JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод на основе изображений для активации Т-лимфоцитов с помощью photoactivatable пептид MHC, позволяя точный контроль пространственно-временных активации Т-клеток.

Аннотация

Т-лимфоциты участвовать в быстрой, поляризованных сигналов, происходящие в течение нескольких минут после активации TCR. Это стимулирует формирование иммунологической синапса, стереотипных ячеек перекрестка, который регулирует активация Т-клеток и направленно целевых эффекторные реакции. Эффективно изучить эти процессы необходимо изображений подход, предназначена для захвата быстрый и поляризационные ответы. Этот протокол описывает такую систему, которая основана на photoactivatable пептид майор гистосовместимости комплекс (реализует), не стимулирующее, до тех пор, пока она подвергается воздействию ультрафиолетового света. Целевые decaging этого реагента во время videomicroscopy экспериментов позволяет точное управление пространственно-временных TCR активации и с высоким разрешением мониторинга последующих клеточных реакций на полного внутреннего отражения (TIRF) изображений. Этот подход также совместим с генетических и фармакологические возмущений стратегий. Это позволяет для Ассамблеи четко молекулярные пути, связывающие TCR сигнализации для формирования поляризованные цитоскелета структур, которые лежат в основе иммунологические синапса.

Введение

Т-лимфоциты (Т-клетки) играют центральную роль в клеточный иммунитет, признав антигенные пептиды, отображаемые в контексте клеточной поверхности MHC. Антигены, которые при посредничестве TCR, диски дифференцировки клеток наивно T и способствует доставки коммуникативные и цитолитических ответов эффекторных населением. TCR участия также вызывает драматические изменения в сотовой архитектуры. В течение нескольких минут Т-клетки gloms на сторону антиген представляющих клеток (APC), образуя поляризованные интерфейс, известный как иммунологический синапса (IS)1,2. IS потенцирует ответы эффекторных клеток T, позволяя направленная релиз цитокинов или, в случае цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), литические белки, которые уничтожить БТР.

TCR участия реализует вызывает быстрое фосфорилирование несколько ниже по течению адаптер молекул, включая компоновщика для активации Т-клеток (LAT), которые в конечном итоге способствует надежной реконструкции синаптических цитоскелета2. Корковых нитчатые актина (F-миозина) диски Т-клеток, посыпка APC и затем распадается на кольцевые структуры, характеризуется F-актина накопления на периферии IS и истощение от центра. F-актина кольцо формирования тесно связана к переориентации организационного центра микротрубочек (КТВМ, также называется центросом в Т-клетки) в позицию непосредственно под центром интерфейса. Оба эти события происходят в течение нескольких минут первоначальных антигены и установить архитектурных контекст, в котором последующие активации событий и эффекторные реакции происходят.

Для изучения является формирование, различные лаборатории разработали подходы, в которых БТР заменяется на стеклянной поверхности, который содержит иммобилизованных TCR лигандами или поддерживает липидный бислой, что сама содержит лигандов3,4. Т-клетки формируют IS-подобных контактов на этих поверхностях, которые могут быть imaged полное внутреннее отражение флуоресцентным микроскопом (TIRF) или конфокальная микроскопия, позволяя высокого разрешения исследования ранних активация Т-клеток и формирования IS.

Хотя эти подходы позволили отличные визуализации полностью собранный есть, большая часть сигналов следующих лигирование TCR:pMHC происходит в течение нескольких секунд, осложняет усилия определить последовательность событий после активации TCR точно . Для обхода этой проблемы, был разработан photoactivation подход, в котором photoactivatable реализует используется для достижения пространственно-временных TCR активации5,6,7. В этой системе Т-клетки прикреплены к поверхности стекла, содержащие реализует photoactivatable, который не стимулирующий характер TCR пока облученных ультрафиолетового (УФ) света. УФ-облучения микрон размера региона поверхности под Т-клеток удаляет photocage, создание стимулирующей зоны, которые могут быть признаны Т-клеток. Последующие события сигнализации и цитоскелета ремоделирования затем контролируются с помощью генетически закодированный флуоресцентные журналистам. Две версии photoactivatable антигенные пептиды, моли цитохрома с88-103 (MCC) и овальбумина257-264 (OVA), которые представлены в контексте класса II MHC-Ek и класса я MHC H2-Kb, соответственно, были разработал (рис. 1). Это позволяет анализ обоих CD4+ T-клеток для MCC-Ek (выражая 5 C. C7, 2B4, или и TCRs) и CD8+ T-клеток для OVA-H2-Kb (выражения OT1 TCR).

За последнее десятилетие TCR photoactivation и изображений подход был использован установить точное кинетика раннего TCR сигнализации шаги, а также выявить молекулярные пути, регулирующие поляризованные цитоскелета ремоделирования5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Например, assay сыграл важную роль в определении что Центросома переориентации к СВУ опосредуется локализованных градиент липидов второй посланник диацилглицерол центрирована на ИС. Предполагается, что эта методология будет продолжать быть ценным для приложений, которые требуют высокого разрешения изображений анализ функции Т-клеток.

протокол

1. Подготовка стимулирующее стеклянных поверхностей

  1. Coverglass пальто восемь ну патрон с биотинилированным поли L-лизин (био-PLL) разводят 1: 500 в дистиллированной деионизированной воде (ddH2O). Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Вымойте с H2O.
  3. Химчистка для 2 ч на RT.
  4. Блок био-PLL покрытием поверхностей с блокирующий буфер (HEPES-амортизированное saline [10 мм HEPES рН 7,4, 150 мм NaCl], с 2% BSA) за 30 мин на RT.
    1. Растворяют 5 мг гидробромида поли L-лизин в 1 мл 10 мм Напо4, рН 8,5.
    2. Добавить 125 мкмоль (0,55 мг) ГСЗ-биотин (от 100 мг/мл бульона в ДМСО) и проверить рН реакции. Если рН ниже 8.5, добавьте 2 мкл 4 N NaOH поднять его между pH 8,5 и 9.5.
    3. Вихрь 30 мин.
    4. Утолите реакции с 50 мкл 100 мм глицин, растворяют в 20 мм трис рН 8.0.
    5. Спина на полную мощность в течение 10 минут и передать новой трубки супернатант.
      Примечание: Био-PLL качества обычно сравнивается с предыдущей подготовки покрытие серийных разведений два раза материала на тарелку ИФА 96-луночных и количественного определения содержания биотина после инкубации с щелочной фосфатазы в сочетании стрептавидина.
  5. Удалите блокирующий буфер. Не позволяйте скважин для просушки. Добавьте стрептавидина (100 мкг/мл в блокирующем буфере). Инкубировать 1 час при 4 ° C.
  6. Стирать в ОБД. Заполните и инвертировать палата слайд скважин 4 - 5 раз, удаление HBS из скважин. Не позволяйте скважин для просушки.
  7. Добавьте биотинилированным реализует лигандов и молекулы адгезии к поверхности.
    Примечание: MCC и OVA могут быть photocaged путем добавления Орто nitrobenzyl на основе защиты групп (например, nitrophenylethyl (NPE) или nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) ε-амино-группы ключевых lysines (K12 в MCC, K7 в OVA). Photocaged MCC и OVA можно получить от коммерческих поставщиков. После растворения в водном буфера они являются сложил в бактериально выраженной-Ek и H2-Kb с использованием установленных подходы11,12.
  8. Проверка photoactivatable MCC или OVA пептида
    1. Decage NVOC-защищенный пептиды, УФ облучения с ручной УФ лампой (см. Таблицу материалы) для 20 мин на RT.
    2. Пульс 1.0 x 105 БТР с 1 мкм nonstimulatory пептида (отрицательный контроль, например Hb), необлученный photoactivatable пептид, облученного photoactivatable пептид и агонист пептида (положительный контроль, например, MCC) за 1 ч до Ночевка в 37 ° C.
    3. Чтобы стимулировать Т-клеток, выражая 5C. C7/2B4/и TCR, использования CH12 или клетки CH27 B. Чтобы стимулировать OT1 Т-клеток, используйте RMA-s или EL4 тимома клетки.
    4. Смешать импульсного БТР с равное количество Т-клеток в 96-луночных вокруг нижней пластины на окончательный объем 200 мкл. Инкубируйте при 37 ° C для 12-24 ч.
    5. Восстановить supernatants от каждой скважины и анализировать IL-2, ELISA с стрептавидина хрен пероксидазы колориметрические обнаружения.
      Примечание: Подтверждение арретирование статуса всех пептидов по масс-спектрометрии электроспрей до складывая в MHC комплексов, настоятельно рекомендуется.
  9. Выполните складывания и очистки MHC таким образом, чтобы свести к минимуму воздействие света. Например оберните складывания реакции в алюминиевой фольги и выполнять хромотографии фильтрации гель УФ-лампа с.
    Примечание: Это было найдено что photoactivatable MCC-Ek и OVA - H2-Kb побудить УФ независимых Т-клеток активации при высокой плотности, возможно из-за неполной функциональных останов. Следовательно photoactivatable реализует разбавляется на 10-30 x превышение nonstimulatory реализует (например -Ek содержащий64-76 пептид гемоглобина (Hb)) во время шага иммобилизации. Это улучшает отношение сигнал-шум последующей визуализации эксперимента.
  10. Для photoactivate CD4+ T клетки, коллективно использовать смесь биотинилированным Hb-Ek (3 мкг/мл), биотинилированным photoactivatable MCC-Ek (0,1 мкг/мл) и биотинилированным антитела против класса я MHC H2-Kk (0,5 мкг / mL). антитела анти H2-Kk поощряет 5 C. C7/2B4/и Т-клеток, которые Экспресс H2-Kk, для распространения на поверхность стекла без прохождения активации.
  11. Для CD8+ T клетки, используйте смесь биотинилированным H2-Db учитывая пептидные KAVYDFATL (1 мкг/мл), photoactivatable биотинилированным OVA-H2-Kb (0,1 мкг/мл) и внеклеточным доменом молекулы адгезии ИКАМ-1 (2 мкг/мл производимые насекомых клетки культуры13). ИКАМ-1 поощряет тесного контакта формирования путем привлечения Интегрин LFA1 на поверхности Т-клеток.
  12. Применить все смеси протеина в блокирующем буфере, следуют инкубации 1 ч на RT или по крайней мере 2 ч при 4 ° C.
    Примечание: Молекулярные плотности на поверхности такого рода быть ~ 8000 за мкм2 был ранее определенных6. Учитывая, что photoactivatable реализует представляет ~1/30й биотинилированным белка на поверхности, его плотность будет ~ 267 молекул в мкм2, до decaging.
  13. Мыть как шаг 1.6 и оставить в ОБД до готовой к использованию.
  14. Добавить 200 000 CD4+ или CD8+ T клетки, выражая соответствующие TCR в каждой скважине и позволяют клеткам присоединиться при 37 ° C 15 мин. После того, как клетки придают и распространения на поверхности, они готовы к photoactivation и томографии.
    Примечание: Ретровирусной трансдукции клеток-эффекторов T с флуоресцентных изображений зонды описана в деталях elswhere6,7. Сигнализации кальция может также изучал с помощью untransduced Т-клеток, загружен с красителем чувствительных кальция Fluo-4-6. Краска ratiometric фура-2 не рекомендуется, потому что он требует возбуждения в УФ диапазоне, который также индуцирует decaging из photoactivatable реализует.

2. изображение приобретение

  1. Используйте инвертированным микроскопом TIRF, оснащен УФ совместимый 150 X объектив для захвата изображений. УФ облучение пользовательских областей с помощью цифровой мембранные системы, придает 100 Вт ртутная лампа (HBO). Прямая УФ света от этой лампы на образца с помощью зеркалом длинный пас 400 Нм.
  2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для локализованных photoactivation и промежуток времени приобретения. В большинстве экспериментов, контролировать зондов в красный и зеленый каналы, используя 488 нм и 561 Нм лазеры возбуждения, соответственно. Лазерный свет направлен на образце с помощью двойного полосовой дихроичное зеркало, который также передает в УФ диапазоне (чтобы decaging). Пожалуйста, смотрите Таблицу материалов и Рисунок 6 для получения дополнительной информации о конфигурации микроскопа.
  3. После монтажа камеры слайд, содержащий Т-клеток, настройте параметры, чтобы получить TIRF или эпифлуоресцентного освещения, при необходимости. В режиме реального времени выберите поле клеток, которые выражают флуоресцентные кислородных интерес. Создание регионов микрон шкала для photoactivation под отдельные клетки, с помощью программного обеспечения управления.
  4. Начните промежуток времени приобретения. Как правило, приобретаются 80 timepoints, с интервалом в 5 s между каждой точке времени. Это оставляет более чем достаточно времени для последовательного 488 нм и 563 Нм экспозиций, в случае двойной цвет экспериментов.
  5. После 10 timepoints, photoactivate, выбранных регионов, открыв цифровой диафрагмы затвора для 1-1,5 s.
  6. После того, как промежуток времени завершения, выберите новое поле клеток и повторить процесс.

3. анализ данных

Примечание: Локализованных photoactivation иммобилизованных лигандов создает четкие, стационарные стимулирующее региона, который может использоваться для количественного анализа ответов и цитоскелета ремоделирования события. Анализ протоколов, как правило, включают количественной оценки интенсивности флуоресценции в регионе облученного либо с помощью облученного региона как позиционные конечную точку для измерения расстояния (например. для оценки поляризации Центросома к облученного район). Оба протокола анализа описаны ниже. Различные программы анализа интерактивное изображение может использоваться для интенсивности и измерение расстояний, которые затем могут быть выход для дополнительной обработки и анализа.

  1. Интенсивность флуоресценции
    1. Определите интенсивность флуоресценции (FI) фона региона вне клетки (FIb). Это будет использоваться для фона коррекции.
      1. Нарисуйте микронных размеров площади региона вне клетки и сделать маску. Чтобы определить интенсивность флуоресценции, нажмите на анализ | Маска статистики. Выберите Означают интенсивности флуоресценции и экспортировать значения.
        Примечание: Процедурные детали (например 3.1.1.1) относятся к Slidebook программного обеспечения (см. Таблицу материалы). Осуществление этого протокола, с помощью других программных пакетов (например., Фиджи) будет немного отличаться.
    2. Определите фи в регионе photoactivated для каждой точки времени.
      1. Выберите Маска для выделения в регионе, которая была photoactivated. Чтобы определить интенсивность флуоресценции, нажмите на анализ | Маска статистики. Выберите Означают интенсивности флуоресценции и экспортировать значения.
    3. Вычитание фона FI от измеренных значений FI в пределах региона. Затем, нормализовать исправленные FI измерений путем деления, в среднем, скорректированные по фону FI первых 9 кадров до photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
      Примечание: Граф ΔF/F как функцию от времени.
  2. Расстояние
    1. X и y координаты центра региона photoactivated.
      1. Определить x и y координаты центра региона photoactivated, выберите маску для выделения в регионе, которая была photoactivated. После того, как будет выделена область photoactivation, выберите анализ | Маска статистика | Центр района и экспортировать значения.
    2. Определить x и y координаты для флуоресцентного зонда интерес для каждой точки времени. Обычно это достигается посредством ручных или автоматических частиц отслеживания.
      1. Определить x и y координаты флуоресцентного зонда интерес, Руководство отслеживания частиц и нажать на флуоресцентного зонда интерес с течением времени. После того, как отслеживались все моменты времени, выберите анализ | Маска статистика | Центр района и экспортировать значения.
    3. Рассчитать расстояние между флуоресцентный протеин интереса и центр photoactivated региона для каждой точки время с помощью уравнения: расстояние = √ ((x2- x1)2+ (y -y21)2), в котором x2 и y2 являются координаты флуоресцентный белок1 интерес и x и y1 являются координаты центра региона photoactivated.
    4. Граф расстояние как функцию от времени.

Результаты

Photoactivation и изображений подход позволяет для наблюдения и поверхностным количественной оценки быстрого, поляризованных сигналов ответов. Для иллюстрации своих возможностей, воспроизведены вот изучение пространственно-временных корреляции между TCR-индуцированной Да...

Обсуждение

В последние годы свет стала отличным инструментом для spatiotemporally контролируемых активацию клеточных процессов. Были разработаны различные методики, каждый с связанные преимущества и недостатки. В системе, описанной здесь, которая основана на decaging подвижности, внеклеточных лигандов, ид?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим членов в Huse лаборатории для консультаций и помощи. При поддержке США национальных институтов здравоохранения (R01-AI087644 для м.г.) и P30-CA008748 в Мемориал Слоан Kettering Рак центр.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassThermofischer Scientific155361
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP2636Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-BiotinThermofischer Scientific20217Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
StreptavidinThermofischer Scientific434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kitAvidityBirA500Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK AnaspecCustom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibodyBD Biosciences553591
Biotinylated NPE-OVA H2-KbAnaspecCustom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db AnaspecCustom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1 For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lampUVPUVGL-25Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.OlympusAdditional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragmAndor
Slidebook softwareIntelligent Imaging Innovations

Ссылки

  1. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
  2. Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
  3. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  4. Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
  5. Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
  6. Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
  7. Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
  8. Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
  9. Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
  10. Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
  11. Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
  12. Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
  13. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
  14. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
  15. Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
  16. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  17. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
  18. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  19. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
  20. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  21. Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
  22. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
  23. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134TCRTIRF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены