Collecte de sperme provenant de l’appareil reproducteur féminin et la mesure de la liquéfaction du sperme chez les souris après l’accouplement

Résumé

Liquéfaction du sperme est nécessaire pour les spermatozoïdes de se libérer du gel séminal. Cette étude fournit les procédures de collecte de sperme du coït postérieure de l’appareil reproducteur féminin et mesurer le temps de liquéfaction de sperme.

Résumé

Chez la souris, le sperme éjaculé est déposé dans l’utérus. Après l’éjaculation, le sperme varie de consistance gélifiée aqueuse, un processus appelé liquéfaction. Dans cette étude, nous montrons comment recueillir le sperme éjaculé après de l’appareil reproducteur féminin dans un modèle murin. Tout d’abord, adultes femelles dans la phase d’oestrus étaient logés dans la cage du mâle pendant la nuit. Le lendemain matin, la copulation a été confirmée par la présence du bouchon copulatoire lors de l’ouverture vaginale. Les souris femelles à des bouchons copulateurs ont été euthanasiés, et chaque appareil reproducteur a été recueilli dans son ensemble (vagin, utérus, ovaires, oviductes), assurant un système fermé pour contenir le sperme. L’appareil génital a été placé dans un tube de microtubes de 1,5 mL, et le vagin a été coupé pour libérer le sperme dans le tube. Pour assurer le volume de sperme maximum pour analyse, pinces édentés servaient à serrer les cornes utérines de fin ovarienne à extrémité vaginale expulser le sperme restant. L’ensemble génital a été défaussée. Le tube contenant du sperme a été brièvement tourné vers le bas. Une pipette capillaire 25 μL a été placée dans le tube à un angle de 180° (parallèle à la paroi du tube). L’intervalle de temps utilisé pour remplir le tube capillaire à la ligne 25 de μL a été enregistré. Sperme d’un éleveur mâle éprouvé prend habituellement environ 60-180 s à remplir un tube capillaire 25 μL. Cette technique de collecte de sperme peut aussi être utilisée dans d’autres applications en aval telles que l’analyse d’imagerie et de la motilité du sperme.

Introduction

L’appareil reproducteur féminin est constitué des voies supérieures et inférieures. Les voies génitales supérieures comprennent des trompes de Fallope, l’utérus et l’endocol. L’appareil génital inférieur comprend l’exocol et le vagin. Chez l’homme, le sperme éjaculé est déposé à la paroi antérieure du vagin, adjacent à l' exocol¹. Chez les souris, cependant, le sperme est balayé dans l’utérus quelques minutes après l’accouplement².

Le sperme contient gel séminal qui est solidifié dans les secondes après l’éjaculation, causant le sperme être pris au piège et immobilisée³. Liquéfaction libère les spermatozoïdes immobilisés en changeant de sperme d’un gélatineuse à une consistance aqueuse. Ce processus est essentiel pour la motilité des spermatozoïdes et de la reproduction chez les mammifères. Connaissance de la liquéfaction du sperme repose principalement sur des études in vitro où le sperme devient liquéfié dans une boîte de Petri. Chez l’homme, l’activité enzymatique de l’antigène spécifique de la prostate ou PSA (également connu sous le nom axés sur la kallikréine peptidase 3 ou KLK3) est le principal contributeur pour la liquéfaction par hydrolyse du semenogelins (formation de gel de protéines présentes dans le sperme)^{4 ,5,6}. Dégradation de semenogelins libère le sperme prélevé le coagulum séminal, accroissement de la mobilité des spermatozoïdes. Libéré des spermatozoïdes nager vers la trompe de Fallope pour féconder l’ovule. Liquéfaction (ou la viscosité du sperme) tests sont parmi les projections initiales standards pour l’analyse de sperme dans les cliniques de fertilité afin d’évaluer la fertilité mâle⁷.

Un article publié récemment montre que l’analyse du liquide séminal provenant d’appareil reproducteur l'de souris femelle après accouplement peut servir à illustrer une carence en liquéfaction qui peut causer par la suite de défauts de fertilité⁸. Liquéfaction défectueuse comme sperme hyperviscosité contribue à 11,8-32,3 % des cas peu fertile en hommes⁹, ce qui suggère que la liquéfaction normale est indispensable pour la reproduction chez les mammifères. Cependant, les études et le traitement des défauts de liquéfaction ont porté exclusivement sur le mâle⁷. La possibilité que l’appareil reproducteur féminin joue un rôle dans la liquéfaction du sperme n’a pas été explorée. Par conséquent, les méthodes de collecte de sperme et de mesurer le temps de liquéfaction seront aux chercheurs un nouvel outil de diagnostic pour déterminer si la liquéfaction pourrait être une des causes de stérilité chez l’organisme modèle d’intérêt.

Protocole

Tous les animaux et les procédures utilisées dans cette étude ont été traitées conformément aux directives animalier Washington State University (WSU) et le Comité d’urbanisme et dans le respect de protocoles animales approuvé par WSU 4702 # et #4735.

1. souris

1. Utilisation standard C57BL/6J souris mâles adultes ou autres souches d’intérêt. Maintenir les animaux dans un environnement de température et humidité contrôlées, avec un accès ad libitum d’eau et de nourriture.
   1. Utiliser des mâles reproducteurs allant de 8 semaines à 10 mois. Utilisez uniquement les éleveurs éprouvés dans les expériences.
2. Utilisez la souris femelle adultes avec une suppression sélective de tissus du tractus génital oestrogène récepteur α (codée par le gène Esr1 ) dans les cellules épithéliales¹⁰ (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, appelée masquage ou « KO ») et contrôler la même portée (Esr1^f/f, appelée « CTRL ») dans cette étude.
   1. Utilisez les 8 femelles semaines. Âge des femelles varie en fonction de l’expérience d’intérêt.
3. Déterminer les phases du cycle oestral à 08:00 h du matin. Utilisez uniquement des femelles au stade du cycle oestral. Pour les méthodes détaillées de bavures vaginale et analyse cytologique, consultez les procédures précédemment publiées¹¹.

2. l’accouplement et d’évaluer les bouchons copulateurs

1. Au jour de l’oestrus (16:00 h), maison de la femelle dans la cage du mâle.
2. Le lendemain matin (08:00 h), séparer la femelle de la souris mâle.
3. Une adaptation d’une méthode déjà publiées¹² permet d’accéder à la présence ou l’absence d’un bouchon copulatoire ou vaginal comme une indication de l’accouplement.
4. Maintenez la souris femelle de la base de la queue de soulever brièvement des membres postérieurs.
5. Trouver le bouchon copulatoire par la présence d’un coagulum séminal blanc cassé à l’ouverture du vagin à l’aide d’un cure-dent. Si le bouchon copulatoire est présent, le cure-dent ne sera pas en mesure d’être inséré dans le canal vaginal.

3. préparation avant le prélèvement de tissus

1. Préparer 10 mL de médias de L-15 de Leibovitz, additionnés de sérum de veau fœtal 1 % (appelé L15 médias + 1 % FBS) dans un tube de 15 mL. Incuber les médias à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d’eau.
2. Afin de préserver la viabilité du tissu et du sperme pour des applications en aval, aliquote 2 mL de préchauffé L15 médias + 1 % FBS dans une micro-centrifugeuse 2 mL tube de prélèvement tissulaire.
3. Chauffer le stade de la stéréomicroscope à 37 ° C. La valeur de la chaleur-bloc à 37 ° C et placer un tube de microcentrifuge de vide de 1,5 mL dans le bloc.
4. Si les applications en aval besoin d’imagerie de la motilité des spermatozoïdes, chauffer la lame de verre à 37 ° C.

4. tissu Collection

1. Venir préchauffé L15 médias + aliquote FBS de 1 % pour la zone de collecte de tissus.
2. Euthanasier la femelle (~ 08 : 30h) à l’aide de dioxyde de carbone asphyxie suivie d’une dislocation cervicale.
   NOTE : C’est environ 8 h après l’accouplement, en supposant que l’accouplement a lieu à minuit.
3. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal pour exposer la zone abdominale.
4. Spray alcool à 70 % sur l’abdomen près de membres postérieurs.
5. Utiliser des ciseaux de dissection pour faire une petite coupure (~ 1 cm) sur la peau du bas-ventre.
6. Utiliser la main dominante pour tirer la queue (et les membres postérieurs si nécessaire) tandis que la main non dominante tire la peau dans le sens inverse (vers la tête) pour exposer les muscles abdominaux. Cette méthode est utilisée pour réduire au minimum la quantité de cheveux contamination aux organes viscéraux.
7. Couper le muscle de l’abdomen en forme de V à la base de l’abdomen, près du vagin, d’exposer les organes viscéraux.
8. Déplacer les intestins et la graisse abdominale sur le côté afin d’exposer l’appareil reproducteur.
9. Coupez la vessie et d’autres tissus au-dessus de la zone vaginale.
10. Symphyse pubienne couper dehors pour avoir accès à du tissu vaginal.
11. Soulevez le tissu vaginal à l’ouverture du vagin et à l’aide de ciseaux pour séparer le canal vaginal le tissu rectal.
12. Enlevez soigneusement la graisse mésentérique des deux côtés de l’utérus à l’aide de ciseaux de printemps.
    ATTENTION : L’utérus est très fragile avec le sperme à l’intérieur. Veillez à ne pas perforer l’utérus, ou bien le sperme sera perdu.
13. Soulevez l’appareil génital inférieur et coupez les coussinets adipeux ovarienne hors des deux côtés.
14. Transférer l’ensemble génital dans le tube de préchauffé Leibovitz L-15 media + 1 % FBS.

5. mesure de sperme de liquéfaction (viscosité) de la Collection de contenu utérine

1. Sur la platine chauffante du stéréomicroscope, transfert les tissus dans une boite de culture de tissus stériles 35 mm remplis de 3,5 mL préchauffée des médias L-15 + 1 % FBS pour nettoyer les tissus, de sang et d’autres contaminants.
   ATTENTION : Étant lavage, saisir les tissus de la graisse, pas de l’utérus. À ce stade, le sperme est prévu être intacts à l’intérieur de l’utérus.
2. Épongez les tissus des excès média à l’aide de lingettes de laboratoire.
3. Tenir le tissu vaginal fin tout en plaçant les extrémités ovariennes dans le tube de microcentrifuge préchauffé. Tout en tenant l’extrémité vaginale, couper les cornes utérines à la base de l’utérus, ce qui permet des cornes utérines de tomber dans le tube de microcentrifuge.
4. Laisser le sperme sortir les cornes utérines dans le tube. Pinces sans dents permet de presser doucement les cornes utérines de la fin des ovaire à l’extrémité vaginale, expulser les reste sperme.
5. Jeter les tissus dans le sac de biohazard et incinérer.
6. Tournez brièvement en bas le sperme dans un minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Poser le tube, parallèle à la platine chauffante - sperme ne renversera pas dehors.
8. Que la minuterie du prête et la valeur « décompter ».
9. Insérez un tube capillaire de 25 µL de l’échantillon de sperme à un angle de 180° (parallèle à la paroi du tube). Il s’agit de réduire au minimum la variabilité entre chaque chercheur de tenir le tube capillaire avec des angles différents.
10. Appuyez sur le minuteur dès que le tube capillaire fait contact avec le sperme.
11. Enregistrer l’heure (s) qu’il faut pour la semence atteindre la ligne de 25 µL.
12. Lorsque la mesure est terminée, mettre immédiatement le tube contenant le sperme dans le bloc de chaleur sèche pour une analyse ultérieure fonctionnel, tels que l’imagerie vidéo de la motilité des spermatozoïdes.
13. Désinfecter le tube capillaire contenant du sperme en plongeant le tube dans la solution 10 % eau de Javel pendant 20 min et jeter le tube capillaire dans le conteneur d’objets pointus ou tranchants.

6. vidéo imagerie de la motilité des spermatozoïdes

1. Allumez le microscope et les logiciels d’imagerie vidéo.
2. Pipeter 20 µL du sperme restant sur la lame de verre préchauffé, tandis que la lame de verre est placée sur la platine chauffante.
3. Couvrir avec une lamelle de verre.
4. Déposer la glissière lamelle côté sur le microscope.
5. 20 X objectif permet de trouver la zone d’intérêt.
6. Changer de lentille d’objectif X 100 pour l’imagerie vidéo.
7. Enregistrer la vidéo à 12 images/s (fps) pendant 30 s.
8. Au hasard, enregistrer les vidéos dans au moins 3 différents domaines par animal.
9. Effectuer l’imagerie rapidement et de minimiser l’exposition à la lumière de la diapositive afin de préserver la mobilité des spermatozoïdes et la viabilité.
   Remarque : Cette procédure d’imagerie doit être fait dans les 2-3 min.
10. Effectuer l’analyse de données à l’aide de logiciels ImageJ comme décrit précédemment⁸.

Résultats

Sperme a été collecté de CTRL et KO femelles environ 8 h après l’accouplement avec des mâles fertiles de CTRL. Liquéfaction (ou la viscosité du sperme) est quantifiée par le temps nécessaire pour remplir le tube capillaire de 25 μl avec du sperme. Sperme collecté de l’utérus CTRL a 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) pour remplir le tube capillaire (Figure 1). Cependant, le sperme collecté de l’utérus KO a pris plu de 60 min (60,0 ±0, 0, mean±S.E.M, n...

Discussion

Collecte de sperme de l’utérus de souris peut fournir des avantages par rapport aux sperme analyse in vitro que l’ancien peut illustrer les interactions physiologiques entre le sperme et les sécrétions de l’appareil reproducteur féminin. Les techniques présentées dans cette étude permettent aux chercheurs de déterminer la qualité du sperme ainsi que la viabilité de sperme et la motilité dans des conditions physiologiques idéales. En outre, il existe diverses analyses en aval qui peuven...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration