocolos aquí presentados proporcionan una alternativa asequible para estudiar la comunicación intra-tumor y son un ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar a características específicas de la biología del tumor relacionado con tumor agresión.

Introducción

Biología del tumor es mucho más intrincado que pensó previamente. Creciente evidencia muestra que las células tumorales son más que un simple bulto de células proliferación incontroladas; por el contrario, diferentes células neoplásicas parecen realizar diferentes funciones mostrando la alta organización y jerarquía en el tumor1. Las células del tumor están también en íntima comunicación con las células no transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfocitos, adipocitos, células endoteliales, entre otras células están todos inmersos en el andamio proteínas y polisacáridos que constituyen el ECM. Numerosas interacciones directas e indirectas se establecen entre las células transformadas y no transformadas y con el ECM, que ejerce una poderosa influencia sobre la enfermedad resultado2,3. En el caso específico de BrC, es particularmente importante disecar la comunicación de las células de BrC con TAMs, teniendo en cuenta que se ha encontrado TAMs que juegan un papel crítico en la evolución del tumor, aumentando el riesgo de metástasis y recidiva de la enfermedad4 ,5.

Para analizar las interacciones intra tumoral y sus posibles resultados, nuevo 3D en vitro se han desarrollado en base a la utilización de extractos de ECM que proporcionan un microambiente mucho más complejo, más cercano a la realidad de la biología del tumor, en comparación a las culturas de célula monocapa convencional en el cual las células crecen pegadas al plástico. Petersen y Bissell6 proporciona el primer modelo de no malignas y células epiteliales mamarias malignas cultivan sobre una membrana basal de rico en laminina y fueron los primeros en describir las estructuras 3D organotypic que discriminan no malignas humanos células epiteliales de la mama de sus homólogos malignos. Una década más tarde, el modelo desarrollado por el Debnath, Muthuswamy, y Brujas7,8,9 proporciona una herramienta valiosa para aclarar las vías biológicas durante la transformación maligna de los acinos glandulares, tal como formación de acinos grande debido a la proliferación incontrolada, deslocalización de las proteínas de la ensambladura apretada como evidencia de la polarización celular deteriorada y la pérdida del lumen de los acinos como resultado de la resistencia celular a la anoikis, un tipo de muerte celular programada ocurre en células dependientes de anclaje cuando se separan del ECM circundante. Los modelos de Sameni, Jedeszko y Sloane se han centrado en imágenes actividad proteolítica por células, que está estrechamente relacionada con la invasividad, otro rasgo fundamental de la malignidad de tumor10,11,12. Estos modelos se basan en las matrices de proteína mezclados con los substratos de la proteína de fluorescencia apaga diferentes (gelatina de DQ, DQ-colágeno I y DQ-colágeno IV), en que las señales fluorescentes son indicativos de la degradación proteolítica de colágeno. Modelos 3D se utilizan también para estudiar propiedades de la célula de vástago de ambos no transformado y las células del tumor, en que celda agregados, también llamados esferoides, pueden ser cultivados en suspensión o en proteínas ECM como interrogando por mecanismos de diferenciación celular, asimétrica división celular, adhesión de célula a célula y célula motilidad13,14. Ensayos de invasión que la prueba de la agresividad intrínseca del tumor y la identificación de las moléculas que sirven como atrayentes durante el proceso invasor15. En generales, 3D modelos representan una diversificación asequible de en vitro cultivo celular que reflejan más de cerca la morfogénesis normal y oncogénicos de los tejidos.

Hemos diseñado un sistema de cocultivo celular 3D basado en los modelos antes mencionados7,10,11, utilizando ambos humanas líneas celulares BrC comerciales de conocido potencial agresivo (tipos luminales y triple negativo) y primaria células explantadas de pacientes de BrC. En primer lugar se desarrolló un modelo donde no agresivos (MCF-7) o agresivos (MDA-MB-231) BrC las células fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en un extracto de la matriz extracelular (ECME)-sistema basado en 3D que permite las interacciones célula-célula directa. Estas culturas Co fueron utilizadas para determinar cómo la comunicación entre estos linajes dos celulares influyó en la transcripción de un conjunto de genes relacionados con la conducta agresiva de cáncer. Se observó un aumento significativo de ciclooxigenasa-2 (COX-2) transcripción que coincidió con un aumento de la producción de uno de sus productos, prostaglandina E2 (PGE2), un hallazgo que puso de relieve el papel de la inflamación en la progresión del cáncer. Mayor transcripción de MMP también observó que correlaciona con una mayor proteólisis de colágeno cuando agresivo células MDA-MB-231 fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en culturas que contiene DQ-colágeno IV. De nota, nuestros co-cultivos no apoya el supuesto de que los mecanismos de interacción célula-célula son necesarias para la degradación de colágeno. Más bien, sugirió que la comunicación entre los linajes de dos células fue mediada por moléculas segregadas. Además, los sobrenadantes de estos ensayos de co-cultivo contienen factores solubles que desorganizan acinos glandulares formados por las células no transformadas MCF-10A13. Se constató que de agresivo y las células primarias de BrC secretadas niveles elevan de moléculas quimiotáctica de monocitos MCP-1, GM-CSF y RANTES. Por lo tanto, delineamos una cultura 3D en el que las células fueron separadas en célula cultura insertos para evitar las interacciones célula-célula. Estas culturas fueron utilizadas para abordar la comunicación indirecta entre monocitos y las células de la BrC. Para estos ensayos, no agresivos y agresivas comercial BrC las líneas celulares y las células primarias de BrC y tres tipos diferentes de monocitos humanos: las células U937 y THP-1 comerciales y primarios monocitos (PMs) aisladas de sangre periférica de donantes sanos (todos monocitos se utilizaron en un estado desactivado) fueron utilizados. Aumento de las concentraciones de citoquinas inflamatorias IL-1β y IL-8 fueron observado para ser enriquecido en co-cultivo. Asimismo, se encontró que MMP-1, MMP-2 y MMP-10 también se incrementaron en el BrC co-cultivos de células monocitos y así refuerzo anterior resultados14. En este manuscrito, se presenta un flujo de trabajo punto por punto de aislamiento primario de las células de BrC y pruebas en 3D culturas junto con resultados representativos. Este trabajo constituye un buen ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar aspectos específicos de la biología del tumor.

Protocolo

Se obtuvieron muestras de pacientes de BrC desde el Banco de tejidos de la Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Este estudio fue aprobado por la científica, ética y bioseguridad revisan tablas del Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, en Comité de Ética Investigación y Comité de Bioseguridad. Todos los pacientes se incluyeron prospectivamente y fueron informados sobre la naturaleza del estudio: aquellos que estén dispuestos a participar firmaron un consentimiento informado antes de la recogida de la muestra y fueron tratados según las pautas éticas y la mejor clínica de la institución. La identidad de los participantes fue anonimizada para la duración del estudio. Pacientes incluidos fueron diagnosticados con carcinoma ductal infiltrante, grado histológico 2 y etapa clínica II, con no anterior neoadyuvante antes de la resección de tejido. Pacientes eran toda la hembra edad media 56,8 años (rango 42 a 75)14.

