Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

Resumen

Licuefacción del semen es necesario para liberarse del gel seminal de los espermatozoides. Este estudio proporciona los procedimientos para la recogida de semen del coito posterior al tracto reproductor femenino y medir el tiempo de licuefacción del semen.

Resumen

En ratones, el eyaculado se deposita en el útero. Después de la eyaculación, el semen cambia de consistencia de gel-como acuosa, un proceso llamado licuefacción. En este estudio, se muestra cómo recoger el post eyaculado en el aparato reproductor femenino en un modelo murino. Ratones hembra en primer lugar, adulto en la etapa de estro se alojaron en la jaula del macho durante la noche. A la mañana siguiente, la cópula fue confirmada por la presencia de copula tapón en la abertura vaginal. Ratones hembra con enchufes copulador fueron sacrificados, y cada tracto reproductivo fue recogido como un todo (vagina, útero, oviductos, ovarios), asegurando un sistema cerrado para contener el semen. El tracto reproductivo fue colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y la vagina fue cortada para liberar el semen en el tubo. Para asegurar el volumen de semen máximo para el análisis, pinzas sin dientes se utilizan para exprimir los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal expulsando el semen restante. El tracto reproductivo entero luego fue descartado. El tubo que contiene el semen brevemente fue hecho girar hacia abajo. Una pipeta capilar de 25 μL se colocó en el tubo en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Se registró la cantidad de tiempo usada para llenar el tubo capilar hasta la 25 μL. Semen de un criador macho probado generalmente toma aproximadamente 60-180 s para llenar un tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de recogida de semen también puede ser utilizada en otras aplicaciones posteriores como el análisis de la proyección de imagen y de la motilidad de esperma.

Introducción

El tracto reproductor femenino se compone de los tractos superiores e inferiores. El tracto reproductivo superior incluye las trompas de Falopio, el útero y el endocervix. El tracto reproductivo inferior incluye el exocérvix y la vagina. En los seres humanos, el eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina, junto al ectocérvix¹. En ratones, sin embargo, el semen se barre en el útero dentro de minutos después del acoplamiento².

Semen contiene gel seminal que se solidifica dentro de segundos de la eyaculación, causando el esperma para ser atrapados e inmovilizados³. Licuefacción libera el esperma inmovilizado cambiando semen de un tipo de gel con una consistencia acuosa. Este proceso es esencial para la motilidad espermática y la reproducción mamífera. Conocimiento de licuefacción del semen se basa sobre todo en vitro estudios donde se convierte en licuado de semen en una placa de cultivo. En los seres humanos, la actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA (peptidasa también conocido como relacionadas con la calicreína 3 o KLK3) es el principal para la licuefacción a través hidrólisis de semenogelins (gelificante proteínas presentes en el semen)^{4 ,5,6}. Degradación de semenogelins libera el esperma del coágulo seminal, aumento de la movilidad del esperma. Liberado el nado de espermatozoides hacia la trompa de Falopio para fertilizar el huevo. Licuefacción (o viscosidad del semen) las pruebas son una de las proyecciones iniciales estándar para el análisis de semen en las clínicas de fertilidad para evaluar la fertilidad masculina⁷.

Un artículo recientemente publicado muestra que se pueden usar análisis de fluido seminal de la hembra del ratón tracto reproductivo postnupcial para ilustrar una deficiencia en licuefacción que posteriormente puede causar fertilidad defectos⁸. Licuefacción defectuoso como semen hiperviscosidad contribuye a 11.8 32.3% de los casos estériles en hombres⁹, sugiriendo que la licuefacción normal es indispensable para la reproducción de mamífero. Sin embargo, estudios y tratamiento de los defectos de licuefacción se han centrado exclusivamente en el hombre⁷. No se ha explorado la posibilidad de que el tracto reproductor femenino desempeña un papel en la licuefacción del semen. Por lo tanto, los métodos de colección de semen y medir el tiempo de licuefacción proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción puede ser una de las causas de la infertilidad en el organismo modelo de interés.

Protocolo

Todos los animales y los procedimientos utilizados en este estudio se manejaron según las directrices de la Comisión de uso y cuidado de animales de la Universidad de estado de Washington (WSU) y en cumplimiento de protocolos de animales aprobado WSU #4702 y #4735.

1. ratones

1. Uso estándar C57BL/6J ratones machos adultos u otras cepas de interés. Mantener los animales bajo un ambiente controlado de temperatura y humedad, con acceso ad libitum de agua y alimentos.
   1. Utilizar mejoradores masculinos desde 8 semanas de edad hasta 10 meses de edad. Utilice sólo los criadores probados en los experimentos.
2. Utilizar ratones adultos femeninos con una canceladura selectiva del tejido del tracto reproductivo estrógeno receptor α (codificada por el gen Esr1 ) en las células epiteliales¹⁰ (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, llamado agujero ciego o «KO») y hermanos de camada (Esr1^f/f, llamado "CTRL") de control en este estudio.
   1. Uso de 8 semanas de edad las hembras. Las edades de las mujeres variaban según el experimento de interés.
3. Determinar las etapas del ciclo estral en la mañana a las 8:00 h. Utilice sólo las hembras en la etapa de estro del ciclo. Métodos detallados de manchar vaginal y análisis citológico, se refieren a los procedimientos previamente publicados en¹¹.

2. acoplamiento y la evaluación de tapones copulatoria

1. En el día del estro (16:00 h), casa de la hembra en la jaula del macho.
2. La mañana (8:00 h), separar la hembra del ratón macho.
3. Utilice una adaptación de un método previamente publicado¹² para acceder a la presencia o ausencia de un tapón vaginal o copula como indicación de apareamiento.
4. Sostenga el ratón hembra de la base de la cola para levantar brevemente los miembros posteriores.
5. Encontrar el enchufe copula por la presencia de un coágulo seminal grisáceo en la apertura vaginal utilizando un palillo de dientes. Si el aparato copulador está presente, el palillo no serán capaces de introducirse en la vagina.

3. preparación antes de la colección de tejidos

1. Preparar 10 mL de medios de comunicación de Leibovitz de L-15, suplementado con 1% de suero bovino fetal (llamado L15 media + 1% FBS) en un tubo de 15 mL. Incubar los medios a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua.
2. Para preservar la viabilidad del tejido y esperma para aplicaciones posteriores, 2 mL alícuota de precalentado media L15 + 1% FBS en una microcentrífuga de 2 mL tubo para recolección de tejido.
3. Caliente la etapa de Estereomicroscopio a 37 ° C. Fijar el bloque de calor a 37 º C y colocar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL vacía en el bloque.
4. Si las aplicaciones downstream requieren la proyección de imagen de la motilidad espermática, calentar lo portaobjetos de vidrio a 37 ° C.

4. tejido colección

1. Traer medios L15 precalentados + alícuota de 1% FBS a la zona de recogida de tejido.
2. Eutanasia a la hembra (~ 08: 30h) utilizando dióxido de carbono asfixia seguida por dislocación cervical.
   Nota: Esto es aproximadamente 8 h después de aparearse, suponiendo que el apareamiento lleva a cabo a la medianoche.
3. Coloque el animal en posición decúbito dorsal para exponer el área abdominal.
4. Rocíe alcohol al 70% en el abdomen cerca de extremidades posteriores.
5. Utilice las tijeras de disección realice un corte pequeño (~ 1 cm) en la piel del abdomen inferior.
6. Utilizar la mano dominante para tirar de la cola (y extremidades traseras si es necesario) mientras que la mano no dominante tira la piel en la dirección opuesta (hacia la cabeza) para exponer el músculo abdominal. Este método se utiliza para minimizar la cantidad de contaminación de pelo a los órganos viscerales.
7. Cortar el músculo abdominal en forma de V en la base del abdomen, junto a la vagina, para exponer los órganos viscerales.
8. Mover los intestinos y grasa abdominal al lado para exponer el tracto reproductivo.
9. Recorte de vejiga y otros tejidos por encima de la zona vaginal.
10. Cortan sínfisis púbica para tener acceso al tejido vaginal.
11. Levantar el tejido vaginal en la abertura vaginal y usando tijeras para separar la vagina el tejido rectal.
12. Recorte cuidadosamente la grasa mesentérica de ambos lados del útero con unas tijeras de muelle.
    PRECAUCIÓN: El útero es muy frágil con el semen dentro. Tenga cuidado de no perforar el útero, o bien el semen se perderá.
13. Levantar el tracto reproductivo inferior y cortar la almohadilla de grasa ovárica en ambos lados.
14. Transferir el tracto reproductivo todo el tubo de precalentado Leibovitz L-15 media + 1% FBS.

5. medición de la licuefacción del Semen (viscosidad) de la colección de contenido uterino

1. Sobre la platina calefactada de la Estereomicroscopio, transferencia de los tejidos en un plato de cultivo estériles para tejidos de 35 mm llenan de 3.5 mL previamente calentado L-15 media + 1% FBS para limpiar los tejidos de la sangre y otros contaminantes.
   PRECAUCIÓN: Mientras lava, agarrar los tejidos por la grasa, no el útero. En este punto, se espera que el semen intacto dentro del útero.
2. Secar los tejidos del exceso de medio uso toallitas de laboratorio.
3. Mantener el tejido en el extremo vaginal colocando los extremos ováricos en el tubo de microcentrífuga precalentado. Sujetando el extremo vaginal, cortar los cuernos uterinos en la base del útero, permitiendo que los cuernos uterinos caer en el tubo de microcentrífuga.
4. Dejar que el semen flujo fuera de los cuernos uterinos en el tubo. Utilizar pinzas sin dientes para apretar suavemente los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal, expulsión de semen sobrante.
5. Deseche los tejidos en bolsa de biohazard y queme.
6. Girar brevemente por el semen en un minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Colocar el tubo, paralelo a la etapa caliente - semen no se derrama hacia fuera.
8. Tiene el temporizador listo y a 'cuenta en adelante'.
9. Inserte un tubo capilar de 25 μl de la muestra de semen en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Esto es para minimizar la variabilidad entre cada investigador de sujetando el tubo capilar en diferentes ángulos.
10. Pulsa el cronómetro tan pronto como el tubo capilar hace contacto con el semen.
11. Registrar el tiempo (s) que tarda el semen llegar a la línea de 25 μl.
12. Una vez terminada la medición, coloque inmediatamente el tubo que contiene el semen en el bloque de calor seco para su posterior análisis funcional, como imágenes de video de la motilidad espermática.
13. Desinfectar el tubo capilar que contiene semen sumergiendo el tubo en la solución de cloro 10% por 20 min y descartar el tubo capilar en el contenedor de objetos punzantes.

6. video proyección de imagen de la motilidad espermática

1. Encienda el microscopio y software de proyección de imagen de vídeo.
2. Pipetear 20 μl de semen restante sobre el portaobjetos de cristal previamente calentados, mientras que el portaobjeto se coloca sobre la platina calefactada.
3. Cubrir con un cubreobjetos de vidrio.
4. Deposite al lado del cubreobjetos portaobjetos en el microscopio.
5. Utilice 20 X objetivo para encontrar el área de interés.
6. Cambiar a lente de objetivo de 100 X para imágenes de video.
7. Grabar el video en 12 cuadros/s (fps) de 30 s.
8. Al azar, grabar los videos en al menos 3 diferentes áreas por animal.
9. Realizar la proyección de imagen rápida y minimizar la exposición a la luz a la diapositiva para preservar la motilidad espermática y la viabilidad.
   Nota: Este procedimiento imagenológico debe realizarse dentro de 2-3 minutos.
10. Realizar el análisis de datos utilizando el software ImageJ como se describió previamente⁸.

Resultados

Semen se recolectó de CTRL y KO hembras aproximadamente 8 h después de aparearse con los machos fértiles de CTRL. Licuefacción (o viscosidad del semen) se cuantifica por el tiempo necesario para llenar el tubo capilar de 25 μL de semen. Asumió el esperma recogido de úteros CTRL 2.06 min ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) para llenar el tubo capilar (figura 1). Sin embargo, el esperma recogido de úteros KO tomó más de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) de tiempo expe...

Discusión

Recogida de semen de úteros de ratón puede proporcionar ventajas sobre el análisis de semen en vitro como la anterior puede ilustrar las interacciones fisiológicas entre el semen y las secreciones del tracto reproductivo femenino. Las técnicas presentadas en este estudio permiten a los investigadores a determinar la calidad del semen así como viabilidad espermática y la motilidad en condiciones fisiológicas ideales. Además, hay varios análisis posteriores que se pueden realizar utilizando el e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration