Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Özet

Meni الرسالة sperm seminal jel--dan özgür olmak için gereklidir. Bu çalışma yordamları kadın üreme sistemi sonrası cinsel birleşme sperm toplama ve meni الرسالة Süre ölçümünü sağlar.

Özet

Farelerde, boşalmış sperm rahim içinde yatırılır. Boşalma sonra meni değiştirir tutarlılık jel benzeri için sulu, adı verilen işlem الرسالة. Bu çalışmada, kadın üreme sistemi bir fare modeli sonrası ejaculated meni toplamak için nasıl gösterir. İlk, yetişkin dişi fareler içinde estrus sahne bir erkeğin kafeste gecede yer. Ertesi sabah, birleşme vajinal açılışında çiftleşme fiş varlığı tarafından doğrulandı. Çiftleşme tıkacı ile dişi fareler euthanized ve üreme her yolu (vajina, rahim, oviducts, yumurtalık), bir bütün olarak toplanan meni içerecek şekilde kapalı bir sistem sağlamak. Vajina meni tüpün içine serbest bırakmak için kesilmiş ve üreme yolu bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirildi. En fazla sperm cilt analizi için emin olmak için dişsiz forseps vajinal sona kalan meni kovma yumurtalık ucundan boynuzları rahim sıkmak için kullanılmıştır. Tüm üreme yolu sonra atıldı. Meni içeren tüp kısaca aşağı bükülmüş. 25 μL kapiller pipet 180 ° açıyla (tüp duvara paralel) tüp içine yerleştirilmiştir. Kılcal Boru 25 μL hattına doldurmak için kullanılan süreyi kaydedildi. Meni--dan a kanıtlanmış erkek doğurmak genellikle yaklaşık 60-180 s 25 μL kılcal tüp doldurmak için alır. Bu sperm toplama tekniği de sperm görüntüleme ve motilite analizi gibi aşağı akım diğer uygulamalarda kullanılabilir.

Giriş

Kadın üreme yolu alt ve üst yolları oluşur. Üst üreme yolu fallop tüpleri, rahim ve endocerviks içerir. Alt üreme sistem ectocervix ve vajina içerir. İnsanlarda, vajina, ectocervix¹' e komşu ön duvara ejaculated meni yatırılır. Farelerde, ancak, sperm rahim içine²çiftleşme sonra dakika içinde süpürüldü.

Sperm boşalma, sperm entrapped neden zarfında katılaşmış ve³immobilize seminal jel içerir. الرسالة immobilize sperm meni bir jel gibi sulu bir tutarlılık değiştirerek serbest bırakır. Sperm motilitesi ve memeli üreme için gerekli bir süreçtir. Meni الرسالة bilgisine nerede meni bir kültür tabak içinde sıvılaştırılmış olur vitro çalışmalar çoğunlukla dayanmaktadır. İnsanlarda, enzimatik aktivite Prostat spesifik antijen veya PSA (olarak da bilinen kallikrein ilgili peptidaz 3 veya KLK3) semenogelins (meni mevcut proteinler jel şekillendirme)^{4 hidroliz ile الرسالة için büyük katkıda bulunuyor. ,5,6}. Semenogelins bozulma sperm sperm hareketliliği artan seminal coagulum, dan özgür kılar. Sperm yüzmek fallop tüpü yumurtayı döllemek için doğru serbest. الرسالة (ya da meni viskozite) bir erkek üreme⁷değerlendirmek için doğurganlık klinikleri semen analizi için standart ilk gösterimleri testlerdir.

Kısa bir süre önce bir makale dişi fare üreme yolu sonrası çiftleşme üzerinden toplanan meni analizi daha sonra doğurganlık kusurları⁸neden olabilir الرسالة bir eksikliği göstermek için kullanılabileceğini gösterir. Meni hiperviskozite gibi arızalı الرسالة infertil erkek⁹normal الرسالة memeli üreme için vazgeçilmez olduğunu düşündüren, durumlarda 11,8 32.3 oranında katkıda bulunur. Ancak, çalışmalar ve الرسالة kusur tedavisinde sadece erkek⁷üzerinde odaklanmıştır. Kadın üreme sistemi meni الرسالة içinde bir rol oynar olasılığını araştırdı değil. Bu nedenle, sperm toplama ve الرسالة zaman ölçme yöntemleri araştırmacılar الرسالة ilgi model organizma olarak infertilite nedenlerinden biri olabilir olup olmadığını belirlemek için yeni bir tanı aracı sağlar.

Protokol

Tüm hayvanlar ve bu çalışmada kullanılan yordamlar Washington State Üniversitesi (WSU) hayvan bakım ve kullanım Komitesi esaslarına göre ve WSU onaylı hayvan iletişim kuralları #4702 ve #4735 uygun olarak ele.

1. fareler

1. Standart C57BL/6J yetişkin erkek fareler veya ilgi diğer suşların kullanın. Hayvanlar altında ad libitum erişim su ve gıda ile sıcaklık ve nem kontrollü bir ortam sağlamak.
   1. 8 hafta eski 10 aylık arasında değişen erkek doğurmak kullanabilirsiniz. Sadece kanıtlanmış doğurmak deneylerde kullanın.
2. Üreme yolu östrojen reseptör α ( Esr1 gen tarafından kodlanmış) bir doku seçici silme ile yetişkin dişi fareler içinde epitel hücreleri¹⁰ kullanın (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1nakavt veya "KO" adı verilen^f/f,) ve kontrol littermates ("CTRL" denilenEsr1^f/f,) Bu çalışmada.
   1. 8 hafta-yaşlı kadın kullanın. Yaş kadın faiz deney bağlı olarak çeşitli.
3. Sabah saat 08:00 h estrous döngüsünün aşamaları belirlemek. Sadece kadın döngüsünün estrus aşamasında kullanın. Vajinal bulaşması ve saytolojik analiz ayrıntılı yöntemleri için daha önce yayımlanmış yordamlar¹¹' e bakın.

2. çiftleşme ve çiftleşme tıkacı değerlendirilmesi

1. Kadın bir erkeğin kafes içinde estrus (16:00 h) gün ev.
2. Ertesi sabah (08:00 h), dişi erkek fare ayırın.
3. Daha önce yayımlanmış yöntemi¹² bir uyarlaması varlığı ya da yokluğu bir vajinal veya çiftleşme fiş çiftleşme bir göstergesi olarak erişmek için kullanın.
4. Kısa bir süre arka bacaklarda kaldırmak için kuyruk tabanından kadın fareyi tutun.
5. Çiftleşme Tak bir kürdan kullanarak vajinal açılışında bir off-beyaz seminal coagulum varlığı bulun. Çiftleşme fiş varsa, kürdan vajinal kanala eklenecek mümkün olmayacaktır.

3. doku toplama öncesi hazırlık

1. 10 mL % 1 fetal sığır serum ile desteklenmiş iyi'nın L-15 medyanın hazırlamak (denilen L15 medya + % 1 FBS) 15 mL tüp içinde. Bir waterbath içinde 15 dakika 37 ° C'de medya kuluçkaya.
2. Doku ve aşağı akım uygulamaları için sperm canlılığı korumak için Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge FBS dokusu toplamalarında tüp.
3. 37 ° c stereomicroscope sahne sıcak 37 ° C ısı-taş ayarla ve bir boş 1.5 mL microcentrifuge tüp bloğunda yer.
4. Aşağı akım uygulamaları sperm motilitesi görüntüleme gerektiriyorsa, cam slayt 37 ° c sıcak

4. doku koleksiyonu

1. Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 FBS aliquot doku toplama alanına getirin.
2. Dişi ötenazi (~ 08: 30h) karbon dioksit boğulma kullanarak takip tarafından servikal çıkığı.
   Not: varsayarak çiftleşme gerçekleşir gece yarısı yaklaşık 8 h çiftleşme sonra bu.
3. Hayvanın karın bölgesi ortaya çıkarmak için sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
4. % 70 alkol karın arka bacaklarda yakınındaki sprey.
5. Diseksiyon makası alt karın cilt üzerinde küçük bir kesim (~ 1 cm) yapmak için kullanın.
6. Dominant el kuyruk (ve arka bacaklarda gerekirse) çekmek için kullanın sigara dominant el cilt (doğru kafa) ters yönde karın kas ortaya çıkarmak için çeker iken. Bu yöntem saç kirlenme visseral organlara en aza indirmek için kullanılır.
7. Karın kas bir V-viseral organlar ortaya çıkarmak için şekil içinde karın, vajina için bitişik temelini kesti.
8. Bağırsak ve karın yağ üreme yolu ortaya çıkarmak için kenara çek.
9. Mesane ve diğer dokular vajinal bölgede yukarıda kapalı döşeme.
10. Kasık symphysis vajinal doku erişmek için ayrı kesti.
11. Vajinal doku vajinal açılışında kaldırın ve vajinal kanal rektal dokusundan ayırmak için makas kullanarak.
12. Dikkatle bahar makas kullanırken rahim her iki taraftan Mezenterik yağı kırpın.
    Dikkat: Rahim içinde sperm ile çok kırılgandır. Rahim delik değil dikkatli olun yoksa meni kaybolacak.
13. Alt üreme sistem kaldırın ve her iki kapalı yumurtalık yağ yastığı kesti.
14. Önceden ısıtılmış iyi'nın L-15 medya + % 1 tüp içine tüm üreme yolu aktarım FBS.

5. rahim içerik koleksiyonundan meni الرسالة (viskozite) ölçümü

1. Stereomicroscope ısıtmalı sahnede bir 35 mm steril doku kültürü çanak içine belgili tanımlık doku dolu ile 3,5 mL transfer önceden sıcak L-15 medya + % 1 FBS dokuların kan ve diğer kirleri temizlemek için.
   Dikkat: yıkama sırasında dokuların yağ tarafından değil rahim al. Bu noktada, meni bekleniyor rahim içinde sağlam olmalı.
2. Laboratuvar mendil kullanarak aşırı medya dokuların leke.
3. Doku vajinal sonunda Önceden ısıtılmış microcentrifuge tüpte yumurtalık biter yerleştirerek süre tutun. Vajinal sonuna tutarken, temelini microcentrifuge tüp içine düşmek rahim boynuzları sağlayan rahim, rahim boynuzları kesti.
4. Meni izin tüp içine rahim boynuzları dışarı akışı. Dişsiz forseps yavaşça kalan meni kovma vajinal sonuna yumurtalık sonundan itibaren boynuzları rahim sıkmak için kullanın.
5. Biohazard çanta ve dokularda atın ve yakıp kül.
6. Kısaca bir minicentrifuge meni aşağı spin (~ 1-2 s).
7. Tüp, ısıtmalı sahneye paralel lay - meni dışarı dökülecek değil.
8. Hazır çekim var ve 'saymak için ' set.
9. Meni örneği (tüp duvara paralel) 180 ° açıyla bir 25 µL kılcal tüp takın. Kılcal tüp farklı açılarda holding üzerinden her araştırmacı arasında değişkenlik en aza indirmek için bu.
10. Kılcal Boru yapar zamanlayıcıyı basın meni ile temas.
11. Meni 25 µL çizgisine ulaşmak gereken süreyi (s) kaydedin.
12. Ölçüm bittiğinde hemen geri daha fazla fonksiyonel analiz, sperm motilitesi video görüntüleme gibi kuru sıcak blok meni içeren tüp koymak.
13. 20 dk için % 10 çamaşır suyu çözüm tüpte çeker tarafından meni içeren kılcal tüp dezenfekte ve kılcal tüp "Sharps" kap içinde atın.

6. Sperm motilitesi video görüntüleme

1. Mikroskop ve video görüntüleme yazılımını açın.
2. Sahne Alanı'nda ısıtmalı cam slayt yerleştirilir iken, Önceden ısıtılmış cam slayt üzerine kalan meni 20 µL pipet.
3. Bir cam coverslip ile kapak.
4. Slayt coverslip yan mikroskobunun yerleştirin.
5. 20 X objektif lens ilgi alanı bulmak için kullanın.
6. 100 X objektif lens için video görüntüleme için değiştirin.
7. Video: 12 kare/s (fps) 30 kayıt s.
8. Rastgele videolar hayvan başına en az 3 farklı alanlarda kaydedin.
9. Görüntüleme gerçekleştirmek hızlı bir şekilde ve sperm motilitesi ve canlılığı korumak için slayda ışık pozlandırmayı en aza indirmek.
   Not: Görüntüleme bu yordamı 2-3 dakika içinde yapılmalıdır.
10. ImageJ yazılım yukarıda açıklanan⁸olarak kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Meni ile verimli CTRL erkek çiftleşme sonra CTRL ve KO kadın yaklaşık 8 h dan toplanmıştır. 25 μL kılcal tüp meni ile doldurmak için geçen süre tarafından الرسالة (ya da meni viskozite) sayılabilir. CTRL uteri toplanan meni aldı 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) kılcal tüp (şekil 1) doldurmak için. Ancak, KO uteri toplanan meni 60 dk uzun sürdü (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) deneysel zaman. Bu veriler meni önemli ölçüde daha fazla dize...

Tartışmalar

Meni ve kadın üreme yolu. salgılar arasındaki fizyolojik etkileşimler eski gösterdiği gibi fare uteri sperm toplama semen analizi vitro avantajları sağlayabilir Bu çalışmada sunulan teknikleri araştırmacılar sperm kalitesi hem de sperm canlılığı ve motilite ideal fizyolojik koşullarda belirlemek için izin verir. Ayrıca, uteri toplanan sperm kullanılarak gerçekleştirilen çeşitli aşağı akım analizleri, örneğin, sperm rahim ve sperm girme gerçek sperm sayısı ayrıca hare...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration