JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем трехмерной культуры метод для анализа морфологии первичных груди раковых клеток, а также изучение их прямое/косвенное взаимодействие с моноцитов и исходы, такие как деградация коллагена, набора иммунных клеток, клеток вторжения и поощрение связанных с раком воспаления.

Аннотация

Встроенные в внеклеточного матрикса (ECM), нормальных и опухолевых клеток эпителия тесно общаться с кроветворную и не гемопоэтических клеток, таким образом значительно влияющих на нормальные ткани гомеостаза и болезни результатов. В рак молочной железы связанный тумором макрофагов (ТАМС) играют важную роль в прогрессирования заболевания, метастазов и рецидивов; Таким образом понимание механизмов Моноцит chemoattraction микроокружения опухоли и их взаимодействия с опухолевых клеток имеет важное значение для борьбы с этим заболеванием. Здесь мы предоставляем подробное описание системы трехмерного (3D) совместно культуры молочной железы человека клетки рака (BrC) и человека моноцитов. BrC клетки производятся высокий базальный уровень регулируемую активацию, нормальный Т-клеток выражена и выделяется (RANTES), Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), в то время как в со культуре с моноцитов, Интерлейкин (IL) -1 бета провоспалительных цитокинов (ИЛ 1β) и ИЛ-8 обогатились вместе с матрицы металлопротеиназ (СПП) -1, ММП-2 и MMP-10. Этот микроокружения опухоли стромы поощрять устойчивость к anoikis в ККМ 10A 3D Ацинусы как структуры, chemoattraction моноцитов и вторжения агрессивных клеток BrC. Здесь представлены протоколы предоставляют доступную альтернативу изучать коммуникации внутри опухоли и являются примером большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают допросить особенностей опухоли биологии, относящиеся к опухоли агрессии.

Введение

Биология опухоли является гораздо более сложной, чем считалось ранее. Монтаж доказательств показывает, что опухолевые клетки более чем просто массовая неконтролируемая пролиферирующих клеток; скорее различные неопластических клеток, по-видимому, выполняют различные функции отображения высокой Организации и иерархия в пределах опухоли1. Опухолевые клетки находятся также в интимной связи с не трансформированных клеток: макрофаги, фибробласты, лимфоцитов, адипоциты, эндотелиальные клетки, среди других клеток все погружены в эшафот белки и полисахариды, которые составляют ECM. Многочисленные прямые и косвенные взаимодействия устанавливаются между преобразуется и -трансформированных клеток и с ECM, который оказывает мощное влияние на результат болезни2,3. В конкретном случае BrC особенно важно вскрыть связи BrC клеток с ТАМС, считая, что ТАМС были найдены играть решающую роль в развитии опухоли, увеличивая риск метастазов и рецидивов болезни4 ,5.

Для анализа интра опухолевой взаимодействий и их возможные результаты, новые 3D в vitro подходы были разработаны основанные на использовании ECM экстрактов, которые обеспечивают гораздо более сложные микроокружения, ближе к реальности опухоли биологии, в сравнении с обычные однослойные клеточных культур, в которых клетки растут придает пластика. Петерсен и Bissell6 первая модель доброкачественные и Злокачественные эпителиальные клетки молочной культивированный на базальной мембраны Ламинин богатые и были первыми для описания структуры 3D organotypic, дискриминационные доброкачественные человека эпителиальных клеток молочной железы от их злокачественные коллегами. Десять лет спустя, модель, разработанная Debnath, Мутусвами, и Брюгге7,8,9 предоставляет ценный инструмент для выяснения биологические пути во время злокачественной трансформации железистой ацинусов, такие как большой Ацинусы образование из-за бесконтрольного распространения, делокализация туго Джанкшен белков как доказательства нарушения клеток поляризации и потеря Ацинусы люмен результате ячейки сопротивления anoikis, тип запрограммированной смерти клетки, происходит в Анкоридж зависимых клеток, когда они отсоединить от окружающих ECM. Модели Sameni, Jedeszko и Слоун были сосредоточены на визуализации протеолитической активности клеток, которая тесно связана с инвазивность, другой решающую черта опухоли злокачественными опухолями10,,1112. Эти модели полагаются на белок матрицы, смешанного с различными закаленном флуоресценции белков субстратов (DQ-желатин, DQ-коллаген I и IV DQ-коллаген), в котором флуоресцентные сигналы являются ориентировочными протеолитических деградации коллагена. 3D модели используются также для изучения свойств стволовых клеток как-трансформированных и опухолевые клетки, в котором ячейки агрегатов, также называют сфероидов, может быть культивировали, подвеска или в ECM-подобных белков, допрос механизмы дифференцировки клеток, асимметричные деление клеток, присоединение к ячейке и клетки моторики13,14. Вторжения анализы позволяют тестирование внутренней агрессивность опухоли и выявление молекулы, которые служат в качестве chemoattractants в ходе инвазивные процесс15. В целом, 3D модели представляют доступные диверсификации в пробирке клеток культуры, которая более тесно отразить нормальной и онкогенных ткани морфогенеза.

Мы разработали 3D клетки совместно культуры системы, основанной на вышеупомянутых моделей7,10,11, используя оба человека коммерческие BrC клеточных линий, известных агрессивный потенциал (люминал и тройной негативного типы) и первичной клетки, описаны из BrC пациентов. Мы впервые разработал модель, где неагрессивных (MCF-7) или агрессивным BrC (MDA-MB-231) клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в выписку внеклеточного матрикса (ECME)-на основе 3D-системы, которая позволила прямой ячеек взаимодействий. Эти совместно культур были использованы для определения, как связь между этими двумя клеток линий влияние транскрипции набор генов, связанных с агрессивным поведением рака. Значительное увеличение числа Стенограмма циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) было отмечено, что совпало с увеличение производства одного из своих продуктов, простагландин E2 (PGE2), вывод, который подчеркнул роль воспаления в прогрессии рака. Увеличение транскрипции ММП также было отмечено, что коррелирует с больше коллагена протеолиза при агрессивных MDA-MB-231 клетки были совместно культивируемых с U937 моноцитов в DQ-коллаген IV-содержащих культур. Следует отметить нашего совместного культур не поддерживает предположение, что механизмы взаимодействия клеток необходимы для деградации коллагена. Скорее, он предложил, что связь между двумя клеток линий был посредничестве секретируемые молекул. Кроме того supernatants, добываемых из этих анализов совместно культуры содержится растворимых факторов, которые дезорганизованы железистой ацинусов, образованный-трансформированных клеток MCF-10A13. Было установлено, что агрессивный и первичных клеток BrC выделяется повышенный уровень Моноцит эозинофилов молекул MCP-1, ГМ-КСФ и RANTES. Таким образом мы изложили 3D культуры, в которой клетки были отделены в ячейку культуры вставок для предотвращения взаимодействия ячеек. Эти культуры были использованы для решения непрямая связь между BrC клетки и моноцитов. Для этих анализов, неагрессивных и агрессивных коммерческих BrC клеточных линий и первичных клеток BrC и три различных типов человека моноциты: коммерческая U937 и THP-1 клетки и первичной моноцитов (PMs), изолированных от периферической крови здоровых доноров (все Моноциты были использованы в государстве не активирована) были использованы. Увеличение концентрации цитокинов ИЛ 1β и IL-8 были замечены обогатиться в сотрудничестве культуры. Аналогичным образом было установлено, что MMP-1, ММП-2 и MMP-10 также были увеличены в BrC клетки Моноцит совместно культур и таким образом укрепления предыдущие выводы14. В этой рукописи точка за точкой процесса первичной изоляции клетки BrC и тестирования в 3D культур представлен наряду с представителем результаты. Эта работа является хорошим примером того, большой потенциал, который в vitro 3D ячейки системы обеспечивают опрос конкретных аспектов опухоли биологии.

протокол

Образцы из BrC пациентов были получены из ткани банка Unidad de Investigación en Virología y стрессовые, больница Infantil де Мехико Федерико Гомес. Это исследование было одобрено научным, этические и биозащищенности обзора доски Гомес Федерико больницы Infantil де Мехико: Comité de Investigación, этика Comité de en инвестигасьон и Comité de Bioseguridad. Все пациентов проспективно поступили и были информированы о характере исследования: тех, кто желает участвовать подписал письменное осознанного согласия до сбора образцов и рассматривались согласно этических руководящих принципов и наилучших клинической практике учреждение. На время исследования был анонимной идентификации участников. Включены пациенты были диагностированы с инвазивной протоковой карциномы, гистологические класса 2 и клинической стадии II, с не предыдущих неоадъювантной терапии перед резекции тканей. Пациенты были всех женщин в возрасте в среднем 56,8 лет (диапазон 42-75)14.

1. 3D клеточных культур

  1. Семя 0.1 x 106 MCF-10A ячейки или первичной BrC в 25 см2 культуры колбы с DMEM/F12 питательной среды с 5% Верховая сыворотки, пенициллин 100 ед/мл, 100 мкг/мл стрептомицина, токсин холеры 100 нг/мл, гидрокортизон 0,5 мкг/мл, 10 мкг/мл инсулин, а 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF). Семя 0.1 x 106 коммерческих BrC клетки, клетками MCF-7, MDA-MB-231 клетки в 75 см2 культуры и колбы с DMEM/F12 питательной среды с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл. Инкубировать при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
  2. После 48 ч промойте монослое клеток с 10 мл стерильной 1 x-фосфатный буфер (PBS). Trypsinize клетки однослойная с 3 мл раствора 0,05% трипсина и 0,48 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 5-10 мин при температуре 37 ° C. Добавьте 200 мкл соответствующего сыворотки, чтобы остановить trypsinization и 7 мл среды без добавок. Ресуспензируйте клетки, закупорить и удалить Алиготе 10 мкл подсчитать ячейки в камере Нойбауэр.
  3. В каждом хорошо системы слайд 8-Ну камеры распространение 40 мкл базу чистого ECME, после чего инкубации 30 мин при температуре 37 ° C.
  4. В каждом хорошо, место 800 клетки высокомобильна в 400 мкл среде DMEM/F12 (без фенола красного), дополнены как шаг 1.1, но со следующими изменениями: для первичной BrC клетки и клетки, ККМ 10A, добавить 4 нг/мл EGF и 2% ECME; MCF-7 и MDA-MB-231, добавить только 2% ECME.
  5. Инкубировать культур при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды. Замените культуру СМИ каждые 48 ч.
  6. Морфологические изменения записи клеток каждые 24 ч на 15 дней с помощью оптического микроскопа. Для анализа морфологии первичных BrC клетки, ККМ 10A и MDA-MB-231 клетки являются хорошим справочником клеточных линий для примеров приказал ацинарной формирования и неупорядоченных агрессивный рак как структуры, соответственно.
  7. Получение изображения клеток в светлых местах микроскопии в 100 X и 200 X увеличение и сравнить морфологии клеток с ссылкой на ККМ 10A и MDA-MB-231 клеточных линий (рис. 1).

2. получение первичной раковые клетки от опухолевой ткани

Примечание: Для получения опухоли эпителиальных клеток использовать ткани от резекции первичной опухоли из BrC пациентов с не предыдущих неоадъювантной терапии; Избегайте некротических участков и работать с минимум 0,5 см3 опухолевой ткани.

  1. Промойте опухолевой ткани с стерильных ПБС и механически дезагрегировать его с помощью скальпеля в фрагменты 1-2 мм.
  2. Дайджест ткани в стерильных 20 мл флаконе стекла с крышкой втечение 2 ч при комнатной температуре (RT) с 2 мл раствора следуйте: Смешайте 1 мг/мл коллагеназы типа I и 100 ед/мл гиалуронидазы в среде DMEM/F12 средних содержащие 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл , при постоянном перемешивании.
  3. Фильтровать результирующий подвеска через стерилизованные куски тюль для ликвидации крупные кусочки непереваренной ткани. Затем фильтр суспензию клеток через стерилизованные 100 мкм поры мембраны.
  4. Пелле клетки на 430 x g 5 мин на RT и мыть их дважды с стерильных ПБС. Культура клетки первичной в среде DMEM/F12 с 5% сыворотки крови лошади, 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 нг/мл холеры токсин, гидрокортизон 0,5 мкг/мл, 10 мкг/мл инсулина и EGF 20 нг/мл. Замените носитель каждые 48 ч. сохранение культур при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
  5. Убедитесь, что изолированные клетки являются клетки эпителия с стандартным протоколом immunocytochemistry14. Проверьте три маркеры эпителия: Группа cytokeratins (PanCK), муцина-1 (Muc-1) и молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM).

3. изоляция вечера клеток периферической крови

  1. Экстракт примерно 40 мл периферической крови от здоровых добровольцев, разбавить кровь в пропорции 1:3 с стерильных бесплатно эндотоксина ПБС и подвергнуть его разделение градиента плотности.
  2. В конической трубки место 2 мл polysucrose и натрия diatrizoate среды с плотностью 1,077 г/мл. Тщательно и медленно наложение 8 мл разбавленной крови. Центрифуги для 30 мин, 765 x g на RT. использование медленного ускорения замедления скорости центрифуги.
    Примечание: После центрифугирования, четыре слоя будет формироваться снизу вверх: красные кровяные клетки Пелле, плотность градиента средний слой, слой мононуклеарных клеток (он отображается как прекрасный белый кольцо) и плазменный слой.
  3. Тщательно извлечь слоя мононуклеарных клеток из градиента с стерильные пипетки Пастера и мыть их в три раза с ПБС, каждый раз, когда следуют медленнее центрифугирования (430, 275 и 191 x g) за 10 мин на RT.
  4. Используйте протоколы негативный выбор, чтобы избежать активации клеток. Пример такого протокола заключается в следующем:
    1. Вымойте мононуклеарных клеток с буферизацией моющего раствора (0,5% альбумина bovine сыворотки, 2 мм ЭДТА в однократном ПБС). Подсчитать ячейки в камере Нойбауэр и скорректировать их с плотностью 1 x 107 клеток/30 мкл буфферезированный раствор.
    2. Для каждого 1 x 107 клеток добавьте 10 мкл FcR блокирование реагента и 10 мкл Моноцит биотин антитела коктейль, содержащий античеловеческие CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 и Гликофорины A (включенных в коммерческие наборы).
    3. Сочетание клетки и Инкубируйте 15 мин при 4 ° C. Добавить дополнительные 30 мкл буфера моющего раствора плюс 20 мкл анти биотина микрошарики (входит в комплект); сочетание клетки и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
    4. Вымыть клетки один раз с буфферезированный раствор, центрифуги на 430 x g 5 мин на RT и Ресуспензируйте в 1,5 мл буферизации решение для магнитной сепарации.
    5. Загрузить суспензию клеток на предварительно промыть магнитной сепарации столбца и добавьте 7 мл буфферезированный раствор. Собирать Моноцит обогащенный фракция в 15 мл Конические трубки, подсчитать количество ячеек и если не культивировали немедленно, заморозить моноцитов в плотности 2 х 106 клеток/1 мл среды DMEM/F12 с 50% FBS и 10% ДМСО на −80 ° C.
      Примечание: Избегайте использования моноциты после более чем 2 месяцев замораживания, как их жизнеспособность может быть нарушена.
  5. Сохранение культуры PMs в среде DMEM/F12 с 6% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
  6. Выполните каждый набор экспериментов, используя PMs от по крайней мере двух различных доноров самостоятельно, как объединение моноциты из различных доноров может привести к Моноцит активации.

4. Создание 3D совместно культур

  1. 3D культур совместно с косвенного взаимодействия
    Примечание:     выполняют эти анализы в 24-ну плоскодонные культуры пластин с использованием поликарбоната ячейке культуры вставок с мембраны 0,4 мкм поры. В этот assay supernatants и клетки могут быть извлечены в конце эксперимента.
    1. Культивировать 2 х 106 U937 и THP-1 моноцитов в 10 мл среды RPMI 1640 с 10% FBS, 1% антибиотик/противогрибковое и культивировать свежие PMs в дополнен среде DMEM/F12 (как указывалось ранее в шаг 3.5), при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 окружающей среды.
    2. Пластина моноциты 4 x 105 в 1 мл/хорошо их соответствующих средних (с 2% ECME и 2% FBS для U937 и THP-1 моноцитов, или 2% ECME и 6% FBS для PMs).
    3. Место вставки в каждой скважине и добавить 0,9 мл 4 x 105 BrC суспензию клеток в соответствующей среде (дополнено с 2% ECME и 2% FBS для коммерческих клеточных линий или 5% Верховая сыворотка для первичного BrC клетки). Замените половину всего СМИ каждые 48 ч.
    4. Инкубировать при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды на 5 дней и восстановить supernatants. Получить клетки, trypsinization, если последующий анализ.
    5. Включить элементы управления отдельных клеточных культур с соответствующими средствами массовой информации.
  2. 3D Сопредседатель культур прямого взаимодействия с
    1. Лейбл BrC клетки и моноциты различными флуоресцентными красителями перед клеточной культуры возможность независимой сортировки каждого происхождение клеток после культуры для анализа экспрессии мРНК и белка. Использование коммерчески доступных производных кумарина и родамин, которые свободно проходят через мембрану клетки живых клеток. Это общий протокол для маркировки является следующее:
      1. Подготовить монослоя клеток BrC интереса (2 × 106 клеток в колбе культуры2 25 см) и заменить стандартный средний достаточно подогретым рабочего раствора Люминесцентную краску (1:2, 000 флуоресцентные краски в стандартный базовый средний без каких-либо дополнения). Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды. Аспирационная раствор красителя и осторожно промыть достаточным ПБС. Аспирационная PBS и добавить стандартный носитель.
      2. Trypsinize клетки однослойная с 2 мл раствора ЭДТА трипсина и 0,48 мм 0,05% для 5-10 мин при температуре 37 ° C. Добавьте 200 мкл FBS остановить trypsinization и 7 мл корреспондент среды без добавок. Ресуспензируйте клетки, закупорить. Возьмите Алиготе 10 мкл подсчитать ячейки в камере Нойбауэр. Продолжите с протоколом совместного культуры после подсчета клеток.
      3. Пелле клетки на 430 x g 5 мин на RT (выполнить это первым, так как моноциты расти во взвешенном состоянии). Отменить супернатант и нежно ресуспензируйте клетки с 3 мл подогретым рабочего раствора флуоресцентных красителей (1:2, 000 флуоресцентные краски в стандартной базовой среде без добавок). Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
      4. Пелле клетки снова, отменить рабочий раствор красителя и нежно ресуспензируйте с 5-7 мл ПБС. Пелле еще раз, отбросить PBS и Ресуспензируйте клетки в 5-7 мл стандартной среды. Возьмите Алиготе 10 мкл суспензии клеток для подсчета клеток в камере Нойбауэр. Продолжите с протоколом совместного культуры после подсчета клеток.
    2. Установить совместное культуры следующим:: распространение достаточно ECME в нижней части скважины сформировать даже слой в каждой скважине слайд 4-ну камеры системы. Тарелка 20 мкл одну ячейку суспензии, содержащей 5 × 10-5 помечены BrC ячеек на хорошо.
    3. После 15-20 минут инкубации при 37 ° C, добавьте подвеска 2,5 x 105 помечены моноцитов в 80 мкл пробирного среднего (с 60% ECME).
    4. Разрешить ECME закрепить за 15-20 минут при 37 ° C.
    5. Добавьте 1 mL 1:1 смесь BrC клеток и Моноцит культуры средств массовой информации.
    6. Инкубировать Сопредседатель культур при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды для 24 ч, 48 ч или 5 дней для отслеживания изменений в разное время точках.
    7. Деградируют белки ECM для восстановления клеток от культур. Аспирационная и отказаться от среднего, добавить 0,5 мл ПБС трипсином 0,1% и 0,25% ЭДТА и Инкубируйте 3 ч при 37 ° C. После инкубации, добавить 0,5 мл 1 x PBS с 10% FBS для нейтрализации трипсина и Ресуспензируйте клетки, закупорить энергично для получения одной ячейки подвеска.
    8. Пелле клетки в 765 x g 5 мин на RT, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл 1 x PBS с 10% FBS. Повторите этот шаг один раз.
    9. Суспензию клеток подвергайте активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS) с подходящим инструментом. Убедитесь, что окончательный населения являются по меньшей мере 95% чистой).
    10. После сортировки, вымыть клетки с стерильных ПБС, Пелле (430 x g 5 мин на RT) и Ресуспензируйте в стерильных ПБС. Клетки могут быть обработаны согласно конкретные протоколы изоляции RNA или протеина анализа.
    11. Повторите калибровочных три раза, включая 3D культуры каждой отдельной ячейки линии как элементы управления.
  3. Прямое взаимодействие 3D Сопредседатель культур для оценки деградации коллагена
    1. Создать 3D клеточных культур и совместно, как описано в шаге 4.2, с дополнительный шаг добавления 32.5 мкг/мл тип IV коллагена помечены флуоресцеин Изотиоцианаты к ECME. Конечная концентрация коллаген IV в ECME составляет 0,5%. Расти культур в 35-мм coverslip, помещены в чашках Петри.
    2. Нанесите слой 40 мкл ECME в нижней части Петри. Разрешить ECME закрепить на 37 ° C.
    3. Добавьте 2.5 x 105 BrC клетки в 10 мкл среды и позволяют клеткам, чтобы успокоиться.
    4. Добавление подвеска 1,25 x 105 U937 моноцитов в 40 мкл пробирного среднего (дополнена 60% помечены DQ-коллаген IV-ECME).
    5. Разрешить ECME закрепить за 15-20 минут при 37 ° C.
    6. Добавьте 2 мл 1:1 смесь BrC клеток и Моноцит культуры средств массовой информации.
    7. Инкубировать Сопредседатель культур на 5 дней при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды. Замените культуру СМИ каждые 48 ч.
    8. Анализ выбросов флуоресценции в конфокальный сканирующий микроскоп и измерить интегрированной оптической плотности (IOD) за 50 мкм2 культуры. Сравнение IODs отдельных культур и культуры во время ноль (рис. 2).

5. анализ Supernatants от 3D совместно культур с косвенного взаимодействия

  1. После 5 дней совместного культуры восстановите supernatants от верхних и нижних отсеков 3D Сопредседатель культур и от отдельных 3D культуры управления. Смешайте хорошо каждый супернатант закупорить. Алиготе, а также хранить супернатант −20 ° C до использования (до одного месяца).
    Примечание: Держите supernatants при −80 ° C, если хранения будет больше чем один месяц.
  2. Анализируйте supernatants с мультиплексирования пробирного платформ, энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) или на основе бисера иммуноанализа после рекомендованных процедур производителя.
    Примечание: Supernatants можно также анализируется Западная помарка или сосредоточены через конкретные поры фильтры для получения размер обогащенный белковых фракций выполнять Зимография анализ16,17. В качестве альтернативы используйте supernatants как кондиционером СМИ для других экспериментов, как описано ниже. Кондиционерами СМИ обычно получается из 5-день культуры (рис. 3).

6. характеристика эффекты Supernatants от первичных BrC клеток на формирование Ацинусы и Ацинусы структуры

  1. В каждом хорошо слайд 8-Ну камеры системы распространения 40 мкл база ECME и дайте ему затвердеть в течение 30 минут при 37 ° C.
  2. Семя 800 ККМ 10A клеток/хорошо в 400 мкл дополнениями DMEM/F12 питательной среды, как описано в шаге 1.2.
  3. 400 мкл кондиционером СМИ или дополнить DMEM/F12 питательной среды с 20 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ 1β.
  4. Место палата слайд в чашке Петри стекла, содержащий 35 мм Петри, заполнены с 2 мл PBS для создания влажности окружающей среды.
  5. Замените средства массовой информации/супернатант каждые 48 ч.
  6. Запись железистой Ацинусы формирования каждые 24 ч 14 дней с помощью оптического микроскопа.
  7. После 14 дней культуры, пятно Ацинусы с 100 мкл 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в концентрации 100 Нм в однократном ПБС соблюдать клеточных ядер. Инкубируйте 25 мин на RT в постоянном перемешивании. Промойте три раза с ПБС втечение 5 мин, каждый раз в постоянном перемешивании на RT. Маунт препараты с конкретной средой монтажа для флуоресцентной окраски. Печать с прозрачный лак и поддерживать защищенный от света при 4 ° C.
  8. Анализировать Ацинусы с Конфокальный микроскоп принимая изображения поперечные стеков на разных глубинах Ацинусы (рис. 4A, B, C).
  9. Визуализируйте различных клеточных белков в Ацинусы с надлежащей пятная протоколы. Например E-Кадгерины был окрашенных оценить клеток и клеточной адгезии, клетки полярности или Люмене формирования18 (рис. 4D).

7. Миграция анализов

Примечание: Выполнение миграции анализы U937, THP-1 и свежие PMs в 24-ну плоскодонные культуры пластин с использованием поликарбоната ячейке культуры вставок с 8 мкм поры мембраны. Ранее было показано, что chemokines GM-CSF, МКП-1 и RANTES были найдены выделяется при высоких концентрациях в отдельных 3D культур агрессивной BrC клеточных линий. Было предложено, чтобы эти цитокины имеют решающее значение для привлечения моноцитов к месту первичной опухоли; Это был протестирован в анализов миграции с помощью цитокинов как chemoattractants.

  1. Культура U937, THP-1, или свежие PMs, как описано в шаге 4.1.1.
  2. Промывайте после каждой вставки с 200 мкл RPMI 1640 без сыворотки для увлажнения мембраны.
  3. Заполните его с 50 мкл холодного ECME, место вставки в пластине 24-ну плоскодонные культуры и позволяют ECME для полимеризации в течение 1 ч при 37 ° C.
  4. 180 мкл RPMI без FBS, в верхнем отсеке пластины. Добавить в нижней палате без восходящей 800 мкл RPMI дополнены либо 100 нг/мл, ГМ-КСФ, МКП-1, или RANTES как хемотаксического. Используйте носитель без цитокинов как отрицательный контроль. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C учредить хемокиновых градиент.
  5. 5 место 1,5 x 10 каждого типа Моноцит в стерильную пробирку, мыть дважды с 1 мл раствора 1 x PBS и центрифуги на 430 x g 5 мин на RT. Ресуспензируйте моноцитов в 20 мкл RPMI без FBS, поместите их в вставки и очень тщательно гомогенизации суспензии клеток (окончательный объем верхней палаты-200 мкл).
  6. Разрешить миграции клеток прогресса за 24 часа при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
    Примечание: Как non сторонник, моноциты мигрирующих клеток обычно будет в средствах массовой информации нижнего отсека.
  7. Снимите вставки, извлечения средств массовой информации и подсчитать ячейки на 2, 4, 6 и 24 h, используя камеру Нойбауэр или проточный цитометр; в качестве альтернативы особенно если не клетки находятся в средствах массовой информации, получить изображения в нижней части пластины с цифровой камерой. Средняя ячейка count из 3 случайных полей (на 100 крат) используется для анализа (рис. 5).

8. вторжения анализов

Примечание: Выполните анализы вторжения BrC клеток в 24-ну плоскодонные культуры пластин с использованием поликарбоната ячейке культуры вставок с 8 мкм поры мембраны. В наших оригинальных исследований IL-8 был одним из цитокинов, обогащенный в supernatants BrC клеток/Моноцит 3D Сопредседатель культур. Участвует ли этого цитокина в вторжения BrC клеточных линий был испытан.

  1. Разверните BrC клеток в колбах2 75 см. MCF-7, T47D, HS578T и MDA-MB-231 как описано в шаге 1.2 (но без ECME) и первичных BrC клетки как описано в шаге 2.4.
  2. Мыть после каждого поликарбонат 8 мкм поры мембраны клеточной культуры вставить с 200 мкл средне, без сера (средство, используемое зависит от клеток линии испытания) для увлажнения мембраны.
  3. Заполните вставка с 50 мкл холодной ECME (1:4 разбавления ECME:cold средний без FBS), место вставки в пластине 24-ну плоскодонные культуры и позволить ECME для полимеризации в течение 1 ч при 37 ° C.
  4. После того, как ECME полимеризуется, 180 мкл соответствующие ячейки СМИ без FBS. Добавьте 800 мкл СМИ без FBS через прорези вкладыша. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C для создания градиента ИЛ-8.
    Примечание: Избегайте создания пузырьков в средствах массовой информации. Использовать средства массовой информации без FBS, но с 100 нг/мл ИЛ-8 как хемотаксического или чисто СМИ без FBS, как негативный контроль.
  5. Получите в общей сложности 6 x 105 клеток каждой ячейки строки следующим образом:
    1. Отменить supernatants, раз ополосните 10 мл ПБС и добавить 2 мл 0,05% трипсина/0.48 мм ЭДТА для 2 минут при 37 ° C для отсоединения клетки. Добавьте 4 мл дополнениями среды остановить реакции трипсина и энергично Ресуспензируйте, закупорить.
  6. Возьмите 10 мкл аликвота суспензию клеток для подсчета клеток в камере Нойбауэр. Возьмите объем суспензии клеток, содержащих 6 x 105 клеток. Центрифуга на 430 x g 5 мин на RT, удалить супернатант и промойте клеток в 1 мл ПБС. Еще раз повторите полоскание.
  7. Ресуспензируйте клетки в 20 мкл соответствующих СМИ без FBS и место вставки, содержащий 180 мкл соответствующих СМИ без FBS. Тщательно гомогенизации суспензии клеток, закупорить.
  8. Разрешить ячейки вторжения для прогресса за 48 ч при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 среды.
  9. После 48 ч Снимите вставку, удалить супернатант и промойте Вставка однажды очень тщательно с 200 мкл ПБС. С ватным наконечником аппликатором удалите избыток PBS.
    Примечание: Инвазивные клетки обычно прилагаются к другой стороне пластины как в этом случае, где клетки являются приверженцем.
  10. Исправить клетки, поместив Вставка в хорошо 24-ну плоскодонные культуры пластины, содержащие 1 мл/о параформальдегида 4% за 15 минут, потом RT., хорошо промойте пластины с ПБС.
  11. Запятнать клетки, поместив Вставка в хорошо 24-ну плоскодонные культуры пластины, содержащие 1 мл/хорошо ПБС с 0,2% Фиолетовый Кристалл 45 мин на RT. тщательно, с ватным наконечником аппликатором удалить все ECME от верхней части мембраны , который содержит клетки, которые не мигрируют, и очень тщательно промыть дистиллированной воды, чтобы избежать ликвидации фиксированной инвазивных клетки.
  12. Подсчитать ячейки вторжение, наблюдая за нижнюю сторону вставки под инвертированным микроскопом. Средняя ячейка count из 3 случайных полей (на 100 крат) используется. В тех случаях, когда клетки вторглись как кластеры и трудно подсчитать отдельно получать изображения от 3 случайных полей (на 100 крат) с помощью цифровой камеры. Анализ изображений с программным обеспечением для анализа изображений и использовать IOD подсчитать ячейки вторжения (рис. 6).

Результаты

Морфологический анализ BrC клеток в 3D культур:

Морфология первичных клеток BrC, растущих в 3D культур при низкой и высокой плотности было исследовано более 5 дней. В течение первых 48 часов клетки придерживаться ECME и поддержания низ...

Обсуждение

Эпителиальные клетки растут в 3D пространственной конформации и их взаимодействие с белками ECM является ключевой для ткани гомеостаза. Многие исследования рака были основаны на клетки, выращенных в монослои (2D) и хотя они решающее значение для понимания многих аспектов образования опух...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют каких-либо конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа было поддержано КОНАСИТ FONSEC SSA/ИМСС/ИСОГС проекта № 233061 до Эсекьель м. Фуэнтес-Pananá и по Fondo de Apoyo а-ля инвестигасьон, больница Infantil де Мехико Федерико Гомес (номер проекта HIM-2014-053). Эспиноса-Санчес NA является докторантом из Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma де Мехико (UNAM) и получил стипендий 231663 от КОНАСИТ. E-S NA, также признаем финансовую поддержку, оказываемую Мексиканского института социального обеспечения (мисо).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317Non-transformed breast cell line
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22Breast Cancer Cell line
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133Breast Cancer Cell line
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 mediumGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L glucose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotic/AntimycoticGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine SerumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Horse serum GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered SalineGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisoneSIGMA-ALDRICHH088-5G
Cholera toxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Crystal-violetHycel México541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable supports (inserts)Corning Inc34226.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts)Thermofisher Scientific1406206.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)Nalge Nunc International177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishesMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Ссылки

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1313DECMEBrC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены