Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Zusammenfassung

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

Zusammenfassung

Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.

Einleitung

Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix¹hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung²gefegt.

Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und³immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)^{4 ,5,6}. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit⁷bewerten.

Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte⁸verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer⁹, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen⁷konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.

Protokoll

Alle Tiere und Verfahren, die in dieser Studie wurden nach Washington State University (WSU) Animal Care und Use Committee Richtlinien und unter Einhaltung der WSU zugelassene tierische Protokolle #4702 "und" #4735 bearbeitet.

(1) Mäuse

1. Verwenden Sie standard C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen oder anderen Stämmen von Interesse. Tiere unter einer kontrollierter Temperatur und feuchte Umgebung, mit Ad Libitum Zugang von Wasser und Nahrung zu erhalten.
   1. Verwenden Sie männlichen Züchter von 8 Wochen bis 10 Monate alt. Verwenden Sie nur bewährte Züchter in den Experimenten.
2. Erwachsene weibliche Mäuse mit einem Gewebe selektives Löschen der Fortpflanzungsorgane Östrogen Rezeptor α (kodiert durch Esr1 gen) in den Epithelzellen¹⁰ verwenden (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, Ko- oder "KO" genannt) und Wurfgeschwistern (Esr1^f/f, genannt "Strg") in dieser Studie zu kontrollieren.
   1. Verwenden Sie 8 Wochen alten Weibchen. Alter der Weibchen variiert in Abhängigkeit von dem Experiment von Interesse.
3. Bestimmen Sie die Phasen des Estrous Zyklus morgens um 08:00 h. Verwenden Sie nur die Weibchen in der Brunst Phase des Zyklus. Für detaillierte Methoden der vaginalen verschmieren und zytologische Analyse beziehen sich auf die bisher veröffentlichten Verfahren¹¹.

2. Paarung und Bewertung copulator Stecker

1. Am Tag des Östrus (16:00 h) Haus der Frau in einer männlich Käfig.
2. Trennen Sie am nächsten Morgen (08:00 h), das Weibchen von der männlichen Maus.
3. Verwenden Sie eine Anpassung eines bereits veröffentlichten Methode¹² , um das Vorhandensein oder Fehlen eines vaginalen oder copulator Steckers als Indiz für die Paarung zuzugreifen.
4. Halten Sie die weibliche Maus von der Schwanzwurzel kurz anheben der Hintergliedmaßen.
5. Finden Sie den copulator Stecker durch die Anwesenheit von ein wollweißer bahnbrechenden Koagulum an die vaginale Öffnung mit einem Zahnstocher. Wenn der copulator Stecker vorhanden ist, werden die Zahnstocher in den Vaginalkanal eingefügt nicht.

3. Vorbereitung vor dem Gewebe Sammlung

1. 10 mL Leibovitzs L-15 Medien, ergänzt mit 1 % fötalen Rinderserum vorbereiten (namens L15 Medien + 1 % FBS) in einem 15 mL-Tube. Inkubieren Sie die Medien bei 37 ° C für 15 Minuten in ein Wasserbad.
2. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes und Sperma für downstream-Anwendungen zu erhalten, Rohr aliquoten 2 mL vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS in ein 2 mL Microcentrifuge für Gewebe-Sammlung.
3. Die Bühne des Stereomikroskops auf 37 ° c warm Der Heizblock auf 37 ° C festgelegt, und legen Sie einen leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in den Block.
4. Wenn die downstream-Anwendungen erfordern imaging der Beweglichkeit der Spermien, warme Objektträger auf 37 ° C.

(4) Gewebe-Sammlung

1. Das Gewebe Sammelgebiet bringen Sie vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS aliquoten.
2. Das Weibchen einschläfern (~ 08: 30h) mit Kohlendioxid Erstickung gefolgt von zervikale Dislokation.
   Hinweis: Dies ist etwa 8 Stunden nach der Paarung, geht man davon aus, dass die Paarung um Mitternacht stattfindet.
3. Legen Sie das Tier in Rückenlage, im Bauchbereich verfügbar zu machen.
4. Sprühen Sie 70 % Alkohol auf dem Bauch in der Nähe der hinteren Gliedmaßen.
5. Verwenden Sie die sezierenden Schere einen kleinen Schnitt (~ 1 cm) zu machen, auf die Haut des Unterleibs.
6. Die dominante Hand verwenden, um die Rute (und Hintergliedmaßen ggf.) ziehen während der nichtdominanten Hand zieht die Haut in die entgegengesetzte Richtung (in Richtung zum Kopf), um die Bauchmuskulatur freizulegen. Diese Methode wird verwendet, um Haare Kontamination der viszeralen Organe zu minimieren.
7. Schneiden Sie die Bauchmuskulatur in V-Form an der Unterseite des Bauches, angrenzend an die Vagina, die viszeralen Organe aussetzen.
8. Verschoben Sie Darm und Bauchfett auf die Seite, die Fortpflanzungsorgane verfügbar zu machen.
9. Schneiden Sie Blase und anderen Geweben über den vaginalen Bereich.
10. Schneiden Sie Schambeinfuge auseinander, um Zugang zu der vaginalen Gewebe.
11. Heben des vaginalen Gewebes an der Scheidenöffnung und mittels Schere um den vaginalen Kanal aus dem rektal Gewebe zu trennen.
12. Schneiden Sie sorgfältig die mesenterialen Fett von beiden Seiten der Gebärmutter mit Feder Schere ab.
    Achtung: Die Gebärmutter ist sehr empfindlich mit den Samen im Inneren. Achten Sie darauf, die Gebärmutter zu durchbohren, sonst werden die Samen verloren gehen.
13. Heben Sie den unteren Genitaltrakt und schneiden Sie die Eierstöcke Fettpolster Weg von beiden Seiten.
14. Übertragung der gesamten Fortpflanzungsorgane in das Rohr des vorgewärmten Leibovitz L-15 Media + 1 % FBS.

5. Messung der Samen Verflüssigung (Viskosität) von uterinen Content Collection

1. Auf der beheizten Bühne des Stereomikroskop, Übertragung, die das Gewebe in einen 35 mm steril Gewebekultur Teller mit 3,5 mL gefüllt vorgewärmt, L-15 Media + 1 % FBS zu die Geweben von Blut und anderen Schadstoffen zu reinigen.
   Achtung: Beim Waschen, schnappen Sie sich das Gewebe durch das Fett nicht in die Gebärmutter. Zu diesem Zeitpunkt dürfte das Sperma in die Gebärmutter intakt sein.
2. Tupfen Sie das Gewebe des überschüssigen Medien mit Labor-Feuchttücher.
3. Halten Sie das Gewebe am vaginalen Ende während des Einsetzens der Eierstöcken Ends in den vorgewärmten Microcentrifuge Schlauch. Halten Sie das vaginale Ende, schneiden Sie die uterine Hörner an der Basis der Gebärmutter, so dass die Gebärmutter Hörner in den Microcentrifuge Schlauch fallen.
4. Lass das Sperma fließen aus der Gebärmutter Hörner in die Röhre. Verwenden Sie zahnlos Zange, um drücken Sie vorsichtig die uterine Hörner aus dem Eierstock Ende der vaginalen Ende, Vertreibung aus übrig gebliebenen Samen.
5. Das Gewebe im Biohazard Beutel entsorgen und verbrennen.
6. Kurz spin-down der Samen in ein Minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Legen Sie das Rohr parallel zu den beheizten Objekttisch - Sperma wird nicht austreten.
8. Den Timer bereit und "aufwärts".
9. Die Samenprobe in einem Winkel von 180° (parallel zu der Rohrwand) stecken Sie eine 25 µL Kapillarrohr. Dies ist die Variabilität zwischen jeder Ermittler aus dem Besitz der Kapillare in verschiedenen Winkeln zu minimieren.
10. Drücken Sie die Timer, sobald das Kapillarrohr macht Kontakt mit den Samen.
11. Notieren Sie die Zeit (s) die es für das Sperma dauert um die 25 µL-Linie zu erreichen.
12. Wenn die Messung abgeschlossen ist, legen Sie sofort die Röhrchen mit Sperma zurück in die trockene Hitze-Block für weitere funktionelle Analysen, wie z.B. video Darstellung der Beweglichkeit der Spermien.
13. Desinfizieren Sie das Kapillarrohr mit Sperma durch das Rohr in 10 % Bleichmittel-Lösung für 20 min eintauchen und entsorgen Sie das Kapillarrohr in Sharps Container.

6. video Imaging der Beweglichkeit der Spermien

1. Schalten Sie das Mikroskop und video-imaging-Software.
2. Pipette 20 µL des verbleibenden Spermas auf der vorgewärmten Glas-Folie, während die Objektträger auf den beheizten Objekttisch gelegt wird.
3. Mit ein Glas Deckglas abdecken.
4. Legen Sie die Folie Deckglas Seite nach unten auf das Mikroskop.
5. Verwenden Sie 20 X Objektiv Interessengebiet zu finden.
6. Ändern Sie in 100 X Objektiv für video Imaging.
7. Nehmen Sie die Video auf 12 Bilder/s (fps) für 30 s.
8. Nach dem Zufallsprinzip Videoaufnahmen Sie die in mindestens 3 verschiedenen Bereichen pro Tier.
9. Führen Sie die Bildgebung schnell und Belichtung auf die Folie zu minimieren, um Beweglichkeit der Spermien und Lebensfähigkeit zu erhalten.
   Hinweis: Dieses bildgebende Verfahren sollte innerhalb von 2 – 3 min. erfolgen.
10. Datenanalyse mit ImageJ-Software als zuvor beschriebenen⁸.

Ergebnisse

Sperma wurde von Strg und KO Weibchen ca. 8 h gesammelt, nach der Paarung mit fruchtbaren Strg-Männchen. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) wird durch den Zeitaufwand für die 25 μL Kapillarrohr mit Sperma füllen quantifiziert. Samen gesammelt von Strg Uteri 2.06 ±0.12 min nahm (mean±S.E.M, n = 5), das Kapillarrohr (Abbildung 1) zu füllen. Die Samen gesammelt von KO Uteri dauerte jedoch länger als 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentelle Zeit. Dies...

Diskussion

Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Ut...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toothpick	Diamond	750-Flat	Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors	Fisher	08-940
Spring scissors	Roboz	RS-5600
Fine forceps	Roboz	RS-5045
25-μL glass capillary tube	VWR	53432-761
Leibovitz’s L-15 media	Life Technologies	11415064	Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-A
Digital dry block heater	VWR	13259-052	For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge	Corning	LSE 6765
35-mm culture dish	VWR	10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube	VWR	10025-686
Waterbath	Precision	TSGP05
Heated stage stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ10F	To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope	Leica Microsystems	DMi8	Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides	Fisher	12-552-3	Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip	VWR	48393-059	Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach			Dilute in dH2O to 10% concentration