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Résumé

Nous décrivons ici une méthode de culture en trois dimensions pour analyser la morphologie des principales cellules cancéreuses du sein, aussi bien quant à étudier leurs interactions directes/indirectes avec les monocytes et les résultats tels que la dégradation du collagène et le recrutement de cellules immunitaires, cellules invasion et la promotion de l’inflammation liée au cancer.

Résumé

Incorporé dans la matrice extracellulaire (ECM), cellules épithéliales normales et néoplasiques communiquent intimement avec des cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques, influençant ainsi grandement issue de l’homéostasie et la maladie les tissus normaux. Dans le cancer du sein, les macrophages associées à la tumeur (EAPV) jouent un rôle essentiel dans la progression de la maladie, métastases et récidives ; par conséquent, la compréhension des mécanismes de monocyte chimioattraction le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules tumorales est importante pour lutter contre la maladie. Ici, nous fournir une description détaillée d’un système en trois dimensions (3D) de co-culture de cellules mammaires humaines cancéreuses (BrC) et les monocytes humains. BrC cellules produisent des niveaux élevés de basales de réglementé sur activation, lymphocytes normal exprimé et sécrétée (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes et macrophages (G-CSF), tandis qu’en co-culture avec des monocytes, cytokines pro-inflammatoires interleukine (IL) -1 bêta (IL-1β) et IL-8 ont été enrichis avec les métalloprotéinases matricielles (MMP) -1 et MMP-2, MMP-10. Ce micro-environnement de stroma tumoral promu résistance à anoikis MCF-10 a 3D structures ressemblant à des acini, chimioattraction des monocytes et invasion des cellules agressives de BrC. Les protocoles présentés ici offrent une alternative abordable pour étudier la communication intra-tumeur et sont un exemple du grand potentiel qui fournissent des systèmes in vitro de cellule 3D pour interroger les fonctionnalités spécifiques de biologie tumorale, liés à la tumeur agression.

Introduction

Biologie de la tumeur est beaucoup plus complexe qu’on ne le pensait. Montage des éléments de preuve montre que les cellules tumorales sont plus qu’une simple en vrac des cellules en prolifération incontrôlées ; différentes cellules néoplasiques semblent plutôt, effectuer différentes fonctions affichage haute organisation et hiérarchie au sein de la tumeur1. Les cellules tumorales sont également en communication intime avec les cellules non transformées : macrophages, lymphocytes, adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, les autres cellules sont tous plongés dans l’échafaud protéines et des polysaccharides qui constituent l’ECM. Nombreuses interactions directes ou indirectes sont établies entre les cellules transformées et non transformées et l’ECM, qui exerce une puissante influence sur le résultat de la maladie2,3. Dans le cas précis du BrC, il est particulièrement important de disséquer la communication des cellules BrC avec TAMs, considérant que TAMs ont été trouvés à jouer un rôle crucial dans l’évolution de la tumeur, augmentant le risque de métastases et de réapparition de la maladie4 ,,5.

Pour analyser les interactions intra-tumorale et leurs résultats possibles, nouvelles approches 3D in vitro ont été développés basée sur l’utilisation d’extraits de ECM qui fournissent un micro-environnement beaucoup plus complex, plus proche de la réalité de la biologie tumorale, en comparaison de les cultures de cellules de monocouche conventionnel dans lequel les cellules se développent attaché au plastique. Petersen et Bissell6 fourni le premier modèle de non malins et cellules épithéliales mammaires malignes cultivées sur une membrane de sous-sol riche laminine et furent les premiers à décrire les structures 3D organotypique discriminatoires à l’homme non malins cellules épithéliales mammaires de leurs homologues malignes. Une décennie plus tard, le modèle développé par Delphine, Muthuswamy, et Brugge7,8,9 a fourni un outil précieux pour élucider les voies biologiques compromises au cours de la transformation maligne des acini glandulaires, telle formation de grandes acini en raison de la prolifération incontrôlée, délocalisation des protéines de jonction serrées comme preuve de la polarisation de la cellule avec facultés affaiblies et perte de lumière des acini en raison de la résistance de la cellule à anoikis, un type de mort cellulaire programmée qui se produit dans Anchorage-dépendante des cellules quand ils se détachent de l’ECM environnante. Les modèles de Sloane, Jedeszko et Michael Schumacher ont mis l’accent sur l’activité protéolytique d’imagerie de cellules, qui est étroitement liée au caractère envahissant, un autre trait essentiel de tumeur maligne10,11,12. Ces modèles s’appuient sur des matrices de protéines mélangés avec des substrats protéiques trempé à fluorescence (DQ-gélatine, DQ-collagène I et IV DQ-collagène), dans quels signaux fluorescents sont révélateurs de la dégradation protéolytique du collagène. Modèles 3D sont également utilisés pour étudier les propriétés des cellules souches des deux non transformées et les cellules tumorales, dans quelle cellule agrégats, aussi appelées sphéroïdes, peuvent être cultivées en suspension ou en protéines ECM interroger pour les mécanismes de la différenciation cellulaire, asymétrique la division cellulaire, l’adhésion cellule-cellule et cellule motilité13,14. Analyses d’invasion permettent de tester l’agressivité intrinsèque de la tumeur et l’identification des molécules qui servent de chimioattractants durant le processus invasif15. Dans l’ensemble, 3D modèles représentent une diversification abordable in vitro de culture de cellules qui se rapprochent davantage la morphogenèse des tissus normaux et oncogènes.