1. cultivos celulares 3D

  1. Semilla 0.1 x 106 MCF-10A las células o las células primarias de BrC en frascos de cultivo 25 cm2 con medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 5% caballo suero, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, toxina del cólera 100 ng/mL, hidrocortisona 0.5 μg/mL, 10 μg/mL la insulina y 20 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico (EGF). Semilla 0.1 x 106 comercial BrC células, las células MCF-7 y MDA-MB-231 células en 75 cm2 cultura matraces con medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL. Incubar a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  2. Después de 48 h, lavar la monocapa de células con 10 mL de estéril 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Trypsinize la monocapa de células con 3 mL de solución de 0.05% tripsina y 0,48 mM ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 5-10 min a 37 ° C. Añadir 200 μL de suero correspondiente para parar la tripsinización y 7 mL de medio sin suplementos. Resuspender las células mediante pipeteo y sacar una alícuota de 10 μL para contar las células en una cámara de Neubauer.
  3. En cada pocillo de un sistema de diapositivas cámara de 8 pozos, difundir una base de 40 μl de ECME puro, seguido de una incubación de 30 min a 37 ° C.
  4. En cada pocillo, lugar 800 células suspendidas en 400 μL de DMEM/F12 (sin rojo de fenol) suplió como en el paso 1.1 pero con los siguientes cambios: las células primarias de BrC y células de MCF-10A, añadir 4 ng/mL de EGF y 2% ECME; para MCF-7 y MDA-MB-231, añadir sólo 2% ECME.
  5. Incubar los cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Reemplazar el medio de cultivo cada 48 h.
  6. Registro morfológico cambios de células cada 24 h durante 15 días con un microscopio óptico. Para analizar la morfología de BrC primario las células MCF-10A y las células MDA-MB-231 son buena referencia líneas celulares para ejemplos de formación acinar ordenada y desordenadas agresivo cáncer-como las estructuras, respectivamente.
  7. Obtención de imágenes de células en microscopia de campo claro en 100 X y 200 X de magnificación y comparar la morfología celular con referencia MCF-10A y líneas de células MDA-MB-231 (figura 1).

2. obtención de células de cáncer primario del tejido tumoral

Nota: Para obtener las células epiteliales del tumor utilizan tejido resecados tumores primarios de los pacientes de BrC no terapia neoadyuvante previo; evitar áreas necróticas y trabajar con un mínimo de 0,5 cm3 del tejido del tumor.

  1. Enjuague el tejido del tumor con PBS 1 x estéril y mecánicamente la desagregación con un bisturí en fragmentos de 1-2 mm.
  2. Digerir el tejido en un frasco de vidrio estéril de 20 mL con tapa por 2 h a temperatura ambiente (RT) con 2 mL de la solución siguiente: mezclar 1 mg/mL colagenasa tipo I y 100 hialuronidasa U/mL de DMEM/F12 medio contiene 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina , con agitación constante.
  3. Filtrar la suspensión resultante a través de piezas estériles de tul para eliminar grandes trozos de tejido sin digerir. Luego filtrar la suspensión de células a través de una membrana de poro μm 100 esterilizada.
  4. Sedimenten las células a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente y lavar dos veces con PBS 1 x estéril. Células en cultivo primario en medio DMEM/F12 suplementado con 5% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, toxina del cólera de 100 ng/mL, 0,5 de μg/mL hidrocortisona, insulina μg/mL 10 y 20 ng/mL de EGF. Cambiar el medio cada 48 h. mantener cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  5. Asegúrese de que las células aisladas son células epiteliales con un protocolo estándar de immunocytochemistry14. Prueba tres marcadores epiteliales: un panel de citoqueratinas (PanCK), 1 de mucina (Muc-1) y molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM).

3. aislando las PM células de sangre periférica

  1. Extracto de aproximadamente 40 mL de sangre periférica de un sano voluntario, diluir la sangre en una proporción de 1:3 con PBS estéril libre de endotoxinas 1 x y someterlo a una separación del gradiente de densidad.
  2. En un tubo cónico, Coloque 2 mL de un medio de polysucrose y sodio Diatrizoato con una densidad de 1,077 g/mL. Lenta y cuidadosamente el recubrimiento 8 mL de sangre diluida. Centrifugar por 30 min, 765 g de x en el uso de RT. la menor velocidad de aceleración-desaceleración de la centrifugadora.
    Nota: Después de la centrifugación, se formará cuatro capas de abajo hacia arriba: el sedimento de células de sangre rojas, la capa media gradiente de densidad, la capa de células mononucleares (aparece como un fino anillo blanco) y la capa de plasma.
  3. Recuperar la capa de células mononucleares de la pendiente con una pipeta Pasteur estéril y lavar tres veces con PBS 1 x, cada vez seguida por centrifugación lenta (430, 275 y 191 x g) durante 10 min a TA.
  4. Utilizar protocolos de selección negativa para evitar la activación de las células. Un ejemplo de dicho protocolo es el siguiente:
    1. Lavar las células mononucleares una vez con una solución de tampón de lavado (0.5% albúmina de suero bovino, 2 mM EDTA en PBS 1 x). Contar las células en una cámara de Neubauer y ajustarlos a una densidad de 1 x 107 células/30 μl de una solución.
    2. Para cada 1 x 107 células, añadir 10 μl de un FcR bloqueo reactivo y 10 μl de un cóctel de biotina anticuerpo de monocitos que contiene anti-humanos CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 y glicoforina A (incluido en los kits comerciales).
    3. Mezclar las células e incubar por 15 min a 4 ° C. Agregar un adicional de 30 μl de la solución tampón de lavado más 20 μl de anti-biotina microbeads (incluido en el kit); mezclar las células e incubar por 20 min a 4 ° C.
    4. Lavado las células una vez con una solución tamponada, centrifugar a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente y resuspender en 1,5 mL de tampón de solución para la separación magnética.
    5. Carga de la suspensión de células en una columna de separación magnética previamente enjuagada y añadir 7 mL de solución tamponada. Recoger la fracción enriquecida de monocitos en un tubo cónico de 15 mL, contar las células y si no se cultiva inmediatamente, congelar monocitos con una densidad de 2 x 106 células/1 mL de DMEM/F12 suplementado con 50% FBS y 10% DMSO a −80 ° C.
      Nota: Evitar el uso de monocitos después de más de 2 meses de congelación, ya que puede verse comprometida su viabilidad.
  5. Mantener culturas de PMs en medio DMEM/F12 suplementado con 6% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  6. Realizar cada serie de experimentos utilizando a PMs de al menos dos diferentes donantes independientemente, como agrupación monocitos de donantes diferentes pueden resultar en la activación de monocitos.

4. establecer 3D culturas Co

  1. Co-cultivos 3D con interacción indirecta
    Nota:     realizar estos ensayos en placas de 24 pocillos fondo plano cultura mediante policarbonato celular cultura insertos con membranas de 0.4 μm tamaño de poro. En este ensayo, sobrenadante y las células se pueden recuperar al final del experimento.
    1. Cultivar 2 x 106 U937 y THP-1 monocitos en 10 mL de Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 1% antibiótico/antimicótico y cultivar PMs frescos en medio DMEM/F12 suplementado (como indicado anteriormente en paso 3.5), a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 medio ambiente.
    2. Placa 4 x 105 monocitos en 1 mL/pozo de su medio correspondiente (suplementado con 2% ECME y 2% FBS para monocitos U937 y THP-1, o 2% ECME y 6% FBS para PMs).
    3. Coloque una en cada pozo y añadir 0,9 mL de 4 x 105 suspensión de células de BrC en el medio correspondiente (complementado con 2% ECME y 2% FBS para líneas celulares comerciales o 5% caballo suero de las células primarias de BrC). Vuelva a colocar la mitad de medios total cada 48 h.
    4. Incubar a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente por 5 días y recuperar el sobrenadante. Para recuperar las células tripsinización si se realiza el análisis subsecuente.
    5. Incluyen controles de culturas de célula individual con los medios respectivos.
  2. Co-cultivos 3D con interacción directa
    1. Etiqueta las células BrC y monocitos con diferentes tintes fluorescentes antes de cultivo celular para permitir la clasificación independiente de cada linaje de la célula después de la cultura para el análisis de la expresión de mRNA y proteína. Utilizar comercialmente disponibles derivados de la cumarina y rodamina que pasan libremente a través de la membrana celular de las células vivas. Un protocolo general para el etiquetado es la siguiente:
      1. Preparar una monocapa de células de BrC de interés (2 × 106 células en un frasco de cultivo de 25 cm2 ) y reemplazar el estándar medio con suficiente con solución de trabajo del tinte fluorescente (1:2, 000 de colorante fluorescente en el medio de base estándar sin ningún suplemento). Incubar 30 min a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Aspirar la solución de colorante y lavar suavemente con suficiente PBS 1 x. Aspire el PBS y añadir el estándar medio.
      2. Trypsinize la monocapa de células con 2 mL de una solución de 0.05% tripsina y 0,48 mM EDTA durante 5-10 min a 37 ° C. Añadir 200 μL de FBS para parar la tripsinización y 7 mL de medio correspondiente sin suplementos. Resuspender las células mediante pipeteo. Tomar una alícuota de 10 μL para contar las células en una cámara de Neubauer. Continuar con el protocolo de cooperación cultura después de recuento celular.
      3. Sedimenten las células a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente (realizar esto primero desde monocitos crecen en suspensión). Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las células con 3 mL de una solución de trabajo de precalentado del tinte fluorescente (1:2, 000 de colorante fluorescente en un medio base estándar sin suplementos). Incubar durante 30 min a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
      4. Sedimenten las células otra vez, deseche la solución colorante y resuspender suavemente con 5-7 mL de PBS 1 x. Una vez más de la pelotilla, descartar el PBS y resuspender las células en 5-7 mL de medio estándar. Tomar una alícuota de 10 μl de suspensión celular para contar las células en una cámara de Neubauer. Continuar con el protocolo de cooperación cultura después de recuento celular.
    2. Establecidas en la cultura Co:: extensión suficiente ECME en el fondo del pozo para formar una capa uniforme en cada pocillo de un sistema de diapositivas cámara de 4 pozos. 20 μl de una suspensión unicelular que contiene 5 × 105 etiquetado BrC células por pocillo de la placa.
    3. Después de 15-20 min de incubación a 37 ° C, agregar una suspensión de 2.5 x 105 etiquetado monocitos en 80 μl de medio de ensayo (con 60% ECME).
    4. Permiten ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    5. Añadir 1 mL de una mezcla 1:1 de las células de la BrC y medios de cultivo de monocitos.
    6. Incubar los co-cultivos a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente por 24 h, 48 h o 5 días para seguimiento de los cambios en diferentes puntos temporales.
    7. Degradan las proteínas de la ECM para recuperar las células de las culturas. Aspirar y descartar el medio añada 0,5 mL de PBS 1 x con tripsina 0.1% y 0.25% EDTA e incubar durante 3 h a 37 ° C. Después de la incubación, Añadir 0,5 mL de PBS 1 x con 10% FBS para neutralizar la tripsina y resuspender las células mediante pipeteo vigorosamente para obtener una suspensión unicelular.
    8. Pelotilla células a 765 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x con 10% FBS. Repita este paso una vez.
    9. Someter la suspensión celular a celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación con el instrumento adecuado. Asegúrese de que las poblaciones finales son por lo menos 95% de pureza).
    10. Después de clasificar, lavar las células con PBS estéril 1 x, diábolo (430 x g durante 5 min a temperatura ambiente) y resuspender en estéril de 1 x PBS. Las células pueden ser procesadas según los protocolos específicos para aislamiento de RNA o proteína análisis.
    11. Repetir cada ensayo tres veces, incluyendo culturas 3D de cada linaje de la célula individual como controles.
  3. Interacción directa de co-cultivos 3D para evaluar la degradación del colágeno
    1. Establecer cultivos Co celulares 3D como se describe en el paso 4.2, con el paso adicional de agregar 32,5 μg/mL de colágeno de tipo IV marcado con isotiocianato de fluoresceína para la ECME. La concentración final de colágeno IV en la ECME es 0.5%. Crecer los cultivos en un cubreobjetos de 35 mm en un platos de Petri.
    2. Extender una capa de 40 μl de ECME en la parte inferior de la caja Petri. Permiten ECME solidificar a 37 ° C.
    3. Añadir 2,5 x 105 células de BrC en 10 μl del medio y permiten a las células a establecerse.
    4. Agregar una suspensión de 1,25 x 105 U937 monocitos en 40 μl de medio de ensayo (complementado con 60% de DQ-colágeno IV etiquetado-ECME).
    5. Permiten ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    6. Añadir 2 mL de una mezcla 1:1 de las células de la BrC y medios de cultivo de monocitos.
    7. Incubar los cultivos Co 5 días a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente. Reemplazar el medio de cultivo cada 48 h.
    8. Analizar la emisión de fluorescencia en un microscopio de barrido confocal y medir la densidad óptica integrada (IOD) por 50 μm2 de cultura. Comparar IODs contra culturas individuales y la cultura en el tiempo cero (figura 2).

5. Análisis de sobrenadantes de 3D culturas conjuntamente con interacción indirecta

  1. Después de 5 días de cocultivo, recuperar los sobrenadantes de la parte superior y los compartimentos inferiores de los co-cultivos 3D y de los controles individuales cultura 3D. Mezclar bien cada sobrenadante mediante pipeteo. Alícuota y guarde el sobrenadante a −20 ° C hasta su uso (hasta un mes).
    Nota: Mantenga sobrenadantes en el ° C −80 si almacenamiento será más de un mes.
  2. Analizar los sobrenadantes con multiplexación plataformas de ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) o inmunoensayos basados en grano siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.
    Nota: Sobrenadantes pueden ser también analizadas por Western blot o concentradas a través de filtros de poro determinado para obtener fracciones de proteína de tamaño enriquecido para realizar zymography análisis16,17. Alternativamente, use los sobrenadantes como medio acondicionado para otros experimentos, como se describe a continuación. Medio condicionado se obtiene generalmente de un cultivo de 5 días (figura 3).

6. Caracterización de los efectos de sobrenadantes de células BrC primario en formación de acinos y estructura de los acinos

  1. En cada pozo de una diapositiva 8-pozo cámara sistema extensión base 40 μl de ECME y deja solidificar por 30 min a 37 ° C.
  2. MCF-10A, semilla 800 células/pozo en 400 μL de medio de cultivo suplementado DMEM/F12, tal como se describe en el paso 1.2.
  3. Añadir 400 μL de medio condicionado o medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con 20 ng/mL de IL-1β recombinante humana.
  4. Coloque el portaobjetos de la cámara en un plato de petri de vidrio que contiene un plato de petri de 35 mm con 2 mL de PBS para crear un ambiente de humedad.
  5. Sustituir lo medios de comunicación/sobrenadante cada 48 h.
  6. Registro formación de acinos glandulares cada 24 h durante 14 días con un microscopio óptico.
  7. Después de 14 días de cultivo, tinción acinos con 100 μl de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a una concentración de 100 nM de 1 x PBS para observar los núcleos de célula. Incubar durante 25 min a temperatura ambiente en agitación constante. Enjuague tres veces con 1 x PBS durante 5 minutos, cada vez que en constante agitación en RT. Monte los preparativos con un medio de montaje específico para la tinción fluorescente. Selle con esmalte transparente y mantener protegido de la luz a 4 ° C.
  8. Los acinos a analizar con un microscopio confocal de tomar imágenes de las pilas transversales a diferentes profundidades de los acinos (figura 4A, B, C).
  9. Visualizar diferentes proteínas celulares de los acinos con adecuados protocolos de tinción. Por ejemplo, E-cadherina fue manchado para evaluar adherencia de célula a célula, polaridad celular y formación de luz18 (figura 4D).

7. ensayos de migración

Nota: Realizar ensayos de migración de U937, PMs THP-1 y frescos en placas de 24 pocillos fondo plano cultura con policarbonato celular cultura insertos con membranas de tamaño de poro de 8 μm. Previamente se demostró que las quimiocinas GM-CSF, MCP-1 y RANTES se encontraron secretada en altas concentraciones en culturas individuales 3D de las líneas de células agresivas de BrC. Se propuso que estas citoquinas fueron fundamentales para la atracción de monocitos al sitio del tumor primario; Esto fue probado en ensayos de migración mediante las citoquinas como atrayentes.

  1. Cultura U937, PMs THP-1, o frescos como se describe en el paso 4.1.1.
  2. Enjuague una vez cada parte movible con 200 μL de RPMI 1640 sin sueros para hidratación de la membrana.
  3. Llenarlo con 50 μl de ECME frío, colocar los insertos en una placa de 24 pocillos fondo plano cultura y permitir la ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Añadir 180 μl de RPMI sin SFB en el compartimiento superior de la placa. Añadir en la cámara baja sin burbujas 800 μl de RPMI suplementado con cualquiera 100 ng/mL de GM-CSF, MCP-1 y RANTES como chemoattractant. Medio de uso sin las citoquinas como control negativo. Incubar durante 30 min a 37 ° C para establecer un gradiente de chemokine.
  5. Lugar 1.5 x 105 de cada tipo de monocitos en un tubo estéril, Lave dos veces con 1 mL de 1 x PBS y centrifugue a 430 x g durante 5 minutos a monocitos RT. resuspender en 20 μl de RPMI sin SFB, colocarlos en los insertos de y con mucho cuidado homogeneizar la suspensión de células (el volumen final de la sala superior es 200 μL).
  6. Permitir la migración de celulares al progreso durante 24 h a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
    Nota: Como los monocitos son no adherentes, las células migratorias será generalmente en los medios de comunicación del compartimento inferior.
  7. Quitar los insertos, recuperar los medios de comunicación y contar las células en 2, 4, 6 y 24 h con una cámara de Neubauer o un citómetro de flujo; como alternativa, especialmente si no hay células se encuentran en los medios de comunicación, adquisición de imágenes de la parte inferior de los rellenos con una cámara digital. La cuenta media de la célula de 3 campos al azar (con 100 aumentos) se utiliza para el análisis (figura 5).

8. invasión de ensayos

Nota: Realizar ensayos de invasión de las células de BrC en placas de 24 pocillos fondo plano cultura mediante policarbonato celular cultura insertos con membranas de tamaño de poro de 8 μm. En nuestros estudios originales, IL-8 fue una de las citoquinas enriquecidas en los sobrenadantes de las BrC/monocito célula 3D co-cultivos. Estaba probado si esta citoquina fue participar en la invasión de las líneas celulares de BrC.

  1. Expandir las células BrC en frascos de 75 cm2 . MCF-7, T47D, HS578T y MDA-MB-231 como describen en el paso 1.2 (pero sin ECME) y las células primarias de BrC como se describe en el paso 2.4.
  2. Lavar una vez cada cultivo de células de membrana de policarbonato 8 μm de poro Inserte con 200 μL de medio sin suero (el medio utilizado depende de la línea de celular probada) para hidratar la membrana.
  3. Llene el inserto con 50 μl de ECME frío (medio de dilución 1:4 ECME:cold sin SFB), colocar los insertos en una placa de 24 pocillos fondo plano cultura y permitir la ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Una vez que ha polimerizado la ECME, añadir 180 μl de los medios respectivos de la célula sin SFB. Añadir 800 μl los medios de comunicación sin SFB a través de las ranuras de la estufa. Incubar durante 30 min a 37 ° C para establecer un gradiente de IL-8.
    Nota: Evitar la creación de burbujas en los medios de comunicación. Los medios utilizados es sin SFB pero suplementados con 100 ng/mL de IL-8 como un chemoattractant, o puro medio sin SFB, como controles negativos.
  5. Obtener un total de 6 x 105 células de cada línea celular como sigue:
    1. Deseche el sobrenadante de enjuague una vez con 10 mL de PBS 1 x y añadir 2 mL de EDTA 0.05% tripsina/0.48 mM por 2 min a 37 ° C para separar las células. Añadir 4 mL de medio suplementado para detener la reacción de tripsina y agite vigorosamente por pipeteo.
  6. Tomar 10 μl alícuota de la suspensión celular para contar las células en una cámara de Neubauer. Tomar un volumen de suspensión celular que contiene 6 x 105 células. Centrifugue a 430 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lave las células en 1 mL de PBS 1 x. Repita el enjuague una vez más.
  7. Resuspender las células en 20 μl de los respectivos medios de comunicación sin SFB y lugar en los insertos que contiene 180 μl de los respectivos medios de comunicación sin SFB. Homogeneizar cuidadosamente la suspensión de células mediante pipeteo.
  8. Permite la invasión de la célula al progreso durante 48 h a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 ambiente.
  9. Después de 48 h, quitar el relleno, deseche el sobrenadante y lavar el inserto una vez muy cuidadosamente con 200 μL de PBS 1 x. Con un aplicador con punta de algodón, retirar el exceso de PBS.
    Nota: Las células invasoras se unen generalmente al otro lado de la estufa como en este caso donde las células adherentes.
  10. Fijar las células por colocar en un pocillo de una placa de 24 pocillos fondo plano cultura que contiene 1 mL/pozo de paraformaldehído al 4% durante 15 min a TA. después, enjuague los insertos una vez con PBS 1 x.
  11. Las células de la mancha por colocar en un pocillo de una placa de 24 pocillos fondo plano cultura que contiene 1 mL/pozo de 1 x PBS con 0.2% de cristal violeta durante 45 min a RT. con cuidado, con un Quite de aplicador con punta de algodón todos lo ECME desde la parte superior de la membrana , que contiene las células que no migran y enjuague cuidadosamente con agua destilada para evitar eliminar fija las células invasoras.
  12. Contar las células invasoras mediante la observación de la parte inferior de la pieza de inserción bajo el microscopio invertido. Se utiliza la cuenta de la célula media de 3 campos al azar (con 100 aumentos). En casos donde las células han invadido como racimos y son difíciles de contar individualmente, adquirir imágenes de 3 campos al azar (con 100 aumentos) con una cámara digital. Analizar las imágenes con software para análisis de imágenes y la IOD para cuantificar la invasión celular (figura 6).

Resultados

Análisis morfológico de las células de BrC en culturas 3D:

La morfología de las células primarias de BrC en culturas 3D en altas y bajas densidades fue estudiada durante 5 días. Durante las primeras 48 h, las células se adhieren a la ECME y mantienen una baja densidad. En este momento, se puede claramente apreciar que las células presentan una forma alargada del huso-como, algunos con dos o más proyecci...

Discusión

Las células epiteliales crecen en una conformación espacial 3D y su interacción con las proteínas de la ECM es fundamental para la homeostasis del tejido. Se han basado muchos estudios de cáncer en las células cultivadas en monocapas (2D) y aunque han sido fundamentales para entender muchos aspectos de la formación del tumor y la progresión, monocapas no recapitular las características que impone el ECM en las células, para ejemplo: limitación de la proliferación, supervivencia dependiente de la adhesión cel...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE proyecto Nº 233061 a Ezequiel M. Fuentes-etorno y Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (proyecto número HIM-2014-053). NA de Espinoza Sánchez es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y recibió beca 231663 de CONACYT. E S NA, también reconoce el apoyo financiero proporcionado por el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317Non-transformed breast cell line
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22Breast Cancer Cell line
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133Breast Cancer Cell line
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 mediumGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L glucose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotic/AntimycoticGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine SerumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Horse serum GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered SalineGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisoneSIGMA-ALDRICHH088-5G
Cholera toxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Crystal-violetHycel México541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable supports (inserts)Corning Inc34226.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts)Thermofisher Scientific1406206.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)Nalge Nunc International177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishesMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Referencias

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Cultura de Biolog a del c ncern mero 131tres dimensiones 3Dextracto de matriz extracelular ECMEde la cultura Co sistema de comunicaci n de microambiente del tumorel c ncer de mama BrCmonocitosmalignidad tumoral

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados