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要約

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。

要約

T リンパ球は、TCR 活性化の後数分以内に発生する急速な偏波伝達に従事します。これは免疫学のシナプスでは、T 細胞の活性化を調節し、エフェクターの応答を方向ターゲット ステレオタイプ化された細胞の接合部の形成を誘導します。これらのプロセスを効果的に勉強するには、高速、偏光応答をキャプチャに合ったイメージング アプローチが必要です。このプロトコルでは、活性型ペプチド主要組織適合複合体 (pMHC) 紫外線にさらされてまでに非刺激されるに基づいているそのようなシステムについて説明します。正確に TCR 活性化の時空間制御とイメージング内部全反射 (TIRF) によってそれに続く細胞応答の高解像度監視が可能ビデオ顕微鏡の実験中にこの試薬のターゲット decaging。このアプローチはまた遺伝学的および薬理学的摂動戦略と互換性があります。これにより免疫学のシナプスの根底にある偏光の骨格の形成に TCR シグナリング リンク明確の分子経路の組み立てのため。

概要

T リンパ球 (T 細胞) 細胞表面 MHC のコンテキストに表示された抗原ペプチドを認識し、細胞性免疫の中心的な役割を再生します。TCR による抗原認識はナイーブ T 細胞の分化をドライブし、エフェクター集団による細胞傷害性とコミュニケーションの応答の配信を促進します。TCR の婚約は、細胞アーキテクチャの劇的な変化を誘導します。分以内に、T 細胞は抗原提示細胞 (APC) の免疫学的シナプス (IS)1,2として知られている偏光インターフェイスを形成側に gloms します。IS は、サイトカインや細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl)、溶菌タンパク質 APC を破壊する場合の方向のリリースを有効にするエフェクター T 細胞の反応を増強します。

PMHC TCR 婚約は、最終的に堅牢なシナプス細胞骨格2の改造を促進する活性化 T 細胞 (LAT) のリンカーを含む複数のダウン ストリーム アダプター分子の迅速なリン酸化を誘導します。皮質アクチン フィラメント (アクチン) APC 表面上で広がっている T 細胞をドライブし、F アクチン集積は周縁と中心からの枯渇によって特徴付けられる環状の構造に解決します。F-アクチン リングの形成は微小管組織センター (脂質、T 細胞の中心体とも呼ばれます) の向きかえに密し、インタ フェースのセンターのすぐ下に位置します。両方のイベントは、初期の抗原認識の分内で発生し、それ以降のアクティブ化イベントとエフェクターの応答が発生する建築のコンテキストを確立します。

形成を研究、さまざまな研究機関は、APC は TCR リガンドの固定化を含むかまたはサポート自体が配位子3,4を含む脂質二分子膜ガラス表面で置き換えられますのアプローチを開発しました。T 細胞は、内部全反射蛍光顕微鏡 (TIRF)、共焦点顕微鏡、初期の T 細胞の活性化とは形成の高分解能解析を有効にするイメージを作成することができますこれらの表面上はのような連絡先を形成します。

これらの方法が完全に組み立てられたは優秀な可視化のため許可されていますが、信号の次 TCR:pMHC 結紮の多く発生してから数秒、TCR 活性化を正確に次のイベントのシーケンスを確認する努力を複雑.この問題を回避するために、活性型 pMHC が TCR 活性化5,6、7の時空間的制御を達成するために使用されている、photoactivation アプローチが開発されています。このシステムで T 細胞は TCR 紫外線 (UV) を照射するまでに非刺激は活性型 pMHC を含むガラス表面に添付されます。T 細胞の下にある表面の微小領域における紫外線照射は、T 細胞が認識できる刺激ゾーンを作成する photocage を削除します。その後主セルシグナ リング イベントと細胞骨格改造は、遺伝子にエンコードされた蛍光レポーターを使用してに監視されます。抗原ペプチド、蛾チトクロム c-88 103 (MCC) 及び卵白アルブミン257-264 (OVA) 提示されており、クラスとクラス II MHC-Ekのコンテキストで私 MHC H2 Kb、それぞれ、2 つの活性型バージョンされています。(図 1) を開発しました。これにより、両方の CD4 の解析+ T 細胞 MCC Ek (5 C を表現するために特定C7、2B4、またはと Tcr) および CD8+ T 細胞 (OT1 TCR を表現する) OVA H2 Kbの特定。

初期 TCR シグナリング手順の正確な動態を確立する、また偏光骨格改造5,を支配する分子経路を識別するために過去 10 年間、TCR の photoactivation とイメージングのアプローチに利用されています。6,7,8,9,10です。 たとえば、アッセイはその体を決定する際に尽力した APC に向かって方向転換が中心ですが脂質第 2 メッセンジャー ジアシルグリセロールキナーゼのローカライズされたグラデーションによって媒介されます。この方法論は T 細胞の機能の高解像度イメージング解析が要求される用途に貴重なことを続けることが予想されます。

プロトコル

1. 刺激ガラス表面の準備

  1. ビオチン化ポリ L-リジン (バイオ PLL) のコート 8 ウェル腔症 coverglass 希釈蒸留水、脱イオン水 (ddH2O) のレバレッジです。部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。
  2. H2O を洗う
  3. 室温 2 時間ドライ
  4. 塗装室温 30 分間ブロック バッファー (HEPES 緩衝生理食塩水 【 10 mM HEPES ペーハー 7.4、150 mM の NaCl、2 %bsa を用いた) と面のブロック バイオ PLL
    1. 10 mM ナポ4、pH 8.5 の 1 mL 中ポリ L リジン臭化水素酸塩 5 mg を溶解します。
    2. (DMSO 入荷 100 mg/mL) から NHS ビオチンの 125 μmol (0.55 mg) を追加し、反応の pH をチェックします。PH が 8.5 以下の場合は、pH 8.5 と 9.5 の間にそれを高めるために 4 N NaOH の 2 μ L を追加します。
    3. 30 分の渦。
    4. 20 mM Tris pH 8.0 に溶解し 100 mM グリシンの 50 μ L で反応を消します。
    5. 10 分間フルパワーで回転し、上清を新しいチューブに転送します。
      注: バイオ PLL 品質は 96 ウェル elisa 用プレートの上に材料のシリアルの 2 倍希釈液を塗布し、アルカリ性ホスファターゼの孵化はストレプトアビジン結合後にビオチン含量を定量化の前準備と比較して通常。
  5. ブロック バッファーを削除します。井戸を乾燥させるようにしてください。ストレプトアビジン (ブロック バッファー 100 μ g/mL) を追加します。4 ° C で 1 時間インキュベートします。
  6. HBS で洗ってください。記入し、井戸から HBS の取り外し 4-5 回、チャンバー スライド井戸を反転します。井戸を乾燥させるようにしてください。
  7. ビオチン標識 pMHC 配位子と接着分子を表面に追加します。
    注: MCC と OVA オルソ ニトロベンジルを追加することによって photocaged による可能キー リシンの ε-アミノ基を保護基 (例えばnitrophenylethyl (NPE) または nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (MCC、OVA で K7 で K12)。Photocaged MCC と OVA は、商用ベンダーから入手できます。緩衝水溶液で溶解後彼らは大腸菌で発現させた-Ekと確立されたアプローチ11,12で H2 Kbに refolded です。
  8. 活性型クライアントまたは OVA ペプチドの検証
    1. ハンドヘルド UV ランプで紫外線照射することにより NVOC で保護されたペプチドを decage (材料表参照) 室温に 20 分間
    2. パルス 1.0 x 105 Apc nonstimulatory ペプチド (否定的な制御、例えばHb)、1 μ m は、1 h の活性型ペプチド、照射活性型ペプチドおよびアゴニスト ペプチド (肯定的な制御、例えばMCC) を非照射37 ° C で一晩します。
    3. 5 C を発現する T 細胞を刺激するためにC7/2B4/と TCR や使用 CH12 CH27 B 細胞OT1 T 細胞を刺激するには、RMA-s または EL4 胸腺細胞を使用します。
    4. T 細胞の数と同じ数のパルスの Apc をミックス 96 ウェル底板 200 の最終巻でラウンド μ L。 37 ° C、12-24 時間で孵化させなさい。
    5. 各ウェルから培養上清を回復し、ストレプトアビジン西洋わさびの過酸化酵素比色検出で elisa 法による IL-2 を分析します。
      注: ケージすべてのペプチッド MHC 複合体に巻き戻しする前にエレクトロ スプレー質量分析法による現況の確認は強くお勧めします。
  9. 折りたたみと光への露出を最小限に抑えるために MHC の浄化を実行します。たとえば、アルミ箔の折れたたみ反応をラップし、UV ランプ消灯をゲルろ過クロマトグラフィーを行います。
    注: それはその活性型 MCC Ekを発見されているし、OVA-H2 Kbが不完全な機能ケージングのための高密度 UV 独立した T 細胞の活性化を誘導します。したがって、活性型 pMHC は、固定ステップの間に nonstimulatory pMHC (例えば- Ekヘモグロビン64 76ペプチド (Hb) を含む) の 10-30 x 過剰に希釈されています。これは、信号対ノイズ比以降イメージング実験の向上します。
  10. Photoactivate CD4 に+ T 細胞、総称クラスに対してビオチン化抗体、ビオチン化活性型 MCC Ek (0.1 μ g/mL)、ビオチン化 Hb Ek (3 μ g/mL) の混合物を使用して私は MHC H2 Kk (0.5 μ g/mL). アンチ H2 Kk抗体は 5 C を奨励C7/2B4/と T 細胞は、H2 Kk、活性化を経ることがなくガラス表面上に広がる表現。
  11. CD8 の+ T 細胞は、ビオチン化ペプチド KAVYDFATL のベアリング H2 Dbの混合物を使用 (1 μ g/mL)、ビオチン化活性型 OVA H2 Kb (0.1 μ G/ml)、ICAM 1 接着分子の細胞外ドメイン (2 μ g/mL昆虫の細胞培養13によって生成)。ICAM 1 は、T 細胞表面のインテグリン LFA1 の従事によって近いコンタクト形成を奨励しています。
  12. RT で 1 時間または 4 ° C で少なくとも 2 時間の潜伏が続くブロックのバッファーのすべての蛋白質の混合物を適用します。
    注: ~ 8000 μ m2ごとにこの種の表面の分子の密度は、以前に決定された6をされています。活性型 pMHC ~1/30 を表すことを考えるその密度の表面のビオチン化タンパク質のthは μ m2、decaging 前あたり 267 ~ 分子になります。
  13. ステップ 1.6 のように洗浄し、使用する準備ができるまで HBS に残します。
  14. 200,000 CD4 を追加+または CD8+ T 細胞の各ウェルに適切な TCR を表現でき、37 ° C 15 分で付着する細胞。細胞に接続されているし、表面の上に広げ、光と画像の準備ができています。
    注: エフェクター T 細胞蛍光イメージング プローブのレトロ ウイルスの伝達は、詳細 elswhere6,7で説明されます。カルシウム シグナルも研究できるカルシウム敏感な染料蛍光 46搭載 untransduced の T 細胞を用いたします。レシオ メトリック色素も活性型 pMHC の decaging を誘発する紫外線の範囲における励起が必要なために、フラ 2 は推奨されません。

2. 画像の取得

  1. 画像取り込み用 UV 対応 150 X 対物レンズと倒立の全反射顕微鏡を使用します。UV 照射 100 W 水銀ランプ (HBO) に接続されたデジタル ダイヤフラム システムを使用してユーザー定義の領域です。400 nm ロングパス ミラーを使用してサンプルにこのランプから紫外線を直接します。
  2. ローカライズされた光と時間経過の取得イメージ解析ソフトウェアを使用します。ほとんどの実験では 488 を使用して緑と赤の両方のチャネルにプローブを監視 nm と 561 nm 励起レーザー、それぞれ。レーザー光は、(decaging を有効にする) に紫外線範囲の送信もデュアル帯域ダイクロイック ミラーを使用してサンプルに指示されます。顕微鏡の構成については、材料表と図 6をご覧下さい。
  3. T 細胞を含むチェンバー スライドをマウントした後、必要に応じて、全反射や落射蛍光照明を取得する設定を調整します。ライブ ・ モードでの関心の蛍光の渦を表現しているセルのフィールドを選択します。ソフトウェア コントロールを使用して個々 のセルの下にある光のミクロン スケール領域を確立します。
  4. コマ撮りの集録を開始します。5 の間隔で 80 の縦長の取得、通常、時間の各ポイントの間の s。これはシーケンシャル 488 よりも十分な時間を残します nm とデュアル カラー実験の場合、563 の nm 露光。
  5. 後 10 縦長、photoactivate デジタルのダイヤフラムを開くことによって選択された領域 1 1.5 秒のシャッターします。
  6. 時間の経過が完了したら、セルの新しいフィールドを選択し、プロセスを繰り返します。

3. データ分析

注: 固定化リガンドのローカライズされた光は、応答と細胞骨格の改造イベントをシグナル伝達の定量的解析に使用することができます明確に定義された、静止刺激領域を作成します。プロトコルは通常照射領域内の蛍光強度の定量化または距離測定位置のエンドポイントとして照射領域の使用を含む分析 (e.gに中心体の偏波を評価するため、。照射領域)。両方の分析のプロトコルは次のとおりです。様々 なインタラクティブな画像解析プログラムは、強度と追加の処理や分析の出力をすることができますし、距離の測定に使用できます。

  1. 蛍光強度
    1. (FIb) 細胞外背景領域の蛍光強度 (FI) を決定します。これは、バック グラウンド補正のため使用されます。
      1. セルの外側ミクロン サイズの正方形の領域を描画し、マスクを作る。分析をクリックして蛍光強度を決定する |統計情報をマスク。平均蛍光強度を選択し、値をエクスポートします。
        注: (例えば3.1.1.1) 手続きの詳細は、Slidebook ソフトウェアを参照してください (表の資料を参照してください)。他のソフトウェア パッケージを使用してこのプロトコルの実装 (例えば.、フィジー) わずかに異なるになります。
    2. 各時点のセンサー領域内で FI を決定します。
      1. マスクされたセンサー領域を強調表示するを選択します。分析をクリックして蛍光強度を決定する |統計情報をマスク。平均蛍光強度を選択し、値をエクスポートします。
    3. 地域内で FI 値測定値からバック グラウンド FI を減算します。修正付き測定を平均値で割ることによって正規化、背景修正 FI の photoactivation の前にまず 9 フレーム。ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FI のb))。
      注: グラフ ΔF/時間の関数として F。
  2. 距離
    1. X と y を得るセンサー領域の中心の座標。
      1. X と y にセンサー領域の中心の座標がマスクされたセンサー領域を強調表示するを選択します。Photoactivation の領域が強調表示されます、分析を選択 |統計情報をマスク |エリアの中心と値をエクスポートします。
    2. X と y それぞれの時間ポイントの関心の蛍光プローブの座標。これは通常、手動または自動のいずれかの粒子追跡を実現します。
      1. X と y 座標、関心の蛍光プローブのマニュアル粒子追跡を選択し、時間をかけて興味の蛍光プローブをクリックします。すべての時間ポイントを追跡されている、分析を選択 |統計情報をマスク |エリアの中心と値をエクスポートします。
    3. 興味の蛍光蛋白質と式を使用して各時間ポイント センサー領域の中心間の距離を計算する: 距離 = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2)、2 y の x2に関心と x1 , y1の蛍光蛋白質の座標は、センサー領域の中心の座標。
    4. 時間の関数として距離をグラフ化します。

結果

Photoactivation とイメージングのアプローチは、観察と急速に、偏光のシグナリング応答の簡易定量化します。再現、その機能を説明するためにここでは、DAG の TCR による蓄積と中心体の向きかえの時空間相関を調べる実験。5 CC7 T 細胞芽球が蛍光レポーター遺伝子導入した: 蛋白質キナーゼ C θ からタンデム C1 ドメインを含む DAG バイオ GFP (C1 GFP) と RFP チューブリン中?...

ディスカッション

近年では、光は細胞プロセスの時空制御の活性化のための優れたツールとして浮上しています。さまざまな方法論が開発されて、それぞれ関連する利点と欠点を持つ。固定化、細胞外リガンドの decaging に基づいて、ここでは、記載されているシステムは、迅速な細胞内局在、偏光のシグナリング応答の解析に最適です。このアプローチは、上記のように T 細胞では形成を調べるに適用されて...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

アドバイスと支援の布施研究室のメンバーに感謝いたします。米国国立衛生研究所 (R01-AI087644 かに)、メモリアル ・ スローン ・ ケタリング癌センターに P30 CA008748 によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassThermofischer Scientific155361
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP2636Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-BiotinThermofischer Scientific20217Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
StreptavidinThermofischer Scientific434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kitAvidityBirA500Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK AnaspecCustom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibodyBD Biosciences553591
Biotinylated NPE-OVA H2-KbAnaspecCustom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db AnaspecCustom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1 For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lampUVPUVGL-25Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.OlympusAdditional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragmAndor
Slidebook softwareIntelligent Imaging Innovations

参考文献

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134 T T TCR Pmhc TIRF

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