Nous avons conçu un système de co-culture de cellule 3D basé sur les modèles susmentionnés7,10,11, les deux humains lignées de cellules BrC commercial potentiel agressif connu (types luminales et triple négatif) et primaire cellules explantées de BrC patients. Nous avons d’abord développé un modèle où non agressifs (MCF-7) ou agressifs (MDA-MB-231) BrC cellules ont été conjointement cultivés avec U937 monocytes dans un extrait de la matrice extracellulaire (ECME)-système 3D qui a permis des interactions directes de cellule-cellule. Ces cultures co ont été utilisées pour déterminer comment la communication entre ces deux lignées deux cellulaires influencé la transcription d’un ensemble de gènes associés à un comportement agressif du cancer. A observé une augmentation significative de cyclo-oxygénase-2 (COX-2) transcription, qui a coïncidé avec une augmentation de la production d’un de ses produits, la prostaglandine E2 (PGE2), une constatation qui a mis en évidence le rôle de l’inflammation dans la progression du cancer. Transcription accrue de MMP a également observée qu’en corrélation avec la protéolyse de collagène plus grande lorsque les cellules MDA-MB-231 agressifs ont été cultivées conjointement avec U937 monocytes dans DQ-collagène IV contenant des cultures. À noter, nos cultures co n’appuient pas l’hypothèse que les mécanismes d’interaction cellule-cellule sont nécessaires pour la dégradation du collagène. Il a plutôt suggéré que la communication entre les lignées de deux cellules était médiée par des molécules sécrétées. En outre, les surnageants récoltées sur ces tests de co-culture contenaient des facteurs solubles qui désorganisé des acini glandulaires formés par non transformées de cellules de MCF-10 a13. On a constaté qu’agressifs et des cellules primaires de BrC sécrétées des niveaux élevés de molécules chimiotactiques monocytes MCP-1, GM-CSF et RANTES. Ainsi, nous avons présenté une culture 3D dans lequel les cellules ont été séparés dans les inserts de culture cellulaire afin d’éviter les interactions cellule-cellule. Ces cultures ont été utilisées pour traiter la communication indirecte entre cellules BrC et les monocytes. Pour ces tests, lignées cellulaires non agressifs et agressives BrC commerciales et des cellules primaires de BrC et trois différents types de monocytes humains : les cellules U937 et THP-1 commerciales et les monocytes primaires (PMs) isolées du sang périphérique de donneurs sains (tous monocytes ont été utilisées dans un État non activé) ont été utilisés. Augmentation des concentrations de cytokines inflammatoires IL-1β et IL-8 ont été observées à s’enrichir en co-culture. De même, il a été constaté que les MMP-1 et MMP-2, MMP-10 ont été également augmentés dans le BrC cellules-monocyte co-cultures et donc l’armature précédentes conclusions14. Dans ce manuscrit, un flux de travail point par point d’isolement de cellules primaire BrC et essais en cultures 3D est présenté ainsi que des résultats représentatifs. Cet ouvrage constitue un bon exemple du grand potentiel qui fournissent des systèmes in vitro de cellule 3D pour interroger des aspects spécifiques de la biologie de la tumeur.

Protocole

Les échantillons de patients BrC ont été extraites de la Banque de tissus de la Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Cette étude a été approuvée par les scientifiques, éthiques et biosécurité examen des conseils d’administration de l’hôpital Infantil de México Federico Gómez : Comité de Investigación, de Comité de Ética en Investigación et de Comité de Bioseguridad. Tous les patients ont été inscrits de façon prospective et ont été informés de la nature de l’étude : tous ceux qui souhaitent participer signé un consentement éclairé avant le prélèvement et ont été traités selon les lignes directrices éthiques et meilleures pratiques cliniques de l’institution. L’identité des participants pour la durée de l’étude a été rendues anonymes. Les patients inclus ont été diagnostiqués avec un carcinome canalaire infiltrant, grade histologique 2 et stade clinique II, avec aucune thérapie néoadjuvante précédente avant la résection de tissus. Les patients étaient toutes les femmes âgées en moyenne 56,8 ans (plage de 42 à 75)14.

1. 3D Cell Cultures

  1. Semences 0,1 x 106 MCF-10 a cellules ou des cellules primaires de BrC en flacons de culture 25 cm2 avec milieu de culture DMEM/F12 additionnée de 5 % à cheval serum, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 100 ng/mL de toxine de choléra, hydrocortisone 0,5 µg/mL, 10 µg/mL l’insuline et 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF). La culture semences 0,1 x 106 commerciaux BrC cellules, cellules MCF-7 et les cellules MDA-MB-231 dans 75 cm2 flacons avec milieu de culture DMEM/F12 additionné de 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 µg/mL. Incuber à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
  2. Après 48 h, rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de stérile 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Trypsinize de la monocouche cellulaire avec 3 mL de solution de 0,05 % trypsine et 0,48 mM l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 à 10 min à 37 ° C. Ajouter 200 µL de sérum correspondant à arrêter la trypsinisation et 7 mL de milieu sans suppléments. Remettre en suspension les cellules de pipetage et enlever une partie aliquote de 10 µL à compter les cellules dans une chambre de Neubauer.
  3. Dans chaque puits d’un système de glissière de 8 puits chambre, répandre une base de 40 µL de pure ECME, suivie d’une incubation de 30 min à 37 ° C.
  4. Dans chaque puits, placer 800 cellules resuspendues dans 400 µL de DMEM/F12 (sans rouge de phénol) complété comme à l’étape 1.1 mais avec les modifications suivantes : pour les cellules primaires de BrC et les cellules MCF-10 a, ajouter 4 ng/mL d’EGF et 2 % ECME ; MCF-7 et MDA-MB-231, seulement ajoutez 2 % ECME.
  5. Incuber les cultures à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement. Remplacer des milieux de culture toutes les 48 h.
  6. Enregistrement morphologique change de cellules toutes les 24 h pendant 15 jours avec un microscope optique. Pour analyser la morphologie de la CCFC primaire des cellules, les MCF-10 a et les cellules MDA-MB-231 sont lignées cellulaires bonne référence pour obtenir des exemples de formation acineuse ordonnée et désordonnées agressive du cancer comme structures, respectivement.
  7. Obtenir des images des cellules en microscopie à fond lumineux à 100 X et 200 X de grossissement et de comparer la morphologie des cellules avec la référence MCF-10 a et les lignées de cellules MDA-MB-231 (Figure 1).

2. l’obtention de cellules de Cancer primitif du tissu tumoral

Remarque : Pour obtenir des cellules épithéliales tumorales utilisent tissus réséqués tumeurs primaires de BrC patients avec aucune thérapie néoadjuvante précédente ; éviter les zones nécrotiques et travailler avec un minimum de 0,5 cm3 de tissu tumoral.

  1. Rincer le tissu tumoral avec du PBS stérile 1 x et il ventiler mécaniquement avec un scalpel en fragments de 1 à 2 mm.
  2. Digérer le tissu dans un flacon en verre stérile de 20 mL avec bouchon pendant 2 h à température ambiante (RT) avec 2 mL de la solution de suivi : mélanger 1 mg/mL type de collagénase I et 100 hyaluronidase U/mL DMEM/F12 moyen contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine , sous agitation constante.
  3. Filtrer la suspension obtenue à travers les pièces stérilisées de tulle pour éliminer les gros morceaux de tissu non digéré. Puis filtrez la suspension cellulaire à travers une membrane de pores µm 100 stérilisé.
  4. Les cellules à 430 x g pendant 5 min à RT de granule et laver deux fois avec du PBS stérile 1 x. Cellules primaires de culture dans un milieu DMEM/F12 additionnée de 5 % de sérum de cheval, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 100 ng/mL de toxine de choléra, 0,5 µg/mL hydrocortisone, 10 µg/mL d’insuline et 20 ng/mL de l’EGF. Remplacer le milieu de chaque 48 h. maintenir les cultures à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
  5. Veiller à ce que les cellules isolées sont des cellules épithéliales avec un protocole standard de l’immunocytochimie14. Tester trois marqueurs épithéliaux : un panel de cytokératines (Elinoy), mucine-1 (Muc-1) et la molécule d’adhérence des cellules épithéliales (EpCAM).

3. isoler les cellules PM du sang périphérique

  1. Extrait environ 40 mL de sang périphérique de santé bénévoles, diluer le sang dans une proportion de 1:3 avec du PBS stérile exempt d’endotoxine 1 x et soumettre à une séparation de gradient de densité.
  2. Dans un tube à fond conique, placer 2 mL d’un milieu de diatrizoate polysucrose et de sodium avec une densité de 1,077 g/mL. Lentement et avec précaution recouvrez 8 mL du sang dilué. Centrifuger pendant 30 min, 765 x g à RT. utilisation de la vitesse d’accélération-décélération plus lente de la centrifugeuse.
    Remarque : Après la centrifugation, quatre couches seront formés de bas en haut : l’extrait concentré de globules rouges, la couche moyenne gradient de densité, la couche de cellules mononucléées (elle apparaît comme un anneau de couleur blanche fin) et la couche de plasma.
  3. Soigneusement, récupérer la couche de cellules mononucléaires de la pente avec une pipette Pasteur stérile et laver trois fois avec du PBS 1 x, chaque fois suivie d’une centrifugation plus lente (430, 275 et 191 x g) pendant 10 min à température ambiante.
  4. Protocoles de sélection négative permet d’éviter l’activation des cellules. Un exemple d’un tel protocole est le suivant :
    1. Laver les cellules mononucléaires une fois avec une solution de lavage mis en mémoire tamponné (0,5 % albumine de sérum, 2 mM EDTA dans du PBS 1 x). Compter les cellules dans une chambre de Neubauer et les adapter à une densité de 1 x 107 cellules/30 µL d’une solution tampon.
    2. Pour chaque 1 x 107 éléments, ajouter 10 µL d’une FcR bloquant réactif et 10 µL d’un cocktail de biotine-anticorps de monocytes qui contient anti-l’homme CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 et glycophorine A (inclus dans les kits commerciaux).
    3. Mélanger les cellules et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Ajouter une supplémentaire 30 µL de la solution tampon de lavage plus de 20 µL de microbilles anti-biotine (inclus dans le kit) ; mélanger les cellules et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
    4. Laver les cellules une fois avec une solution tampon, centrifuger à 430 x g pendant 5 min à RT et resuspendre dans 1,5 mL de solution de séparation magnétique tamponnée.
    5. Chargez la suspension cellulaire sur une colonne de séparation magnétique rincés au préalable et ajouter 7 mL de solution tampon. Recueillir la fraction enrichie en monocytes dans un tube conique de 15 mL, compter les cellules non vides et si ne cultivés pas immédiatement, geler les monocytes à une densité de 2 x 106 cellules/1 mL de milieu DMEM/F12 additionné de 50 % DMSO FBS et 10 % à −80 ° C.
      Remarque : Évitez d’utiliser des monocytes après plus de 2 mois de gel, car leur viabilité peut être compromise.
  5. Maintenir les cultures du syndrome prémenstruel dans le milieu DMEM/F12 additionné de 6 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
  6. Effectuez chaque série d’expériences utilisant PMs au moins deux différents donateurs indépendamment, comme monocytes mise en commun des différents donateurs peuvent se traduire par l’activation des monocytes.

4. établir 3D des cultures

  1. Co-cultures 3D avec interaction indirecte
    Remarque :     effectuer ces tests dans des plaques de culture de 24 puits à fond plat à l’aide d’inserts de culture cellulaire en polycarbonate avec des membranes de 0,4 µm de porosité. Dans ce test, les surnageants et les cellules peuvent être récupérés à la fin de l’expérience.
    1. 2 x 106 U937 et THP-1 monocytes dans 10 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de cultiver FBS, 1 % antibiotique/antimycosiques et cultiver PMs fraîches dans un milieu DMEM/F12 complété (comme indiqué plus haut dans étape 3.5), à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
    2. Plaque 4 x 105 monocytes dans 1 mL/puits de leur milieu correspondant (additionné de 2 % ECME et 2 % FBS monocytes U937 et THP-1, ou 2 % ECME et 6 % FBS pour le SPM).
    3. Placer un encart dans chaque puits et ajouter 0,9 mL du 4 x 105 suspension cellulaire BrC dans le milieu correspondant (complété avec 2 ECME et 2 % de FBS pour 5 % ou de lignées cellulaires commercial cheval sérum pour des cellules primaires de BrC). Remplacer la moitié du total des médias toutes les 48 h.
    4. Incuber à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement pendant 5 jours et récupérer le surnageant. Récupérer des cellules par trypsinisation si une analyse est effectuée.
    5. Inclure des contrôles des cultures de cellules individuelles avec les médias respectifs.
  2. Co-cultures 3D avec une interaction directe
    1. Marquer les cellules BrC et monocytes avec les colorants fluorescents différents avant de culture cellulaire pour permettre un tri indépendant de chaque lignée cellulaire après la culture pour l’analyse de l’expression d’ARNm et de protéines. Utiliser commercialement disponibles dérivés de la coumarine et de rhodamine qui passent librement à travers la membrane cellulaire des cellules vivantes. Un protocole général pour l’étiquetage est les suivantes :
      1. Préparer une monocouche de cellules BrC d’intérêt (2 × 106 cellules dans un flacon de culture de 25 cm2 ) et remplacer le support standard avec la solution de travail pré chauffé suffisamment du colorant fluorescent (1:2, 000 du colorant fluorescent dans le milieu de base standard sans aucun supplément). Incuber 30 min à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement. Aspirer la solution de colorant et rincer doucement à suffisamment PBS 1 x. Aspirer le PBS et ajouter le support standard.
      2. Trypsinize de la monocouche cellulaire avec 2 mL d’une solution d’EDTA de trypsine et 0,48 mM 0.05 % pendant 5-10 min à 37 ° C. Ajouter 200 µL de FBS pour arrêter la trypsinisation et 7 mL de milieu correspondant sans suppléments. Remettre en suspension les cellules de pipetage. Prélever une partie aliquote de 10 µL à compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Continuer avec le protocole de co-culture après comptage cellulaire.
      3. Les cellules à 430 x g pendant 5 min à RT de granule (effectuer cette première depuis monocytes poussent en suspension). Jeter le surnageant et resuspendre doucement les cellules avec 3 mL d’une solution de travail pré chauffé du colorant fluorescent (1:2, 000 du colorant fluorescent dans un milieu de base standard sans suppléments). Incuber 30 min à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
      4. Les cellules de granule à nouveau, jeter la solution de travail de teinture et resuspendre doucement avec 5-7 mL de PBS 1 x. Une fois de plus à pellets, jeter le PBS et remettre en suspension les cellules en 5-7 mL de milieu standard. Prélever une partie aliquote de 10 µL de suspension de cellules à compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Continuer avec le protocole de co-culture après comptage cellulaire.
    2. Définissez la co-culture comme suit : : propagation assez ECME au fond du puits pour former une couche uniforme dans chaque puits d’un système de lame de 4 puits chambre. Plaque de 20 µL d’une suspension monocellulaire contenant 5 × 105 étiqueté BrC cellules par puits.
    3. Après 15-20 min d’incubation à 37 ° C, ajouter une suspension de 2,5 x 105 étiqueté monocytes dans 80 µL de milieu de dosage (additionné de 60 % ECME).
    4. Permettre des ECME solidifier pendant 15-20 min à 37 ° C.
    5. Ajouter 1 mL d’un mélange de 1:1 des cellules BrC et milieux de culture de monocytes.
    6. Incuber les cultures co à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement pour 24h, 48 h ou 5 jours pour suivre les modifications apportées à des moments différents.
    7. Dégrader les protéines ECM pour récupérer les cellules des cultures. Aspirer et jeter le médium, ajouter 0,5 mL de PBS 1 x avec de la trypsine de 0,1 % et 0,25 % et d’EDTA et incuber pendant 3 h à 37 ° C. Après l’incubation, ajouter 0,5 mL de PBS 1 x 10 % FBS pour neutraliser la trypsine et remettre en suspension les cellules en pipettant également vigoureusement pour obtenir une suspension de cellules individuelles.
    8. Cellules à 765 x g pendant 5 min à RT de granule, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS 1 x 10 % FBS. Répétez cette opération une fois.
    9. Sous réserve de la suspension de la cellule à cellule activée par fluorescence triant (FACS) avec l’instrument approprié. S’assurer que les populations finales pur à 95 % au moins).
    10. Après le tri, laver les cellules avec du PBS stérile 1 x, pellet (430 x g pendant 5 min à ta) et remettre en suspension dans du PBS stérile 1 x. Les cellules peuvent être traités selon des protocoles spécifiques d’ARN ou d’analyses de protéines.
    11. Répétez chaque essai trois fois, y compris les cultures 3D de chaque lignée de cellules individuelles en tant que contrôles.
  3. Interaction directe des co-cultures 3D afin d’évaluer la dégradation du collagène
    1. Établir des co-cultures cellulaires 3D tel que décrit à l’étape 4.2, avec une étape supplémentaire de l’ajout de 32,5 µg/mL de collagène IV, marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine à la CME. La concentration finale de collagène IV dans l’ECME est de 0,5 %. Développer les cultures dans une lamelle de 35 mm, placée dans une boîtes de Pétri.
    2. Étaler une couche de 40 µL d’ECME dans le fond de la boîte de Pétri. Permettre la CME à se solidifier à 37 ° C.
    3. Ajouter 2,5 x 10 cellules de BrC de5 à 10 µL de milieu et permettre aux cellules de s’installer.
    4. Ajouter une suspension de 1,25 x 105 U937 monocytes dans 40 µL dosage additionné (60 % de DQ-collagène IV étiqueté-ECME).
    5. Permettre des ECME solidifier pendant 15-20 min à 37 ° C.
    6. Ajouter 2 mL d’un mélange de 1:1 des cellules de BrC et milieux de culture de monocytes.
    7. Incuber les cultures co pendant 5 jours à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement. Remplacer des milieux de culture toutes les 48 h.
    8. Analyser l’émission de fluorescence dans un microscope confocal à balayage et mesurer la densité optique intégrée (IOD) par 50 µm2 de culture. IODs comparer de différentes cultures et la culture au temps zéro (Figure 2).

5. analyse des surnageants de 3D cultures conjointement avec Interaction indirecte

  1. Après 5 jours de culture mixte, récupérer le surnageant à la fois le supérieur et les compartiments inférieurs des cultures co 3D et des contrôles individuels de la culture 3D. Mélangez bien chaque surnageant de pipetage. Aliquote et magasin le surnageant à −20 ° C jusqu'à l’utilisation (jusqu'à un mois).
    Remarque : Garder les surnageants à −80 ° C si le stockage sera plu d’un mois.
  2. Analyser les surnageants avec multiplexage des plateformes de test, tests immuno-enzymatiques (ELISA) ou immunologiques perle suivant des procédures recommandées par le fabricant.
    Remarque : Surnageants peuvent également être analysées par Western blot ou concentrées à travers des filtres de pores spécifiques afin d’obtenir des fractions protéiques taille enrichi pour effectuer la zymographie analyse16,17. Également utiliser les surnageants comme milieux conditionnés pour d’autres expériences, comme décrit ci-dessous. Milieux conditionnés provient généralement d’une culture de 5 jours (Figure 3).

6. caractérisation des effets des surnageants de cellules primaires BrC sur Acini Formation et Structure des Acini

  1. Dans chaque puits d’une lame de 8 puits chambre système répandre une base de 40 µL d’ECME et laisse solidifier pendant 30 min à 37 ° C.
  2. Semences 800 MCF-10 a cellules/puits dans 400 µL de milieu de culture DMEM/F12 supplémenté, tel que décrit à l’étape 1.2.
  3. Ajouter 400 µL de milieux conditionnés ou de milieu de culture DMEM/F12 supplémenté avec 20 ng/mL de l’humaine recombinante IL-1β.
  4. Placer la diapositive de chambre dans un verre de Pétri contenant une boîte de Petri 35 mm rempli avec 2 mL de PBS pour créer un environnement humide.
  5. Remplacer le média/surnageant toutes les 48 h.
  6. Enregistrer la formation des acini glandulaires toutes les 24 h pendant 14 jours avec un microscope optique.
  7. Après 14 jours de culture, de la tache acini avec 100 µL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une concentration de 100 nM dans du PBS 1 x pour observer les noyaux des cellules. Incuber pendant 25 min à ta en agitant. Rincer trois fois avec 1 x PBS pendant 5 min, chaque fois en remuant constant au Mount RT. les préparatifs avec un milieu de montage spécifique de coloration fluorescente. Sceller avec du vernis transparent et maintenir abri de la lumière à 4 ° C.
  8. Analyser les acini avec un microscope confocal, prendre des images des cheminées transversales à différentes profondeurs des acini (Figure 4A, B, C).
  9. Visualiser les différentes protéines cellulaires dans les acini avec des protocoles de coloration appropriées. Par exemple, la E-cadhérine était taché afin d’évaluer l’adhérence cellule-cellule, polarité cellulaire et/ou lumen formation18 (Figure 4D).

7. les essais de migration

Remarque : Effectuer des essais de migration de U937, PMs THP-1 et frais dans des plaques de culture de 24 puits à fond plat à l’aide de polycarbonate cellulaire inserts de culture avec des membranes de 8 µm de porosité. Il a été démontré précédemment que les chimiokines GM-CSF, MCP-1 et RANTES trouvées sécrétée à des concentrations élevées dans les cultures 3D des lignées cellulaires BrC agressives. Il a été proposé que ces cytokines ont critiqué à l’attraction des monocytes à l’emplacement de la tumeur primitive ; Cela a été testé dans des essais de migration utilisant les cytokines comme chimioattractants.

  1. La culture U937, PMs THP-1 ou frais tel que décrit à l’étape 4.1.1.
  2. Rincez une fois chaque insert avec 200 µL de milieu RPMI 1640 sans sérum pour hydrater la membrane.
  3. Remplissez-le avec 50 µL de ECME froid, placer les inserts dans une plaque de culture de 24 puits à fond plat et permettre l’ECME polymériser pendant 1 h à 37 ° C.
  4. Ajouter 180 µL de RPMI sans FBS dans le compartiment supérieur de la plaque. Ajouter à la chambre basse sans propagation 800 µL de RPMI additionné soit 100 ng/mL de GM-CSF, MCP-1 ou RANTES comme facteur chimiotactique. Milieu d’utilisation sans les cytokines comme témoin négatif. Incuber 30 min à 37 ° C, d’établir un gradient de chimiokine.
  5. Place 1,5 x 105 de chaque type de monocytes dans un tube stérile, laver deux fois avec 1 mL de 1 x PBS et centrifuger à 430 x g pendant 5 min à monocytes RT. resuspendre dans 20 µL de RPMI sans FBS, placez-les dans les encarts et homogénéiser soigneusement la suspension cellulaire (le dernier volume de la chambre haute est 200 µL).
  6. Permettre la migration des cellules de progrès pendant 24 h à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
    Remarque : Comme les monocytes sont non adhérents, cellules migratrices sera habituellement dans les médias du compartiment inférieur.
  7. Enlever les inserts, récupérer les médias et compter les cellules à 2, 4, 6 et 24 heures à l’aide d’une chambre de Neubauer ou un cytomètre de flux ; par ailleurs, surtout si aucune cellule ne se trouvent dans les médias, acquérir des images de la partie inférieure des inserts avec une caméra numérique. Le nombre de cellulaire moyen de 3 champs aléatoires (grossissement de 100 X) est utilisé pour l’analyse (Figure 5).

8. analyses d’invasion

Remarque : Effectuer des analyses d’invasion des cellules BrC dans les plaques de culture de 24 puits à fond plat à l’aide d’inserts de culture cellulaire en polycarbonate avec des membranes de 8 µm de porosité. Dans nos études originales, IL-8 est l’un des cytokines enrichis dans les surnageants des cultures co 3D BrC cellule/monocytes. Si cette cytokine participait à l’invasion des lignées cellulaires BrC étais mis à l’essai.

  1. Développez le BrC cellules dans des flacons de2 75 cm. MCF-7, T47D, HS578T et MDA-MB-231, comme décrit à l’étape 1.2 (mais sans ECME) et des cellules primaires de BrC comme indiqué au point 2.4.
  2. Laver une fois que chaque culture de cellules de membrane en polycarbonate 8 µm-pore insérer avec 200 µL de milieu sans sérum (le support utilisé dépend de la lignée de cellules testée) pour hydrater la membrane.
  3. Remplir l’insert avec 50 µL de froid ECME (milieu de ECME:cold dilution 1:4 sans FBS), placer les inserts dans une plaque de culture de 24 puits à fond plat et permettre l’ECME polymériser pendant 1 h à 37 ° C.
  4. Une fois que la CME a polymérisé, ajouter 180 µL des médias cellulaires respectives sans FBS. Ajouter 800 médias µL sans FBS à travers les fentes de l’insert. Incuber 30 min à 37 ° C, d’établir un gradient d’IL-8.
    Remarque : Évitez de créer des bulles dans les médias. Support utilisé est sans FBS, mais additionné de 100 ng/mL d’IL-8 comme un facteur chimiotactique ou pures médias sans FBS, comme témoins négatifs.
  5. Obtenir un total de 6 x 105 cellules de chaque lignée cellulaire comme suit :
    1. Jeter le surnageant et rincer une fois 10 ml de PBS 1 x ajouter 2 mL d’EDTA 0,05 % trypsine/0,48 mM pendant 2 min à 37 ° C, pour détacher les cellules. Ajouter 4 mL de milieu supplémenté pour arrêter la réaction de la trypsine et resuspendre vigoureusement par pipetage.
  6. Prendre un 10 µL aliquote de la suspension cellulaire pour compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Prendre un volume de suspension cellulaire contenant 6 x 105 cellules. Centrifuger à 430 x g pendant 5 min à ta, éliminer le surnageant et rincer les cellules dans 1 mL de PBS 1 x. Répéter une fois de plus le rinçage.
  7. Remettre en suspension les cellules dans 20 µL des médias respectifs sans FBS et place dans les encarts contenant 180 µL des médias respectifs sans FBS. Homogénéiser soigneusement la suspension cellulaire de pipetage.
  8. Permettre l’invasion des cellules de progrès pendant 48 h à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 environnement.
  9. Après 48 h, enlevez l’insert, éliminer le surnageant et rincer l’insert une fois très soigneusement avec 200 µL de PBS 1 x. Avec un coton-tige, enlever l’excès de PBS.
    Remarque : Les cellules envahissantes sont habituellement attachés à l’autre côté de l’insert car dans ce cas où les cellules sont adhérentes.
  10. Fixer les cellules en plaçant l’insert dans un puits d’une plaque de culture 24 puits à fond plat contenant 1 mL/puits de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à RT. ensuite, rincer les plaquettes une fois avec du PBS 1 x.
  11. Colorer les cellules en plaçant l’insert dans un puits d’une plaque de culture 24 puits à fond plat contenant 1 mL/puits de PBS 1 x 0,2 % cristal violet pendant 45 min à très soigneusement, avec une suppression de coton-tige tous le ECME du haut de la membrane , qui contient des cellules qui n’ont pas migré, et rincer très soigneusement à l’eau distillée pour éviter l’élimination des cellules envahissantes fixées.
  12. Compter les cellules envahisseurs en observant la face inférieure de l’insert au microscope inversé. Le nombre de cellule moyenne de 3 champs aléatoires (grossissement de 100 X) est utilisé. Dans le cas où les cellules ont envahi comme des grappes et sont difficiles à dénombrer individuellement, acquérir des images de 3 champs aléatoires (grossissement de 100 X) avec un appareil photo numérique. Analyser les images avec le logiciel pour l’analyse de l’image et utilisez l’IOD pour quantifier l’invasion des cellules (Figure 6).

Résultats

Analyse morphologique des cellules BrC dans les Cultures 3D :

La morphologie des cellules primaires de BrC poussant dans les cultures 3D à basse et à haute densité a été étudiée sur une période de 5 jours. Pendant les premières 48 h, les cellules adhèrent à la CME et maintiennent une densité faible. À ce moment, il peut clairement être apprécié que les cellules présentent une forme allongée de...

Discussion

Les cellules épithéliales se développent dans une conformation spatiale 3D et leur interaction avec les protéines ECM est essentielle pour l’homéostasie tissulaire. Plusieurs études sur le cancer ont été fondées sur des cellules cultivées en monocouches (2D) et même si elles ont été essentielles à la compréhension de nombreux aspects de la formation de tumeurs et de la progression, les monocouches ne pas récapituler les caractéristiques que l’ECM impose aux cellules, pour instance : limitant la prol...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de tout conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE projet no 233061 à Ezequiel M. Fuentes-Pananá et Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numéro de projet lui-les-2014-053). Espinoza-Sánchez NA est étudiante au doctorat de Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et a reçu la bourse 231663 du CONACYT. E-S NA, également reconnaître le soutien financier apporté par l’Institut mexicain de sécurité sociale (IMSS).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317Non-transformed breast cell line
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22Breast Cancer Cell line
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133Breast Cancer Cell line
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 mediumGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L glucose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotic/AntimycoticGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine SerumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Horse serum GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered SalineGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisoneSIGMA-ALDRICHH088-5G
Cholera toxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Crystal-violetHycel México541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable supports (inserts)Corning Inc34226.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts)Thermofisher Scientific1406206.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)Nalge Nunc International177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishesMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Références

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