יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

Abstract

לימפוציטים מסוג T לעסוק מהירה, מקוטב איתות, המתרחשים בתוך דקות לאחר הפעלת TCR. זה גורם להיווצרות הסינפסה חיסוניות, צומת הסטראוטיפי תא-תא זה מווסת את תא T הפעלה ויעדים directionally אפקטור תגובות. ללמוד ביעילות של תהליכים אלה, נחוצה גישה הדמיה המותאם לתפיסת תגובות מהר, מקוטב. פרוטוקול זה מתאר מערכת כזו, אשר מבוססת על photoactivatable פפטיד-מייג'ר histocompatibility מורכבים (pMHC) זה שאינו מופחתים עד חשוף לאור אולטרה סגול. Decaging יישוב של ריאגנט הזה במהלך הניסויים videomicroscopy מאפשר שליטה ייתכן מדויקת של הפעלת TCR וניטור ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר עוקבות מאת גמורה (TIRF) הדמיה. גישה זו מתאימה גם אסטרטגיות ההפרעות גנטיות ולא תרופתי. דבר זה מאפשר ההרכבה של מסלולים מולקולריים מוגדרים היטב לקשר TCR איתות היווצרות המבנים cytoskeletal מקוטב העומדים בבסיס הסינפסה אימונולוגי.

Introduction

T לימפוציטים (T תאים) לשחק תפקיד מרכזי חסינות תאית על ידי זיהוי פפטידים antigenic מוצג בהקשר של תא השטח MHC. זיהוי אנטיגן, אשר מתווך על ידי TCR, מניע את הבידול של תמים T תאים ומעודדת המסירה של התגובות cytolytic וקומוניקטיבי אפקטור אוכלוסיות. TCR האירוסין גורם גם שינויים דרמטיים אדריכלות הסלולר. בתוך דקות, תאי T אני מטפל לצד של התא אנטיגן (APC), ויצרו ממשק מקוטב המכונה סינפסה אימונולוגי (IS)^1,2. IS potentiates תא T אפקטור תגובות על-ידי הפעלת שחרור כיוונית של ציטוקינים או, במקרה של לימפוציטים T ציטוטוקסיות (Ctl), חלבונים lytic להרוס את APC.

TCR האירוסין מאת pMHC גורם זירחון מהירה של מולקולות מתאם הזרם מרובות, כולל מקשר עבור התאים ההפעלה של T (LAT), אשר בסופו של דבר מקדם שיפוץ חזקים של שלד התא סינפטית². אקטין filamentous בקליפת המוח (F-אקטין) כוננים תא T מתפשטת על פני השטח APC, ואז פותר לתוך מבנה טבעתי מאופיין על ידי F-אקטין הצטברות IS הפריפריה, דלדול מהמרכז. F-אקטין טבעת היווצרות בחוזקה רתומה ולהתפכחות של מרכז הארגון microtubule (MTOC, הנקרא גם centrosome של תאי T) למיקום מתחת למרכז של ממשק שני האירועים מתרחשים בתוך דקות של זיהוי אנטיגן הראשונית ולהקים ההקשר אדריכלי אירועי הפעלה עוקבות, אפקטור מתרחשות תגובות.

ללמוד הוא היווצרות, מעבדות שונות פיתחו גישות אשר APC מוחלף על ידי משטח זכוכית מכיל ליגנדים TCR קיבוע או תומך ליפידית עצמו מכיל^3,ליגנדים⁴. תאי T טופס הוא כמו הקשר על משטחים אלה יכולים לדימות גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRF) או מיקרוסקופיה קונפוקלית, הפעלת מחקרים ברזולוציה גבוהה של הפעלת תא T מוקדמת ויצירת IS.

למרות גישות אלה אפשרו להמחשת מעולה של IS שהרכבתם, הרבה איתות מצדו TCR:pMHC הבאים מתרחש תוך שניות, מקשים על המאמצים כדי לקבוע את רצף האירועים בעקבות הפעלת TCR במדויק . כדי לעקוף בעיה זו, בגישה photoactivation פותחה, שבו photoactivatable pMHC משמש כדי להשיג שליטה ייתכן TCR הפעלה^5,6,7. במערכת זו, תאי T מחוברים משטחי זכוכית המכיל pMHC photoactivatable זה ללא-מופחתים TCR עד מוקרן באור אולטרה סגול (UV). הקרנת UV על אזור מיקרון בגודל של המשטח מתחת לתא T מסיר את photocage יצירת אזור מופחתים יכולים להיות מזוהים על-ידי תא T. והאירועים איתות ובניה cytoskeletal ואז מנוטרים באמצעות מקודדים גנטית כתבים פלורסנט. שתי גרסאות photoactivatable של פפטידים antigenic, עש ציטוכרום c_88-103 (MCC) ו אובלבומין_257-264 (פשוט), אשר מוצגות בהקשר של המחלקה II MHC-E^k , הכיתה אני MHC H2-K^b, בהתאמה, היה פיתח (איור 1). פעולה זו מאפשרת הניתוח של שני CD4⁺ T תאים ספציפיים עבור MCC-אני-E^k (לבטא את ג 5 C7, 2B4, או AND TCRs) ו CD8⁺ T תאים ספציפיים עבור ביצית-H2-K^b (לבטא את OT1 TCR).

בעשור האחרון, הגישה photoactivation ודימות TCR יש כבר מנוצל כדי לבסס את קינטיקה מדויק של TCR מוקדם איתות צעדים וגם כדי לזהות מסלולים מולקולריים המסדירים מקוטב cytoskeletal שיפוצים^{5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. לדוגמה, וזמינותו היה תפקיד חשוב בקביעת centrosome הזה ולהתפכחות לכיוון APC מתווך על ידי מעבר הדרגתי המותאמות לשפות אחרות של השומנים השני messenger diacylglycerol מרוכז בכל IS. הוא צפוי כי מתודולוגיה זו ימשיכו להיות יקר עבור יישומים הדורשים ניתוח דימות ברזולוציה גבוהה של תפקוד תא T.

Protocol

1. הכנה של משטחי זכוכית מופחתים

1. המעיל. ובכן שמונה תאיים coverglass עם biotinylated פולי-L-ליזין (ביו-PLL) מדולל שבערך במים מזוקקים, יונים (ddH₂O). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
2. לשטוף עם H₂O.
3. היא יבשה 2 h-RT.
4. בלוק ביו-PLL מצופה משטחים עם מאגר חסימה (באגירה HEPES תמיסת מלח [10 מ מ HEPES pH 7.4, 150 מ מ NaCl], עם 2% BSA) במשך 30 דקות ב- RT.
   1. להמיס 5 מ"ג פולי-L-ליזין מנות ב- 1 מ ל 10 מ מ נאפו₄, pH 8.5.
   2. להוסיף μmol 125 (0.55 מ ג) של NHS-ביוטין (מתוך מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד) ולבדוק את רמת החומציות של התגובה. אם ה-pH מתחת 8.5, להוסיף 2 μL של 4 N NaOH לגדל אותו בין pH 8.5 ו- 9.5.
   3. מערבולת למשך 30 דקות.
   4. להרוות את תגובת עם 50 μL 100 מ מ גליצין מומס 20 מ מ טריס pH 8.0.
   5. ספין בעוצמה מלאה למשך 10 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
      הערה: ביו-PLL איכות הוא בדרך כלל לעומת ההכנות הקודם על ידי ציפוי טורי דילולים כפולה של החומר על צלחת אליסה 96-ובכן וכימות ביוטין תוכן לאחר דגירה עם phosphatase אלקליין בשילוב streptavidin.
5. להסיר את חסימת מאגר. אל תאפשר בארות להתייבש. להוסיף streptavidin (100 µg/mL במאגר חסימה). תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.
6. לרחוץ ב- HBS. מילוי, היפוך קאמרית שקופית בארות 4 - 5 פעמים, הסרת HBS מן הבארות. אל תאפשר בארות להתייבש.
7. הוסף biotinylated pMHC ליגנדים של אדהזיה מולקולות על פני השטח.
   הערה: MCC וביצית יכולה להיות photocaged על-ידי הוספת אורתופדיה-nitrobenzyl המבוסס על קבוצות מגן (למשל, nitrophenylethyl (NPE) או nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) על קבוצת אמינו חדוה lysines מפתח (K12 ב- MCC, K7 בתוך ביצית). ניתן להשיג Photocaged MCC וביצית של ספקים מסחריים. לאחר שיחזור במאגר מימית, הם הם refolded לתוך ביטוי bacterially-E^k ו- H2-K^b באמצעות גישות הוקמה^11,12.
8. אימות של פפטיד MCC או ביצית photoactivatable
   1. Decage פפטידים NVOC המוגנים על-ידי UV בין עם מנורת UV כף יד (ראה טבלה של חומרים) במשך 20 דקות ב- RT.
   2. הדופק 1.0 x 10⁵ נגמ שים עם 1 מיקרומטר של פפטיד nonstimulatory (שליטה שלילי, למשל Hb), unirradiated photoactivatable פפטיד, photoactivatable לקרינה פפטיד, ופפטיד אגוניסט (בקרה חיובית, למשל, MCC) עבור h 1 כדי לילה ב 37 º C.
   3. כדי לעורר תאי T לבטא את ג 5 C7/2B4/AND TCR, להשתמש CH12 או CH27 B תאים. לעורר תאים OT1 T, השתמש RMA-s או EL4 thymoma תאים.
   4. מערבבים את נגמ שים פעמו עם מספר שווה של תאי T ב 96-ובכן סביב לוחות בווליום הסופי של 200 µL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.
   5. לשחזר את supernatants מכל קידוח ולנתח il-2 מאת אליסה עם streptavidin-חזרת peroxidase זיהוי ערכי צבע מוחלטים.
      הערה: אישור על מצב caging של פפטידים כל באמצעות ספקטרומטר מסה ספקטרומטריית electrospray לפני refolding לתוך מתחמי MHC, מומלץ מאוד.
9. לבצע קיפול וטיהור של MHC כדי למזער חשיפה לאור. למשל, גלישת קיפול תגובות בנייר אלומיניום, לבצע בדיקות סינון ג'ל עם מנורת UV מחוץ.
   הערה: זה כבר מצא את photoactivatable MCC-אני-E^k , ביצית - H2-K^b זירוז UV הפעלה עצמאית תא T-צפיפות גבוהה, ייתכן שעקב שכולאת פונקציונלי לא שלם. לפיכך, pMHC photoactivatable הוא מדולל מעודף x 10-30 nonstimulatory pMHC (למשל -E^k שמכיל פפטיד_64-76 (Hb) של המוגלובין) במהלך השלב הנייח. זה מגביר את האות לרעש יחס של הניסוי הדמיה עוקבות.
10. כדי photoactivate CD4⁺ T תאים, באופן קולקטיבי משתמשים בתערובת של biotinylated על בסיס חצי פנסיון-אני-E^k (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable MCC-אני-E^k (0.1 µg/mL) ו- biotinylated נוגדנים נגד המעמד אני MHC H2-K^k (0.5 µg / mL)-נוגדן anti-H2-K^k מעודד ג 5 C7/2B4/AND T תאים, אשר אקספרס H2-K^k, למרוח על גבי משטח זכוכית שבלי לעבור הפעלה.
11. עבור CD8⁺ T תאים, משתמשים בתערובת של biotinylated H2-D^b הנושאת את פפטיד KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable ביצית-H2-K^b (0.1 µg/mL), לבין קבוצת המחשבים חוץ-תאי של המולקולה אדהזיה ICAM-1 (2 µg/mL הופק על ידי חרקים תא תרבות¹³.) ה-ICAM-1 מעודד היווצרות קשר קרוב ומרבה את אינטגרין LFA1 על פני תא T.
12. החלת כל חלבון תערובות במאגר חסימה, ואחריו הדגירה 1 h RT או לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: צפיפות מולקולרית על משטחים מסוג זה להיות ~ 8000 לכל מיקרומטר² כבר נקבע בעבר⁶. בהתחשב בכך photoactivatable pMHC מייצג ~1/30^th של החלבון biotinylated על פני השטח, כשהצפיפות שלה יהיה ~ 267 מולקולות לכל מיקרומטר², לפני decaging.
13. לשטוף כמו שלב 1.6 ולהשאיר ב- HBS עד מוכן לשימוש.
14. להוסיף 200,000 CD4⁺ או CD8⁺ T תאים המבטאים את TCR המתאים לבאר כל ולאפשר תאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ברגע תאים יש המצורפת, התפשט על פני השטח, הם מוכנים בשבילכם photoactivation והדמיה.
    הערה: התמרה חושית Retroviral אפקטור T תאים עם פלורסנט הדמיה הגששים מתואר בפרט elswhere^6,7. סידן איתות שניתן גם ללמוד באמצעות תאי T untransduced טעון עם סידן רגיש לצבוע Fluo-4⁶. לצבוע רציומטרי Fura-2 לא מומלץ כי זה דורש עירור בטווח UV, אשר גם גורם decaging של pMHC photoactivatable.

2. ייבוא תמונות

1. השתמש במיקרוסקופ TIRF הפוכה לבוש עם עדשה המטרה UV תואם 150 X עבור רכישת התמונה. UV להאיר אזורים על-ידי המשתמש באמצעות מערכת דיגיטלית הסרעפת מחוברת מנורת כספית W 100 (HBO). ישיר UV אור המנורה הזו על המדגם באמצעות מראה מסירה ארוכה 400 nm.
2. השתמש התמונה ניתוח תוכנה עבור photoactivation מקומי ורכישת זמן לשגות. בניסויים רוב, לפקח על הגששים בערוצים שני ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר, 561 nm עירור לייזרים, בהתאמה. אור לייזר מכוונת על המדגם באמצעות מראה כפולה-bandpass ודיקרואיק זוהר ששולחות גם בטווח UV (כדי לאפשר decaging). אנא עיין טבלה של חומרים איור 6 לקבלת מידע נוסף על תצורת מיקרוסקופ.
3. לאחר טעינת השקופית תא המכיל תאי T, להתאים את ההגדרות כדי להשיג תאורה TIRF או epifluorescence, לפי הצורך. במצב live, בחר שדה של תאים הם המבטאים את probe(s) פלואורסצנט עניין. להקים בקנה מידה מיקרון אזורים עבור photoactivation מתחת תאים בודדים באמצעות תוכנת שליטה.
4. מתחילים רכישת זמן לשגות. בדרך כלל, 80 timepoints נרכשים, עם מרווח של 5 s בין כל נקודת זמן. זה משאיר יותר ממספיק זמן רציפים 488 ננומטר, 563 חשיפות ננומטר, במקרה של ניסויים צבע כפול.
5. לאחר 10 timepoints, photoactivate האזורים שנבחרו על-ידי פתיחת הסרעפת דיגיטלי תריס עבור s 1-1.5.
6. בתום זמן לשגות, בחר שדה חדש של תאים וחזור על התהליך.

3. ניתוח נתונים

הערה: photoactivation המותאמות לשפות אחרות של ליגנדים קיבוע יוצר אזור מופחתים מוגדרים היטב, נייח יכול לשמש לניתוח כמותי של איתות תגובות ואירועים שיפוץ cytoskeletal. ניתוח פרוטוקולים בדרך כלל כרוכים או לכימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך אזור לקרינה או באמצעות האזור לקרינה כמו נקודת קצה של מיקום מרחק מעבדתיים (למשל. להערכת קיטוב של centrosome אזור לקרינה). ניתוח פרוטוקולים שיפורטו להלן. תוכניות שונות של ניתוח תמונה אינטראקטיבית יכול לשמש כדי להפוך את העוצמה של מדידות מרחק, אשר לאחר מכן ניתן ליצור תבנית פלט עבור עיבוד נוסף וניתוח.

1. עוצמת קרינה פלואורסצנטית
   1. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) של אזור רקע מחוץ לתא (FI_b). זה ישמש עבור רקע תיקון.
      1. לצייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא ולעשות מסכה. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.
         הערה: פרטי פרוצדורלי (למשל 3.1.1.1) מתייחסים לתוכנה Slidebook (ראה טבלה של חומרים). יישום של פרוטוקול זה באמצעות חבילות תוכנה אחרות (למשל., פיג'י) יהיה שונה במקצת.
   2. לקבוע את האלחוטי בתוך אזור photoactivated עבור כל נקודת זמן.
      1. בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.
   3. הפחת על רקע פי מתוך הערכים FI שנמדד באזור. לאחר מכן, לנרמל את המידות FI המתוקן על-ידי חלוקת מאת הממוצע, רקע מתוקנת האלחוטי של המסגרות 9 קודם לפני photoactivation. ΔF/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      הערה: גרף ΔF/F כפונקציה של הזמן.
2. מרחק
   1. להשיג x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.
      1. כדי לקבוע את x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated, בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. ברגע האזור של photoactivation מודגשת, בחר נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.
   2. לקבוע x ו- y קואורדינטות עבור המכשיר פלואורסצנט עניין עבור כל נקודת זמן. זו מושגת בדרך כלל באמצעות חלקיקים ידני או אוטומטי מעקב.
      1. כדי לקבוע את x ו- y הקואורדינטות של המכשיר פלואורסצנט עניין, בחר ידני חלקיקים מעקב ולחץ על החללית פלואורסצנט עניין לאורך זמן. לאחר כל נקודות זמן כבר מסומנים, לבחור נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.
   3. לחשב את המרחק בין החלבון הניאון עניין למרכז של האזור photoactivated עבור כל נקודת זמן באמצעות המשוואה: מרחק = כהן ((x₂- x₁)²+ (y₂-y₁)²), שבו x₂ ו- y הם₂ הקואורדינטות של החלבון הניאון של ריבית ו- x₁ ו- y₁ הן הקואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.
   4. גרף המרחק כפונקציה של הזמן.

תוצאות

הגישה photoactivation ודימות מאפשר התבוננות נתיישב כימות של תגובות איתות מהירה, מקוטב. כדי להדגים את היכולות שלה, לשכפל הנה ניסוי בחינת המתאם ייתכן בין צבירה דאג TCR-induced ולהתפכחות centrosome. ג 5 תקיעות התא C7 T היו transduced retrovirally עם שני הכתבים פלורסנט: ביוסנסור דאג המכיל קבוצות המחשבים C1 ט...

Discussion

בשנים האחרונות התפתחה אור כלי מצוין עבור הפעלה מבוקרת spatiotemporally של תהליכים תאיים. מתודולוגיות שונות פותחו, כל אחד עם המשויך יתרונות וחסרונות. המערכת המתוארת כאן, אשר מבוססת על decaging של ליגנדים קיבוע, חוץ-תאית, מתאימה באופן אידיאלי עבור הניתוח של תגובות איתות מהירה, subcellular, מקוטב. גישה זו הוחל ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500	Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK			For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1			For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp	UVP	UVGL-25	Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.	Olympus		Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations