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Resumo

Aqui, descrevemos um método de cultura tridimensional para analisar a morfologia da mama primário de células de câncer, também como para estudar suas interações direta/indireta com os monócitos e os resultados tais como a degradação do colagénio, recrutamento de células imunes, célula invasão e promoção de inflamação relacionadas ao câncer.

Resumo

Incorporado na matriz extracelular (ECM), normais e neoplásicas de células epiteliais intimamente comunicar-se com células hematopoiéticas e não-hematopoiéticas, assim, extremamente influenciar o resultado de homeostase e doença do tecido normal. No câncer de mama, tumor-associado macrófagos (TAMs) desempenham um papel fundamental na progressão da doença, metástase e recorrência; Portanto, compreender os mecanismos da chemoattraction de monócitos para o microambiente do tumor e suas interações com as células do tumor é importante para controlar a doença. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um sistema tridimensional (3D) co-cultura de células de câncer (BrC) de mama humano e monócitos humanos. BrC células produzidas elevados níveis basais de regulamentado na ativação, normal de célula T expressa e secretada (RANTES), monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) e fator colônia-estimulando do Granulócito-macrófago (G-CSF), enquanto em co-cultura com monócitos, citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL) -1 beta (IL-1 β) e IL-8 foram enriquecidos em conjunto com a matriz metaloproteinases (MMP) -1, MMP-2 e MMP-10. Este microambiente de estroma do tumor promovido resistência à anoikis em MCF-10A 3D acinar estruturas, chemoattraction de monócitos e invasão de células de BrC agressivas. Os protocolos aqui apresentados fornecem uma alternativa acessível para estudar comunicação intra-tumor e são um exemplo do grande potencial em vitro celular 3D sistemas fornecem para interrogar a características específicas da biologia do tumor relacionados ao tumor agressão.

Introdução

Biologia do tumor é muito mais complexa do que se pensava. Montagem a evidência mostra que as células do tumor são mais do que uma mera massa de células de proliferação não controladas; pelo contrário, diferentes células neoplásicas parecem desempenhar funções diferentes, exibindo alta organização e hierarquia dentro do tumor1. Células tumorais são também em comunicação íntima com células não-transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfócitos, adipócitos, células endoteliais, entre outras células estão todos imersos no andaime proteínas e polissacarídeos que constituem o ECM. Numerosas interacções directas e indirectas são estabelecidas entre as células transformadas e não transformadas e com o ECM, que exerce uma poderosa influência sobre o resultado de doença2,3. No caso específico da BrC, é particularmente importante dissecar a comunicação das células BrC com TAMs, Considerando que TAMs descobriu-se que desempenham um papel fundamental na evolução do tumor, aumentando o risco de metástase e de recorrência da doença4 ,5.

Para analisar interações intra-tumoral e seus possíveis resultados, novo 3D em vitro abordagens têm sido desenvolvidos com base na utilização de extratos de ECM que fornecem um microambiente muito mais complexo, mais perto da realidade da biologia do tumor, em comparação com o as culturas celulares convencionais monocamada em que as células crescem anexado ao plástico. Petersen e Bissell6 desde o primeiro modelo de benigno e células epiteliais mamárias malignas cultivadas em uma membrana basal de laminina-rico e foram os primeiros a descrever as estruturas de organotypic 3D que discriminem humanos benigno células epiteliais da mama de suas contrapartes malignas. Uma década mais tarde, o modelo desenvolvido dos Santos, Davi, e Brugge7,8,9 fornecido uma ferramenta valiosa para elucidar os caminhos biológicos comprometidos durante a transformação maligna dos ácinos glandulares, tais como formação de ácinos grande devido a proliferação descontrolada, a deslocalização das proteínas de junção apertada como prova da polarização celular prejudicada e perda de lúmen acinar, como resultado da resistência da célula de anoikis, um tipo de morte celular programada que ocorre em células dependentes de ancoragem quando eles desanexe o ECM circundante. Os modelos de Sarto, Jedeszko e Sloane centraram-se na atividade proteolítica de imagem por células, que está intimamente relacionada com a capacidade de invasão, outra característica crucial de tumor malignidade10,11,12. Estes modelos contam com matrizes de proteína misturadas com substratos diferentes proteínas fluorescência-extinto (DQ-gelatina, DQ-colágeno I e DQ-colagénio IV), em que sinais fluorescentes são indicativos da degradação proteolítica do colágeno. Modelos 3D também são usados para estudar as propriedades de células-tronco de ambos não-transformadas e células tumorais, em qual célula agregados, também denominado esferoides, podem ser cultivados em suspensão ou em ECM-como proteínas interrogando por mecanismos de diferenciação celular, assimétrica divisão celular, aderência de célula para célula e célula motilidade13,14. Ensaios de invasão permitam testes a agressividade intrínseca do tumor e a identificação das moléculas que servem como quimioatraentes durante o processo invasivo15. Em gerais, 3D modelos representam uma diversificação acessível em vitro cultura celular que refletem mais de perto a morfogênese de tecido normal e oncogênicos.

Desenhamos um sistema de co-cultura célula 3D baseado em modelos acima de7,10,11, usando as duas linhas de célula de BrC comerciais humanas de potencial agressivo conhecido (tipos luminal e triplo-negativo) e primário células explantadas de pacientes BrC. Nós primeiro desenvolveu um modelo onde não agressivos (MCF-7) ou agressivo (MDA-MB-231) BrC células foram co cultivadas com U937 monócitos em um extrato de matriz extracelular (ECME)-com base em sistema 3D que permitiu interações célula-célula direto. Essas culturas co foram usadas para determinar como a comunicação entre estas linhagens de dois célula influenciou a transcrição de um conjunto de genes relacionados ao comportamento agressivo de câncer. Observou-se um aumento significativo da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) transcrição que coincidiu com um aumento da produção de um dos seus produtos, a prostaglandina E2 (PGE2), que destacou o papel da inflamação na progressão do câncer. Aumento da transcrição de MMP também foi observado que correlacionados com maior proteólise de colágeno quando agressivas células MDA-MB-231 co foram cultivadas com U937 monócitos em culturas contendo DQ-colagénio IV. Digno de nota, as nossas culturas co não apoiar a suposição de que os mecanismos de interação célula-célula são necessárias para a degradação do colagénio. Prefiro sugeriu que a comunicação entre as linhagens de células de dois foi mediada por moléculas secretadas. Além disso, os sobrenadantes destes ensaios co-cultura colhidos continham fatores solúveis que desorganizado ácinos glandulares, formados por não-transformadas de células MCF-10A13. Foi encontrado que agressiva e células de BrC primárias secretadas níveis elevados de monócitos Quimiotáticos moléculas MCP-1, GM-CSF e RANTES. Assim, delineámos uma cultura 3D em que as células foram separadas em inserções de cultura celular para evitar interações célula-célula. Essas culturas foram usadas para abordar a comunicação indireta entre células BrC e monócitos. Para estes ensaios, não agressivo e agressivas comercial BrC linhas celulares e células primárias do BrC e três tipos diferentes de monócitos humanos: células U937 e THP-1 comerciais e monócitos primários (PMs) isolados do sangue periférico de doadores saudáveis (todos os monócitos foram usados em um estado não está ativado) foram utilizados. Observou-se aumento das concentrações de citocinas IL-1 β e IL-8 para ser enriquecido em co-cultura. Da mesma forma, verificou-se que a MMP-1, MMP-2 e MMP-10 também foram aumentados na BrC células-monócito co culturas e assim reforçando anteriores conclusões14. Neste manuscrito, um fluxo de trabalho do ponto-a-ponto de isolamento primário de células BrC e testes em culturas 3D é apresentado juntamente com resultados representativos. Este trabalho constitui um bom exemplo do grande potencial em vitro celular 3D sistemas fornecem para interrogar aspectos específicos da biologia do tumor.

Protocolo

Amostras de pacientes do BrC foram obtidas do banco de tecidos da Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Este estudo foi aprovado pela comunidade científica, ética e biossegurança revisão placas do Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética en Investigación e Comité de Bioseguridad. Todos os pacientes foram prospectivamente incluídos e foram informados sobre a natureza do estudo: aqueles que desejam participar assinaram um consentimento informado escrito antes da coleta de amostras e foram tratados de acordo com as diretrizes éticas e melhor prática clínica de a instituição. A identidade dos participantes foi anónimos para a duração do estudo. Pacientes incluídos foram diagnosticados com carcinoma ductal invasivo, grau histológico 2 e clínico fase II, sem terapia neoadjuvante anterior antes de ressecção do tecido. Os pacientes foram todos do sexo feminino com idade em média 56,8 anos de idade (gama 42 a 75)14.

1. culturas de pilha 3D

  1. Semente 0,1 x 106 MCF-10A células ou células primárias de BrC em frascos de cultura de2 25 cm com DMEM/F12 cultura suplementado com 5% de cavalo soro, 100 U/mL penicilina, estreptomicina µ g/mL de 100, toxina da cólera 100 ng/mL, hidrocortisona 0,5 µ g/mL, 10 µ g/mL insulina e 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF). Semente 0,1 x 106 células de BrC comerciais, células MCF-7 e células MDA-MB-231 em 75 cm2 frascos de cultura com meio de cultura DMEM/F12 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL. Incubar a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
  2. Após 48 horas, lave a monocamada de células com 10 mL de estéril 1 x salina tamponada fosfato (PBS). Trypsinize a monocamada de células com 3 mL de solução de 0.05% tripsina e 0,48 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por 5-10 min a 37 ° C. Adicione 200 µ l do soro correspondente para parar tripsinização e 7 mL de meio sem suplementos. Ressuspender as células pipetando e retirar uma alíquota de 10 µ l para contar as células em uma câmara de Neubauer.
  3. Em cada poço de um sistema de slide 8 poços câmara, espalhe uma base de 40 µ l de ECME puro, seguido de uma incubação de 30 min a 37 ° C.
  4. Em cada poço, colocar 800 células resuspended em 400 µ l de DMEM/F12 (sem vermelho de fenol) completada a etapa 1.1, mas com as seguintes alterações: para células primárias do BrC e células MCF-10A, adicionar 4 ng/mL de EGF e 2% ECME; para o MCF-7 e MDA-MB-231, apenas adicionar 2% ECME.
  5. Incubar as culturas a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente. Substitua a cada 48 h de meios de cultura.
  6. Registro morfológico muda de células cada 24 h por 15 dias com um microscópio óptico. Para analisar a morfologia da primária BrC células, MCF-10A e MDA-MB-231 células são linhas de célula boa referência para exemplos de formação acinares ordenada e desordenadas agressivas câncer-como estruturas, respectivamente.
  7. Obter imagens de células em microscopia de campo claro em 100 X e 200x de ampliação e comparar a morfologia celular com referência MCF-10A e MDA-MB-231 linhas de celulares (Figura 1).

2. obtenção de células de câncer primário do tecido do Tumor

Nota: Para obter células epiteliais tumor usam tecido de tumores primários ressecados da BrC pacientes sem terapia neoadjuvante anterior; evitar áreas de necrose e trabalhar com um mínimo de 0,5 cm3 de tecido do tumor.

  1. Lave o tecido do tumor com PBS 1x estéril e desagregá-lo mecanicamente com um bisturi em fragmentos de 1-2 mm.
  2. Digerir o tecido em um frasco de vidro de 20ml estéril com tampa para 2 h à temperatura ambiente (RT) com 2 mL de solução a seguir: misturar 1 mg/mL colagenase tipo eu e 100 hialuronidase U/mL em DMEM/F12 médio contendo 100 U/mL penicilina e 100 µ g/mL Estreptomicina , com agitação constante.
  3. Filtre a suspensão resultante através de esterilizados pedaços de tule para eliminar grandes peças de tecido não digerido. Filtre a suspensão de células através de uma membrana de µm-poros 100 esterilizado.
  4. As células a 430 x g durante 5 min à RT de pelotas e lavá-los duas vezes com PBS 1x estéril. Cultura primária de células em DMEM/F12 suplementado com 5% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, toxina da cólera 100 ng/mL, hidrocortisona 0,5 de µ g/mL, 10 insulina µ g/mL e 20 ng/mL de EGF. Substituir o medium cada 48 h. manter culturas a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
  5. Certifique-se de que as células isoladas são células epiteliais com um protocolo padrão de imunocitoquímica14. Teste três marcadores epiteliais: um painel de citoqueratinas (PanCK), mucina-1 (Muc-1) e a molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM).

3. isolando PM células de sangue periférico

  1. Extrato de aproximadamente 40 mL de sangue periférico de uma saudável voluntário, diluir o sangue numa proporção de 1:3 com PBS estéril livre de endotoxinas 1x e submetê-la a uma separação de gradiente de densidade.
  2. Em um tubo cônico, coloca 2 mL de meio de diatrizoate polysucrose e de sódio, com uma densidade de 1,077 g/mL. Lentamente e com cuidado sobreposição de 8 mL de sangue diluído. Centrífuga para 30 min, 765 x g a RT. uso a menor velocidade de aceleração-desaceleração do centrifugador.
    Nota: Após a centrifugação, quatro camadas serão formadas de baixo para cima: o pellet de células vermelhas do sangue, a camada média gradiente de densidade, a camada de células mononucleares (ele aparece como um fino anel branco) e a camada de plasma.
  3. Recuperar a camada de células mononucleares de gradiente com uma pipeta Pasteur estéril e cuidadosamente lave três vezes com PBS 1x, cada tempo seguido de centrifugação mais lenta (430, 275 e 191 x g) por 10 min a RT
  4. Use protocolos de seleção negativa para evitar a ativação de células. Um exemplo de tal um protocolo é o seguinte:
    1. Lave as células mononucleares uma vez com uma solução de tampão de lavagem (0,5% albumina de soro bovino, 2 mM EDTA em 1X PBS). Contar as células em uma câmara de Neubauer e ajustá-los em uma densidade de 1 x 107 células/30 µ l de uma solução tamponada.
    2. Para cada 1 x 107 células, adicione 10 µ l de um FcR bloqueio reagente e 10 µ l de um cocktail de biotina-anticorpo de monócitos que contém anti-humanos CD3 CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 e A glucoforina (incluído em kits comerciais).
    3. Misture as células e incube por 15 min a 4 ° C. Adicione um adicional 30 μL de solução tamponada de lavagem mais 20 µ l de microbeads antibiotina (incluído no kit); Misture as células e incube por 20 min a 4 ° C.
    4. Lavagem das células uma vez com uma solução tamponada, centrifugar a 430 x g durante 5 min à RT e ressuspender em 1,5 mL de solução para a separação magnética de tampão.
    5. Carregar a suspensão de células em uma coluna de separação magnética previamente enxaguado e adicionar 7 mL de solução tamponada. Coletar a fração monócito-enriquecido em um tubo cônico de 15 mL, contar as células e se não cultivadas imediatamente, congelar os monócitos em uma densidade de 2 x 106 células/1 mL de DMEM/F12 suplementado com 50% DMSO FBS e 10% −80 ° C.
      Nota: Evite o uso de monócitos após mais de 2 meses de congelamento, como sua viabilidade pode ser comprometida.
  5. Manter as culturas de PMs em DMEM/F12 suplementado com 6% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL, a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
  6. Execute cada conjunto de experimentos utilizando PMs de pelo menos dois doadores diferentes de forma independente, como monócitos agrupamento de diferentes doadores podem resultar em ativação de monócitos.

4. estabelecer 3D culturas co

  1. Culturas co 3D com interação indireta
    Nota:     realizar estes ensaios em placas de cultura de 24-poço fundo plano usando policarbonato celular cultura inserções com membranas de tamanho de poro 0,4 µm. Neste ensaio, tanto sobrenadantes e células podem ser recuperadas no final do experimento.
    1. Cultivar a 2 x 106 monócitos U937 e THP-1 em 10 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, 1% antibiótico/antibacteriano e cultivar PMs frescos completados DMEM/F12 médio (como indicado anteriormente no passo 3.5), a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 meio ambiente.
    2. Placa 4 x 105 monócitos em 1 mL/bem de sua correspondente médio (suplementado com 2% ECME e 2% FBS monócitos U937 e THP-1, ou 2% ECME e 6% FBS para PMs).
    3. Coloque uma inserção em cada poço e adicionar 0,9 mL de 4 x 105 suspensão de células de BrC a médio correspondente (suplementado com 2% ECME e 2% FBS para linha celular comercial ou 5% cavalo soro para células primárias de BrC). Metade do total de mídia substitua cada 48 h.
    4. Incubar a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente por 5 dias e recuperar os sobrenadantes. Recupere células por tripsinização se análise subsequente é executada.
    5. Incluem controles de culturas de células individuais com os respectivos meios de comunicação.
  2. Culturas co 3D com interação direta
    1. Etiqueta BrC células e monócitos com diferentes corantes fluorescentes antes de cultura de células para permitir a classificação independente de cada linhagem de células após cultura para análise da expressão do mRNA e proteínas. Use comercialmente disponíveis derivados de cumarina e rodamina que passam livremente através da membrana celular das células vivas. Um protocolo geral para a rotulagem é o seguinte:
      1. Preparar uma monocamada de células BrC de interesse (2 × 106 células em um frasco de cultura 25 cm2 ) e substituir o padrão médio com solução de trabalho previamente aquecido suficientes do corante fluorescente (1:2, 000 de corante fluorescente no padrão médio de base sem qualquer suplemento). Incubar 30 min a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente. Aspirar a solução corante e lave delicadamente com suficiente 1X PBS. Aspirar a PBS e adicionar o padrão médio.
      2. Trypsinize a monocamada de células com 2 mL de uma solução de EDTA de tripsina e 0,48 mM 0,05% por 5-10 min a 37 ° C. Adicione 200 µ l de FBS parar tripsinização e 7 mL do meio de correspondente sem suplementos. Ressuspender as células pipetando. Tome uma alíquota de 10 µ l para contar as células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
      3. As células a 430 x g durante 5 min à RT de Pelotas (executar este primeiro desde que os monócitos crescem em suspensão). Descartar o sobrenadante e ressuspender delicadamente as células com 3 mL de uma solução de trabalho previamente aquecido do corante fluorescente (1:2, 000 do corante fluorescente em um padrão médio de base sem suplementos). Incubar durante 30 min a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
      4. As células de pelotas novamente, descartar a solução corante e ressuspender delicadamente com 5-7 mL de 1X PBS. Mais uma vez de Pelotas, descartar a PBS e ressuspender as células em 5-7 mL de padrão médio. Tome uma alíquota de 10 µ l de suspensão de células para contar as células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
    2. Definir a cultura co da seguinte forma:: Espalhe bastante ECME no fundo do poço para formar uma camada uniforme em cada poço de um sistema de slide 4-poço de câmara. Chapa de 20 µ l de uma suspensão de célula única contendo 5 × 105 rotulado BrC células por poço.
    3. Depois de 15-20 min de incubação a 37 ° C, adicionar uma suspensão de 2.5 x 105 rotulado monócitos no doseamento de 80 µ l (suplementado com 60% ECME).
    4. Permitir ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    5. Adicione 1 mL de uma mistura 1:1 dos meios de cultura de monócitos e células BrC.
    6. Incubar as culturas co a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente por 24 h, 48 h ou 5 dias para controlar as alterações nos pontos de tempo diferentes.
    7. Degrade proteínas de ECM para recuperar as células das culturas. Aspire e descartar o meio, adicionar 0,5 mL de 1X PBS com tripsina 0,1% e 0,25% de EDTA e incubar durante 3 h a 37 ° C. Após a incubação, adicionar 0,5 mL de 1X PBS com 10% FBS para neutralizar a tripsina e ressuspender as células pipetando vigorosamente para obter uma suspensão de célula única.
    8. Células a 765 x g durante 5 min à RT de Pelotas, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de 1X PBS com 10% FBS. Repita este passo uma vez.
    9. Sujeito a suspensão de eritrócitos para fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação com o instrumento adequado. Certifique-se de que as populações finais são pelo menos 95% de pureza).
    10. Depois da classificação, lavar as células com PBS 1x estéril, pelota (430 x g durante 5 min à RT) e ressuspender em PBS 1x estéril. As células podem ser processadas de acordo com protocolos específicos para isolamento de RNA ou análise de proteínas.
    11. Repeti a cada ensaio três vezes, incluindo culturas 3D de cada linhagem de células individuais como controles.
  3. Interação direta de culturas co 3D para avaliar a degradação do colagénio
    1. Estabelece culturas co 3D celular conforme descrito na etapa 4.2, com o passo adicional de adição de 32,5 µ g/mL de colágeno de tipo IV rotulado com isotiocianato de fluoresceína para o ECME. A concentração final de colagénio IV na ECME é 0,5%. Crescem as culturas em uma lamela de 35mm colocado em um pratos de Petri.
    2. Espalhe uma camada de 40 µ l de ECME na parte inferior da caixa de Petri. Permitir ECME solidificar a 37 ° C.
    3. Adicionar 2,5 x 105 BrC células em 10 µ l do meio e permitir que as células para se estabelecer.
    4. Adicione uma suspensão de 1,25 x 105 U937 monócitos em 40 µ l ensaio suplementado (com 60% de DQ-colagénio IV rotulado-ECME).
    5. Permitir ECME solidificar durante 15-20 min a 37 ° C.
    6. Adicione 2 mL de uma mistura 1:1 de células BrC e meios de cultura de monócitos.
    7. Incubar as culturas co durante 5 dias a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente. Substitua a cada 48 h de meios de cultura.
    8. Analisar a emissão de fluorescência em um microscópio confocal de varredura e medir a densidade óptica integrada (IOD) por 50 µm2 da cultura. Compare IODs contra culturas individuais e a cultura no tempo zero (Figura 2).

5. análise dos sobrenadantes de 3D co culturas com interação indireta

  1. Após 5 dias de co-cultura, recupere os sobrenadantes da parte superior e os compartimentos inferiores das culturas co 3D e de controles individuais cultura 3D. Misture bem cada sobrenadante por pipetagem. Alíquota e loja do sobrenadante a −20 ° C até o uso (até um mês).
    Nota: Manter os sobrenadantes −80 ° C se armazenamento será mais de um mês.
  2. Analise os sobrenadantes com multiplexação plataformas de ensaio, ensaios imunoenzimático (ELISA) ou imunoensaios baseados em grânulo, seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante.
    Nota: Sobrenadantes também podem ser analisadas por Western blot ou concentrados através de filtros de poro específico para obter fracções de proteína tamanho enriquecido para executar análise de zimografia16,17. Como alternativa, use os sobrenadantes como mídia condicionadas para outras experiências, conforme descrito abaixo. Condicionados a mídia geralmente é Obtida de uma cultura de 5 dias (Figura 3).

6. caracterização dos efeitos de sobrenadantes de células primárias BrC na formação de ácinos e estrutura acinar

  1. Em cada poço de um slide de câmara de 8 poços sistema espalhar base 40 µ l de ECME e deixe solidificar durante 30 min a 37 ° C.
  2. Semente 800 MCF-10A células/poço em 400 µ l de meio de cultura DMEM/F12 complementado, como descrito na etapa 1.2.
  3. Adicione 400 µ l de mídia condicionadas ou meio de cultura DMEM/F12 complementado com 20 ng/mL de humano recombinante IL-1 β.
  4. Cheio o slide de câmara em um prato de petri de vidro contendo uma placa de Petri 35mm com 2 mL de PBS para criar um ambiente de umidade.
  5. Substitua o mídia/sobrenadante cada 48 h.
  6. Grave a formação de ácinos glandulares cada 24 h durante 14 dias com microscópio óptico.
  7. Após 14 dias da cultura, mancha acinar com 100 µ l de 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) na concentração de 100 nM em 1X PBS para observar o núcleo de células. Incube durante 25 min no RT em constante agitação. Lavar três vezes com 1X PBS por 5 min, cada vez em agitação constante na RT. montagem os preparativos com um meio de montagem específico para coloração fluorescente. Vedação com esmalte transparente e manter protegido da luz a 4 ° C.
  8. Analise os ácinos com um microscópio confocal, levando imagens de pilhas transversais em diferentes profundidades dos ácinos (Figura 4A, B, C).
  9. Visualize diferentes proteínas celulares nos ácinos com protocolos de coloração adequados. Por exemplo, E-caderina foi manchada para avaliar a aderência de célula para célula, polaridade celular, ou lúmen formação18 (Figura 4-D).

7. ensaios de migração

Nota: Realizar ensaios de migração de U937, PMs THP-1 e frescos em placas de cultura de 24-poço fundo plano usando policarbonato celular cultura inserções com membranas de tamanho de poro de 8 µm. Foi previamente demonstrado que o GM-CSF, quimiocinas MCP-1 e RANTES foram encontradas secretado em concentrações elevadas em culturas 3D individuais das linhas celulares BrC agressivas. Foi proposto que estas citocinas foram fundamentais para atrair os monócitos para o local do tumor primário; Isto foi testado em ensaios de migração usando as citocinas como quimioatraentes.

  1. Cultura U937, PMs THP-1, ou frescos, como descrito no passo 4.1.1.
  2. Lave uma vez cada inserção com 200 µ l de RPMI 1640 sem soro para hidratar a membrana.
  3. Preenchê-lo com 50 µ l de ECME frio, coloque o insere em uma placa de cultura de 24-poço fundo plano e permitem a ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Adicione 180 µ l de RPMI sem FBS no compartimento superior da placa. Adicionar na câmara baixa sem subida µ l 800 de RPMI suplementado com qualquer 100 ng/mL de GM-CSF, MCP-1, ou RANTES como quimiotático. Use o meio sem as citocinas como controlo negativo. Incube durante 30 min a 37 ° C, para estabelecer um gradiente de chemokine.
  5. Lugar de 1,5 x 105 de cada tipo de monócitos em um tubo estéril, lavar duas vezes com 1 mL de 1X PBS e centrifugar 430 x g por 5 min em monócitos RT. Ressuspender em 20 µ l de RPMI sem FBS, colocá-los nas inserções e com muito cuidado, homogeneizar a suspensão de eritrócitos (o volume final da câmara superior é 200 µ l).
  6. Permitir a migração de células ao progresso por 24 h a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
    Nota: Como os monócitos são não-aderente, células migratórias geralmente será na mídia do compartimento inferior.
  7. Remover as pastilhas, recuperar a mídia e contar as células em 2, 4, 6 e 24 h, usando uma câmara de Neubauer ou um citômetro de fluxo; Como alternativa, especialmente se não há células encontram-se na mídia, adquiri imagens da parte inferior das pastilhas com uma câmera digital. A contagem de células média de 3 campos aleatórios (em ampliação de 100 X) é usada para a análise (Figura 5).

8. invasão ensaios

Nota: Realize ensaios de invasão das células BrC em placas de cultura de 24-poço fundo plano usando policarbonato celular cultura inserções com membranas de tamanho de poro de 8 µm. Em nossos estudos originais, IL-8 foi um das citocinas enriquecidas nos sobrenadantes das culturas BrC célula/monócitos 3D co. Se esta citocina estava participando da invasão das linhas celulares BrC foi testado.

  1. Expanda o BrC células em frascos de2 de 75 cm. MCF-7, T47D, HS578T e MDA-MB-231, como descreveram na etapa 1.2 (mas sem ECME) e células de BrC primárias conforme descrito na etapa 2.4.
  2. Lave uma vez que cada cultura de células de membrana em policarbonato 8 µm-poro inserir com 200 µ l de meio sem soro (o meio utilizado depende da linhagem celular testada) para hidratar a membrana.
  3. Preencher a inserção com 50 µ l de ECME frio (média de ECME:cold de diluição de 1:4 sem FBS), coloque o insere em uma placa de cultura de 24-poço fundo plano e permitem a ECME polimerizar durante 1 h a 37 ° C.
  4. Uma vez que o ECME tem polimerizado, adicione 180 µ l da mídia sem FBS respectivas células. Adicione mídia de µ l 800 sem FBS através de fendas da inserção. Incube durante 30 min a 37 ° C, para estabelecer um gradiente de IL-8.
    Nota: Evite criar bolhas na mídia. Mídia usada é sem FBS mas suplementado com 100 ng/mL de IL-8 como quimiotático ou pura mídia sem FBS, como controles negativos.
  5. Obter um total de 6 x 105 células de cada linha de celular da seguinte maneira:
    1. Descartar os sobrenadantes, lave uma vez com 10 mL de 1X PBS e adicionar 2 mL de 0.05% tripsina/0.48 mM EDTA por 2 min a 37 ° C para separar as células. Adicione 4 mL de meio completado para parar a reação de tripsina e ressuspender vigorosamente por pipetagem.
  6. Tire um 10 µ l alíquota da suspensão celular para contar as células em uma câmara de Neubauer. Tome um volume de suspensão de células contendo 6 x 105 células. Centrifugar a 430 x g durante 5 min à RT, desprezar o sobrenadante e lavar as células em 1 mL de 1X PBS. Repita o enxágue mais uma vez.
  7. Ressuspender as células em 20 µ l dos respectivos meios de comunicação sem FBS e lugar nas bulas contendo 180 µ l dos respectivos meios de comunicação sem FBS. Cuidadosamente, homogeneizar a suspensão de células pipetando.
  8. Permitir a invasão de célula ao progresso por 48 h a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 ambiente.
  9. Após 48 h, remova o encaixe, descartar o sobrenadante e lavar a inserir uma vez muito cuidadosamente com 200 µ l de PBS 1x. Com um aplicador com ponta de algodão, retire o excesso de PBS.
    Nota: As células invasoras geralmente são anexadas para o outro lado da inserção como neste caso onde são células aderentes.
  10. Consertar as células, colocando a inserção em um poço de uma placa de cultura de 24-poço fundo plano contendo 1 mL/bem de paraformaldeído 4% por 15 min no RT. depois, lave as inserções uma vez com PBS 1x.
  11. Manchar as células, colocando a inserção em um poço de uma placa de cultura de 24-poço fundo plano contendo 1 mL/bem de 1X PBS com violeta de cristal de 0,2% por 45 min em RT. cuidadosamente, com remover um cotonete todos o ECME da parte superior da membrana , que contém células que não migrar, e enxaguar cuidadosamente com água destilada para evitar eliminando fixo células invasoras.
  12. Conte as células invasoras, observando o lado inferior da inserção sob o microscópio invertido. A contagem de células média de 3 campos aleatórios (em ampliação de 100 X) é usada. Em casos onde as células invadiram como clusters e são difíceis de contar individualmente, adquirir imagens de 3 campos aleatórios (em ampliação de 100 X) com uma câmera digital. Analisar as imagens com o software para análise de imagem e usar o IOD para quantificar a invasão celular (Figura 6).

Resultados

Análise morfológica de células BrC em culturas 3D:

A morfologia das células de BrC primárias cresce em culturas 3D em baixas e altas densidades foi estudada durante 5 dias. Durante as primeiras 48 horas, as células aderirem a ECME e mantêm uma baixa densidade. Neste ponto do tempo, ele pode claramente ser apreciado que células apresentam uma forma alongada do eixo, como, alguns com dois ou mais projeçõ...

Discussão

As células epiteliais crescem em uma conformação espacial 3D e sua interação com as proteínas de ECM é essencial para a homeostase do tecido. Muitos estudos de câncer foram baseados em células cultivadas em monocamadas (2D), e embora eles têm sido fundamentais para a compreensão de muitos aspectos da formação de tumor e progressão, monocamadas não recapitular as características que o ECM impõe às células, para instância: limitar a proliferação, sobrevivência dependente de adesão celular, polaridad...

Divulgações

Os autores declaram que não têm qualquer conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo CONACyT FONSEC ISSSTE/SSA/IMSS projeto n. º 233061 para Ezequiel M. Fuentes-Pananá e pelo Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (número do projeto HIM-2014-053). Sánchez-Espinoza at é um estudante de doutorado do Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa 231663 do CONACYT. AT E-S, também reconhece o apoio financeiro fornecido pelo Instituto mexicano de Seguro Social (IMSS).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1American Type Culture Collection ATCC TIB-202Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10AAmerican Type Culture Collection ATCC CRL-10317Non-transformed breast cell line
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22Breast Cancer Cell line
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133Breast Cancer Cell line
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 mediumGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L glucose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotic/AntimycoticGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine SerumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Horse serum GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered SalineGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisoneSIGMA-ALDRICHH088-5G
Cholera toxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Crystal-violetHycel México541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable supports (inserts)Corning Inc34226.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts)Thermofisher Scientific1406206.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)Nalge Nunc International177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishesMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Referências

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