Коллекции после спаривания спермы от женского репродуктивного тракта и измерение сжижения спермы мышей

Резюме

Семен сжижения необходим для спермы, чтобы освободиться от семенных геля. Это исследование содержит процедуры для сбора спермы от женского репродуктивного тракта после полового акта и Семен сжижения время измерения.

Аннотация

В мышей которое преодолевает эякулированное семя осаждается в матке. После эякуляции, Семен изменяет последовательность с гель как водянистые, процесс называется сжижение. В этом исследовании мы покажем, как собрать после которое преодолевает эякулированное семя от женского репродуктивного тракта в мышиной модели. Во-первых, взрослых самок мышей в стадии эструса были размещены в клетке мужчина на ночь. Следующим утром, совокупление было подтверждено наличие копулятивного вилку на влагалище. Самок мышей с копулятивного вилки были умерщвлены, и каждый репродуктивного тракта была собрана в целом (влагалища, матки, яйцеводов, яичников), обеспечение закрытой системы содержат спермы. Репродуктивного тракта был помещен в пробки microcentrifuge 1,5 мл, и влагалища был отрезан выпустить спермы в трубу. Для обеспечения максимальной спермы тома для анализа, беззубый щипцы были использованы для выжать матки рога из яичников конца для вагинального конца изгнания оставшихся спермы. Весь репродуктивного тракта был затем отбрасывается. Семен содержащих трубки был кратко вращаться вниз. 25 мкл капиллярной пипеткой был помещен в трубу под углом 180° (параллельно стенкам трубки). Количество времени, используемый для заполнения капиллярную трубку к линии 25 мкл был записан. Сперма из проверенных мужской заводчик обычно занимает около 60-180 s для заполнения 25 мкл капиллярной трубки. Этот метод сбора спермы может также использоваться в других нисходящие приложения, такие как анализ изображений и подвижности спермы.

Введение

Женского репродуктивного тракта состоит из верхней и нижних участков. Верхняя репродуктивного тракта включает фаллопиевы трубы, матка и эндоцервикса. Нижняя репродуктивного тракта включает в себя ectocervix и влагалище. В организме человека которое преодолевает эякулированное семя осаждается на передней стенке влагалища, прилегающих к ectocervix¹. В мышей однако, Семен заметен в полость матки в течение нескольких минут после спаривания².

Семен содержатся семенных гель, который затвердевает в течение нескольких секунд семяизвержение, вызывая спермы, чтобы быть в ловушке и иммобилизованные³. Сжижение выпускает подвижности сперматозоидов, изменив спермы с гель как к водянистой консистенцией. Этот процесс имеет важное значение для сперматозоидов и mammalian воспроизведение. Знание Семен сжижения основана главным образом на в vitro исследования где спермы становится сжиженные в культуры блюдо. В организме человека Ферментативная активность Простатоспецифический антиген или PSA (также известный как калликреин связанных пептидаза 3 или KLK3) является основным донором для разжижения путем гидролиза semenogelins (гелеобразующий белков, присутствующих в сперме)^{4 ,5,6}. Деградации semenogelins освобождает спермы от семенных сгусток, увеличение подвижности сперматозоидов. Освободил спермы плавать к маточной трубе, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Сжижение (или вязкость спермы) тесты являются одним из стандартных первоначальный показы для анализа спермы в рождаемость клиники для оценки фертильности мужчин⁷.

Недавно опубликованные статьи показывает, что анализ семенной жидкости, собранные от репродуктивного тракта женский мыши после спаривания может использоваться для иллюстрации дефицит сжижения, которые впоследствии могут вызвать плодородие дефекты⁸. Дефектные разжижения таких Семен повышенной способствует 11,8-32,3% случаев бесплодных мужчин⁹, о том, что нормальный сжижения незаменимым для млекопитающих размножения. Однако исследования и лечения дефектов сжижения были сосредоточены исключительно на мужчин⁷. Возможность, что женского репродуктивного тракта играет определенную роль в Семен сжижения не изучены. Таким образом методы для сбора спермы и сжижение время измерения обеспечит исследователи романа диагностический инструмент для определения ли сжижения может быть одной из причин бесплодия в организме модель интерес.

протокол

Все животные и процедуры, используемые в данном исследовании были обработаны согласно Вашингтон государственного университета (Вашингтон) животное уход и использование Комитетом руководящих принципов и в соответствии с WSU утвержденных животных протоколы #4702 и #4735.

1. мышь

1. Использование стандартных взрослых самцов мышей C57BL/6J или другие штаммы интерес. Сохранить животных под контролем температуры и влажности среды, с доступом ad libitum воды и пищи.
   1. Использование мужского заводчиков, начиная от 8 недель до 10 месяцев. Используйте только проверенные селекционеров в экспериментах.
2. Использовать в эпителиальных клеток¹⁰ взрослых самок мышей с выборочного удаления ткани репродуктивного тракта эстроген рецептор α (кодируется геном Esr1 ) (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, называется нокаут или «Ко») и контролировать однопометники (Esr1^f/f, под названием «CTRL») в этом исследовании.
   1. Используйте 8 недели старый женщин. Возраст женщин варьируется в зависимости от эксперимента интерес.
3. Определите этапы эстрального цикла утром в 08:00 ч. Используйте только самки на стадии эструса цикла. Для подробных методов вагинальная смазка и цитологического анализа обратитесь к ранее опубликованным процедурам¹¹.

2. спаривания и оценки копулятивного вилки

1. В день течки (16:00 h) дом девушки в клетке мужчины.
2. Утром следующего дня (08:00 h), отдельные женщины от мужчины мыши.
3. Используйте адаптация опубликованных ранее метод¹² для доступа наличие или отсутствие вагинальный или копулятивного вилка как признак спаривания.
4. Держите женского мышь от основания хвоста кратко поднять задних конечностей.
5. Найти вилку копулятивного наличием беловатого семенных сгусток на влагалище с помощью зубочистки. Если присутствует копулятивного вилка, зубочистка не будет возможность быть вставлен в вагинальный канал.

3. Подготовка перед ткани коллекции

1. Подготовка 10 мл Лейбовиц L-15 СМИ, дополнена плода бычьим сывороточным 1% (называется L15 СМИ + 1% FBS) в 15 мл. Инкубируйте СМИ при 37 ° C 15 мин в капилляре.
2. Для того, чтобы сохранить жизнеспособность тканей и спермы для нисходящие приложения, аликвота 2 мл подогретым L15 СМИ + 1% FBS в 2 мл microcentrifuge трубки для коллекции тканей.
3. Теплый этап стереомикроскопом до 37 ° C. Установка тепло блок до 37 ° C и место пробки microcentrifuge пустой 1,5 мл в блоке.
4. Если нисходящие приложения требуют изображений сперматозоидов, теплое стекло слайд 37 ° C.

4. ткани коллекции

1. Принесите подогретым L15 СМИ + 1% Алиготе FBS в область коллекции тканей.
2. Усыпить самка (~ 08: 30h) с использованием двуокиси углерода удушение следуют шейки матки дислокации.
   Примечание: Это около 8 ч после спаривания, предполагая, что спаривание происходит в полночь.
3. Место животного в лежачем положении, чтобы разоблачить брюшной области.
4. Spray 70% спирта на животе возле задних конечностей.
5. Используйте рассечения ножницы сделать небольшой надрез (~ 1 см) на кожу нижней части живота.
6. Используйте доминирующей рукой тянуть хвост (и задних конечностей при необходимости) в то время как недоминирующих руку тянет кожи в противоположном направлении (в сторону головы) подвергать брюшной мышцы. Этот метод используется для сведения к минимуму количество волос загрязнения внутренних органов.
7. Вырежьте V-образной формы на базе органов брюшной полости, прилегающей к влагалища, подвергать висцеральных органов брюшной мышцы.
8. Двигаться в сторону, чтобы разоблачить репродуктивного тракта кишечника и брюшной жир.
9. Обрежьте мочевого пузыря и другие ткани выше вагинальной области.
10. Разрежьте лобковой симфиза получить доступ к вагинальной ткани.
11. Поднимите вагинальной ткани на влагалище и используя ножницы для разделения вагинальный канал от ректального ткани.
12. Осторожно обрежьте брыжеечных жира с обеих сторон матки с помощью ножниц весной.
    Предупреждение: Матки очень нестабильна с спермы внутри. Будьте осторожны, чтобы не пункции матки, или же спермы, будут потеряны.
13. Поднимите нижний репродуктивного тракта и вырезать яичников жировой ткани с обеих сторон.
14. Передача всей репродуктивного тракта в трубу L-15 СМИ + 1% подогретым Лейбовиц FBS.

5. Измерение сжижение (вязкость) спермы из матки содержимого коллекции

1. На сцене с подогревом стереомикроскопом, передачи тканей в 35 мм стерильные тканевой культуры блюдо заполнены с 3,5 мл предварительно разогретую L-15 СМИ + 1% FBS очистить ткани крови и других загрязнений.
   ВНИМАНИЕ: Во время стирки, захватите ткани, жир, не матки. На данный момент, Семен ожидается быть неповрежденной внутри матки.
2. Пятно тканей избыток средств массовой информации, с использованием лабораторных салфетки.
3. Удерживая ткани влагалища конце размещение яичников заканчивается в предварительно нагретой microcentrifuge трубки. Придерживая конец влагалища, вырежьте маточные рожки на базе матки, позволяя маточные рожки попасть в пробки microcentrifuge.
4. Пусть спермы поток из рога матки в трубу. Используйте беззубый щипцами Осторожно выжать матки рога из яичников конца до конца влагалища, изгнав из остатки спермы.
5. Отменить ткани в биологической мешок и сжигать.
6. Кратко вращаться вниз спермы в minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Положите трубку, параллельно с подогревом стадии - Семен не будет проливаться.
8. Есть таймер готов и установить «подсчитать».
9. Вставьте 25 мкл капиллярной трубки в образца спермы под углом 180° (параллельно стенкам трубки). Это должно минимизировать изменчивость между каждого следователя от проведения капиллярную трубку под разными углами.
10. Нажмите таймер, как только капиллярной трубки делает контакт с спермы.
11. Рекордное время (s), он принимает для спермы до 25 мкл линии.
12. По окончании измерения немедленно положите трубку, содержащие сперму обратно в блоке сухого тепла для дальнейшего функционального анализа, таких как видео изображений сперматозоидов.
13. Продезинфицируйте капиллярной трубки, содержащие сперму, погружая трубку в раствор 10% отбеливателя для 20 мин и отбросить капиллярной трубки в Шарпс контейнер.

6. видео изображений сперматозоидов

1. Включите в микроскоп и видео изображений программное обеспечение.
2. Пипетка 20 мкл оставшиеся спермы на слайд подогретым стекла, в то время как стеклянное скольжение помещается на сцене с подогревом.
3. Крышка с coverslip стекла.
4. Место на стороне coverslip слайд вниз на микроскопе.
5. Используйте 20 X объектив, чтобы найти области интереса.
6. Изменить на 100 X объектив для видео изображения.
7. Запись видео на 12 кадров в секунду (fps) для 30 s.
8. Случайно Запишите видео в по крайней мере 3 различных областях на животное.
9. Выполнение визуализации быстро и сведения к минимуму воздействия света на слайд с целью сохранения сперматозоидов и жизнеспособности.
   Примечание: Эта процедура обработки изображений должно быть сделано в течение 2-3 мин.
10. Выполните анализ данных, с помощью ImageJ программного обеспечения, как описано выше⁸.

Результаты

Сперма была собрана из CTRL и KO самок около 8 ч после спаривания с плодородной CTRL мужчины. Сжижение (или вязкость спермы) количественно, время, необходимое для заполнения 25 мкл капиллярной трубки с спермы. Семен, собранные из матки CTRL взял 2.06 мин ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) для заполнения капиллярн?...

Обсуждение

Сбор спермы от мыши матки может предоставить преимущества над Семен анализ в пробирке , как первый можно проиллюстрировать физиологические взаимодействий между спермы и выделениями из женского репродуктивного тракта. Методы, представленные в настоящем исследовании позволя...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration