Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Resumen

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Resumen

Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.

Introducción

Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de^1,2. LA potencia respuestas de células T efectoras habilitando la direccional liberación de citoquinas o, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruyen el APC.

Participación de TCR por pMHC induce la fosforilación rápida de múltiples moléculas de adaptador aguas abajo, incluyendo a Linker para las activación de las células T (LAT), que en última instancia promueve fuerte remodelación del citoesqueleto sináptico². Cortical actinia filamentosa (F-actina) unidades de la célula de T que se separa sobre la superficie de la APC y entonces se resuelve en una estructura anular, caracterizada por la acumulación de la F-actina en la periferia es y agotamiento del centro. Formación del anillo de F-actina se acopla firmemente a la reorientación del centro organizador de microtúbulos (MTOC, también llamado centrosoma en las células de T) a una posición justo debajo del centro de la interfaz. Ambos eventos ocurren dentro de minutos del reconocimiento del antígeno inicial y establecen el contexto arquitectónico en que eventos posteriores de activación y efectora se producen las respuestas.

Para estudiar es formación, varios laboratorios han desarrollado enfoques que la APC se sustituirá por una superficie de vidrio que contiene ligandos inmovilizados de TCR o apoya una bicapa lipídica que sí mismo contiene los ligandos^3,4. Las células T forman contactos es-como en estas superficies que pueden ser reflejadas por el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal, lo que permite estudios de alta resolución de activación temprana de la célula de T y es la formación.

Aunque estos enfoques han permitido la visualización excelente del totalmente montado, gran parte de la ligadura de TCR:pMHC siguiente señalización ocurre dentro de segundos, que complica los esfuerzos para determinar la secuencia de eventos después de la activación del TCR con precisión . Para evitar este problema, se ha desarrollado un enfoque de fotoactivación, que pMHC photoactivatable se utiliza para lograr un control spatiotemporal de TCR activación^5,6,7. En este sistema, las células T se unen a las superficies de vidrio que contienen pMHC photoactivatable que es no estimulantes para el TCR hasta irradiados con luz ultravioleta (UV). La radiación UV de una región de micras de tamaño de la superficie debajo de la célula T quita la photocage crear una zona estimulante que puede ser reconocida por la célula de T. Posteriores eventos de señalización y remodelación citoesqueleto entonces son monitoreados utilizando reporteros fluorescentes genéticamente codificados. Dos versiones de photoactivatable de péptidos antigénicos, polilla citocromo c_88-103 (MCC) y ovoalbúmina_257-264 (OVA), que se presentan en el contexto de la clase II MHC-E^k y la clase I MHC H2-K^b, respectivamente, han sido desarrollados (figura 1). Esto permite el análisis de ambos CD4⁺ T las células específicas para MCC-E^k (expresando lo 5 C. C7, 2B4, o y TCR) y CD8⁺ T las células específicas para OVA-H2-K^b (expresan el TCR de OT1).

En la última década, el enfoque de fotoactivación y proyección de imagen de TCR se ha utilizado para establecer la cinética precisa de TCR primeros pasos de señalización y también para identificar las vías moleculares que regulan la remodelación citoesqueleto polarizados^{5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. por ejemplo, el ensayo era instrumental en la determinación de que el centrosoma reorientación hacia la APC está mediado por un gradiente localizado de lo lípidos segundo mensajero diacilglicerol centrada en el es. Se prevé que esta metodología seguirá siendo valioso para aplicaciones que exigen análisis proyección de imagen de alta resolución de la función de la célula de T.

Protocolo

1. preparación de superficies de vidrio estimulante

1. Cubre-objetos de capa bien ocho cámara con biotinilado poli-l-lisina (Bio-PLL) diluyen 1: 500 en agua destilada, desionizada (ddH₂O). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
2. Lavado con H₂O.
3. Secado por 2 h a TA.
4. Bloque de Bio-PLL cubrió superficies con solución amortiguadora de bloqueo (HEPES-solución salina con tampón [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) por 30 min a TA.
   1. Disolver 5 mg de bromhidrato de poli-l-lisina en 1 mL de 10 mM NaPO₄, pH 8.5.
   2. Añadir 125 μmol (0,55 mg) del NHS-biotina (de un stock de 100 mg/mL en DMSO) y compruebe el pH de la reacción. Si el pH está por debajo de 8.5, añadir 2 μL de 4 N NaOH para elevarla a entre pH 8.5 y 9.5.
   3. Vortex durante 30 minutos.
   4. Calmar la reacción con 50 μL de 100 mM glicina disuelta en 20 mM Tris de pH 8,0.
   5. Girar a plena potencia durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
      Nota: Calidad de Bio-PLL es típicamente comparado con anteriores preparaciones por capa dos diluciones en serie del material sobre una placa de ELISA de 96 pocillos y cuantificar el contenido de biotina tras incubación con fosfatasa alcalina unida estreptavidina.
5. Retire el amortiguador de bloqueo. No permita que los pozos se sequen. Añadir estreptavidina (100 μg/mL en solución amortiguadora de bloqueo). Incubar durante 1 h a 4 ° C.
6. Lave en HBS. Llenar e invierta pozos de diapositiva de cámara 4 - 5 veces, quitando HBS de los pozos. No permita que los pozos se sequen.
7. Añadir el biotinilado pMHC ligandos y moléculas de adhesión a la superficie.
   Nota: MCC y los óvulos pueden ser photocaged mediante la adición de ortho-Nitrobencilo basado en grupos de protección (por ejemplo, nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para el grupo ε-amino de lisinas claves (K12 en MCC, K7 en OVA). Photocaged MCC y los óvulos pueden obtenerse de proveedores comerciales. Después de la reconstitución en buffer acuoso, ellos son replegados en bacteriano expresada-E^k y H2-K^b utilizando enfoques establecidos^11,12.
8. Validación del péptido MCC o OVA photoactivatable
   1. Decage péptidos NVOC protegido por irradiación UV con una lámpara UV de mano (véase Tabla de materiales) por 20 min a TA.
   2. Pulso 1.0 x 10⁵ vehículos blindados con 1 μm de péptido nonstimulatory (control negativo, por ejemplo, Hb), irradiados photoactivatable péptido péptido photoactivatable irradiado y péptido de agonista (control positivo, por ejemplo, MCC) durante 1 h a durante la noche a 37 ° C.
   3. Para estimular células T expresando el C. 5 C7/2B4/y TCR, uso CH12 o células B CH27. Para estimular las células de T de OT1, utilizar RMA-s o EL4 thymoma células.
   4. Mezclar el APCs pulsadas con igual número de células T en 96 pocillos redondos placas de fondo en un volumen final de 200 μl. incubar a 37 ° C durante 12-24 h.
   5. Recuperar el sobrenadante de cada pozo y analizar IL-2 por ELISA con detección colorimétrica de peroxidasa estreptavidina-rábano.
      Nota: Se recomienda confirmación del estado de los péptidos por espectrometría de masas por electrospray antes refolding en complejos de MHC, jaulas.
9. Realizar el plegado y la purificación de MHC con el fin de minimizar la exposición a la luz. Por ejemplo, envuelven reacciones de plegamiento de papel de aluminio y llevar a cabo cromatografía de gel filtración con la lámpara Ultravioleta de.
   Nota: Se ha encontrado photoactivatable MCC-E^k y OVA - H2-K^b inducir la activación de células T independientes de UV en alta densidad, posiblemente debido a la incompleta jaulas funcional. Por lo tanto, la photoactivatable pMHC se diluye en un 10-30 x exceso de pMHC nonstimulatory (e.g. -E^k que contiene el péptido de_64-76 de hemoglobina (Hb)) durante la etapa de inmovilización. Esto mejora la relación señal a ruido del experimento de imágenes posteriores.
10. Para Fotoactivar CD4⁺ T las células, colectivamente utilizan una mezcla de biotinilado Hb-E^k (3 μg/mL), biotinilado photoactivatable MCC-E^k (0,1 μg/mL) y el anticuerpo biotinilado contra la clase I MHC H2-K^k (0,5 μg / mL). los anticuerpos de anti-H2-K^k anima a 5 C. C7/2B4/y T las células, que expresan H2-K^k, extender sobre la superficie de vidrio sin sufrir activación.
11. Para CD8⁺ T células, use una mezcla de biotinilado H2 D^b teniendo el péptido KAVYDFATL (1 μg/mL), biotinilado photoactivatable OVA-H2-K^b (0,1 μg/mL) y el dominio extracelular de la molécula de adhesión ICAM-1 (2 μg/mL producido por insectos de la célula cultura¹³). El ICAM-1 favorece la formación contacto cercana enganchando la integrina LFA1 en la superficie de la célula de T.
12. Aplicar todas las mezclas de proteínas en solución amortiguadora de bloqueo, seguido por incubación durante 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: La densidad molecular en las superficies de este tipo que ~ 8000 por μm² ha sido previamente⁶. Que pMHC photoactivatable representa ~1/30^to de la proteína biotinilada en la superficie, su densidad será ~ 267 moléculas por μm², antes de decaging.
13. Lavar como en el paso 1.6 y deje en HBS hasta que esté listo para usar.
14. Añadir 200.000 CD4⁺ o CD8⁺ T expresan el TCR adecuado en cada pocillo de las células y permitir que las células se adhieran a 37 ° C durante 15 minutos. Una vez las células se han unido a la extensión en la superficie, están listos para la fotoactivación y proyección de imagen.
    Nota: Transducción Retroviral de células efectoras T con fluorescente puntas de prueba de la proyección de imagen se describe en detalle cordón^6,7. Señalización de calcio también se puede estudiar usando las células de T untransduced con el tinte sensible del calcio Fluo-4⁶. El tinte radiométrica Fura-2 no se recomienda porque requiere excitación en el rango de UV, que también induce la decaging de la photoactivatable pMHC.

2. adquisición de la imagen

1. Usar un microscopio TIRF invertido con un objetivo X UV 150 compatible para la adquisición de la imagen. UV irradiar regiones definidas por el usuario mediante un sistema de diafragma digital conectado a una lámpara de mercurio de 100 W (HBO). Luz de esta lámpara sobre la muestra utilizando un espejo de pase largo 400 nm UV directa.
2. Utilizar software de análisis de imagen para la fotoactivación localizada y adquisición de Time-lapse. En la mayoría de los experimentos, controlar las puntas de prueba en los canales rojos y verdes con 488 nm y 561 láseres de excitación nm, respectivamente. Luz láser se dirige sobre la muestra utilizando un espejo dicroico de doble banda que transmite también en la gama ultravioleta (para decaging). Por favor vea la Tabla de materiales y la figura 6 para obtener información adicional sobre la configuración del microscopio.
3. Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células de T, ajuste la configuración para obtener iluminación TIRF o epifluorescencia, según sea necesario. En modo live, seleccione el campo de las células que están expresando la sonda fluorescente de interés. Establecer regiones de microescala para la fotoactivación por debajo de las células individuales utilizando el software de control.
4. Comenzar la adquisición de Time-lapse. Por lo general, se adquieren los puntos de 80 tiempo, con un intervalo de 5 s entre cada punto del tiempo. Esto deja tiempo más que suficiente para secuencial 488 nm y 563 exposiciones nm, en el caso de los experimentos de doble color.
5. Después de 10 puntos de tiempo, Fotoactivar las regiones seleccionadas al abrir el diafragma digital del obturador de 1-1.5 s.
6. Una vez finalizado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de las células y repetir el proceso.

3. Análisis de los datos

Nota: Fotoactivación localizada de ligandos inmovilizados crea una región estimuladora bien definida y estacionaria, que puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la señalización de las respuestas y eventos remodelación citoesqueleto. Análisis de protocolos generalmente involucran cuantificación de la intensidad de fluorescencia dentro de la región irradiada o utilizando la región irradiada como un extremo posicional para medidas de distancia (ej. para evaluar la polarización del centrosoma a la irradiado a región). A continuación se describen ambos protocolos de análisis. Varios programas de análisis de imagen interactiva pueden utilizarse para hacer intensidad y medidas de la distancia, que pueden ser salida de procesamiento adicional y análisis.

1. Intensidad de fluorescencia
   1. Determinar la intensidad de fluorescencia (FI) de una región de fondo fuera de la célula (FI_b). Esto se utilizará para la corrección de fondo.
      1. Dibuja una región cuadrada de tamaño micrométrico fuera de la célula y hacer una máscara. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.
         Nota: Ver detalles de procedimiento (p. ej. 3.1.1.1) software Slidebook (véase Tabla de materiales). Aplicación del presente Protocolo con otros paquetes de software (por ej., FIJI) será ligeramente diferente.
   2. Determinar la FI dentro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo.
      1. Seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Para determinar la intensidad de fluorescencia, haga clic en analizar | Estadísticas de la máscara. Seleccione Intensidad de fluorescencia media y los valores de exportación.
   3. Restar el fondo FI de los valores medidos de FI dentro de la región. Entonces, normalizar las mediciones de FI corregidas dividiendo por la media, antecedentes corrección FI de los primeros 9 marcos antes de fotoactivación. ΔF/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      Nota: El gráfico ΔF/F como una función del tiempo.
2. Distancia
   1. Obtener x e y coordenadas del centro de la región de fotoactivado.
      1. Para determinar x e y coordenadas del centro de la región de Fotoactivado, seleccione máscara para resaltar la región que se fotoactiva. Una vez que se destaca la región de fotoactivación, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.
   2. Determinar x e y las coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés para cada momento. Esto se logra normalmente a través de rastreo de partículas ya sea manual o automatizado.
      1. Para determinar x e y coordenadas de la punta de prueba fluorescente de interés, seleccione Manual de seguimiento de partículas y haga clic en la punta de prueba fluorescente de interés con el tiempo. Una vez que han sido rastreados todos los puntos de tiempo, seleccione analizar | Estadísticas de la máscara | Centro de zona y los valores de exportación.
   3. Calcular la distancia entre la proteína fluorescente de interés y el centro de la región de fotoactivado para cada punto del tiempo usando la ecuación: distancia = √ ((x₂- x₁)²+ (y₂-y₁)²), en que x₂ y y₂ son las coordenadas de la proteína fluorescente de interés y x₁ y y₁ son las coordenadas del centro de la región de fotoactivado.
   4. Gráfico de la distancia en función del tiempo.

Resultados

El enfoque de fotoactivación y proyección de imagen permite observación y fácil cuantificación de respuestas señalización rápidas, polarizadas. Para ilustrar sus capacidades, reproducidos aquí es un experimento examinando la correlación espacio-temporal entre la acumulación inducida por TCR DAG y reorientación del centrosoma. 5C. T C7 celular ráfagas fueron retrovirally transduced con dos reporteros fluorescentes: un biosensor de DAG que contienen los dominios C1 de tándem d...

Discusión

En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500	Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK			For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1			For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp	UVP	UVGL-25	Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.	Olympus		Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations