Grabación de la presión intracavernosa para evaluar la función eréctil en roedores

Resumen

Grabación de la presión intracavernosa (PIC) es un método importante para evaluar la función eréctil de animales de experimentación. Aquí, se demuestra un protocolo detallado para el procedimiento de grabación de ICP catheterizing el pene de muslos y luego eléctricamente estimulando los nervios cavernosos en ratas.

Resumen

La disfunción eréctil (ED) se define como la incapacidad para lograr o mantener una erección del pene, y esto se ha convertido en un frecuente trastorno sexual masculino. Roedores son empleados por muchos estudios para investigar la fisiología, patología de la función eréctil. La función eréctil en roedores puede evaluarse mediante la medición de la presión intracavernosa (PIC). En la práctica, la ICP puede controlarse después de la estimulación eléctrica de los nervios cavernosos (CNs). La presión arterial de la arteria carótida (la presión arterial media) se utiliza como referencia para ICP. Mediante ICP protocolos de grabación, muchos parámetros clave de la función eréctil pueden medirse de la curva de respuesta ICP. La medición de ICP proporciona más información que el test de erección peneal inducido por apomorfina y es más barata que el monitoreo telemétrico del pene del spongiosum de la recopilación de corpus, haciendo este método el más popular para evaluar la función eréctil. Sin embargo, en comparación con la prueba realizada fácilmente inducida por la APO la función eréctil, exitosas grabaciones de ICP requieren atención al detalle, práctica y adhesión al método de operación. En este trabajo, una introducción a la grabación de la ICP en las ratas se proporciona como complemento al procedimiento eficientemente.

Introducción

Se define como la incapacidad para lograr o mantener una erección del pene y se ha convertido en un trastorno sexual masculino común¹. Animales de experimentación se utilizan y proporcionan modelos reproducibles para investigar la función eréctil². Durante mucho tiempo, varios modelos de animales más grandes se han empleado para la investigación de la función eréctil^3,4,5. Aunque los roedores son relativamente pequeños en comparación con otros animales, también se utilizan para el estudio de la disfunción eréctil masculina debido a que varias ventajas⁶. En primer lugar, las características sexuales morfológicas y funcionales de los seres humanos son recapituladas en roedores. En segundo lugar, en comparación con animales más grandes en estudios de ED, los roedores son más económicos comprar, casa y mantener. Modelos de roedores genéticamente modificados, tercer proporcionan ventajas en reproducibles y posteriores estudios conductuales y neurofisiológicos. Por lo tanto, roedores se han convertido rápidamente en los animales primarios utilizados en el estudio de la disfunción eréctil masculina.

Beneficiándose de un fondo genético puro y condiciones de cultivo constantes, modelos de roedores han proporcionado datos consistentemente reproducible^5,6,7,8. Entre los numerosos estudios disponibles relacionados con muchos aspectos de las funciones eréctiles, la apomorfina (APO)-respuesta eréctil inducida y la prueba de respuesta inducida por la estimulación eléctrica ICP son los métodos más ampliamente utilizados que reflejan confiable eréctil función^9,10,11,12. La prueba de la función eréctil inducida por APO, desarrollada por Heaton et al. ¹³, es un bioensayo que utiliza el fenómeno de que la administración de apomorfina en ratas provoca erecciones y bostezos. Como una estable, fácil y no invasiva-bioensayo para evaluar la función eréctil, la prueba de APO-inducida de la función eréctil es ampliamente utilizada en muchos estudios. Sin embargo, este ensayo no refleja adecuadamente la calidad de erecciones o los cambios dinámicos en el flujo sanguíneo asociado con una respuesta eréctil¹⁴. Las mediciones de la PIC inicialmente fueron desarrolladas por Quinlan et al. ¹⁵. en este método, se coloca un catéter en la arteria carótida para medir la presión arterial sistémica, y otro catéter se inserta en los cuerpos cavernosos crus para grabar el PIC. Antes o durante el ICP de grabación, un agente vasoactivo o estimulación de campo eléctrico del ganglio pélvico mayor (MPG) o CN fueron dados a menudo a las ratas¹⁴. Este ensayo ha sido una herramienta confiable para la evaluación de las terapias y medicamentos para la disfunción eréctil y es probable que se utilizará como método de evaluación vital en el futuro⁶.

En comparación con la prueba realizada fácilmente inducida por la APO la función eréctil, exitosas grabaciones de ICP requieren atención al detalle, práctica y adhesión al método de operación. Por lo tanto, presentamos una descripción detallada de cómo realizar la grabación de ICP.

Protocolo

Tres meses y 18 meses en el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley. Todos los animales se manejaron con arreglo a las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Procedimientos con sujetos animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional local y Comité de ética, con un esfuerzo para minimizar el sufrimiento de los animales. Los protocolos fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de tecnología de Nanjing (Nanjing, China).

Las ratas fueron divididas en dos grupos según su edad y funcionamiento preliminar de la prueba de APO-inducida de la función eréctil antes de la grabación de ICP: el joven normal grupo (YN) y disfunción eréctil de grupo (grupo de AE)¹⁰.

1. preparación antes de la cirugía

1. Hacer manualmente un par de electrodos bipolares para la grabación de ICP (figura 1). Un poco doble los extremos de los electrodos y ajustar la distancia entre dos electrodos a 1-2 mm de ancho, como se muestra en la figura 1A.
2. Conecte los electrodos al estimulador con dos pinzas de cocodrilo (figura 1AB).
3. Montar el sistema de catéter: En primer lugar, conecte una aguja hipodérmica de 23G a una llave de 3 vías con tubo, luego conecte la llave de paso para el transductor de presión. A continuación, conecte una jeringa de 10 mL al tercer de llave de paso para proporcionar la solución salina de heparina.
4. Cuidadosamente busque fugas después de llenar todo el sistema con solución salina de heparina (200 U/mL). Girar la llave de 3 vías para cerrar el canal de la jeringa o el canal de transductor de presión (figura 1).
5. Levante la aguja 20 cm el nivel de la plataforma de madera. Entonces calibrar la presión a 20 cm H₂O. el sistema de grabación Después de eso, mover la altura de la aguja para verificar la exactitud del sistema de grabación. Repetir la calibración hasta que se confirmó la exactitud.
6. Las ratas de transferencia de la instalación de animales a la sala de cirugía y deje que se acostumbre a la sala de cirugía durante al menos 30 minutos.
7. Los instrumentos en autoclave son rociados con etanol al 70% antes de la cirugía

2. cirugía

1. Anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal y espere 5-10 minutos pellizcar los dedos de los pies para confirmar una adecuada anestesia.
2. Afeitarse la piel del abdomen y el cuello con una afeitadora eléctrica y colocar la rata en su espalda en un cojín de calefacción.
3. Limpie el área de cirugía con bolas de algodón empapado de solución povidona-yodo al 10% seguidos de bolas de algodón empapado etanol al 70%. También, aplicar pomada oftálmica para evitar que los ojos de la desecación.
4. Cateterizar la arteria carótida izquierda.
   1. Tome la piel del cuello con pinzas y hacer una incisión horizontal en el medio del cuello. Haga una incisión en los músculos, cuidadosamente exponer la arteria carótida izquierda y aislar una sección de 5 mm de la embarcación.
   2. Cuidadosamente separar la arteria carótida del nervio del nervio vago mediante fórceps, dibujar una sutura de seda debajo de la arteria carótida y poner un lazo flojo en el extremo caudal del buque y hacer otro nudo apretado en el extremo craneal de la nave.
   3. Caudalmente la abrazadera del buque con una pinza de bulldog por encima de la sutura para detener el flujo de sangre.
   4. Hacer una incisión en el recipiente con las tijeras de microcirugía e Inserte el catéter arterial hacia el corazón con la ayuda del micro disección del gancho y pinzas.
   5. Fije la ligadura caudal floja alrededor del catéter para asegurarlo. Retire la pinza bulldog para recuperar el flujo de sangre.
5. Aislar el CN y colocar el electrodo
   1. Levantar la piel y el músculo del abdomen con un par de pinzas. Con las tijeras de disección, corte a través de la parte inferior del abdomen hacia el pene para hacer una incisión de línea media.
   2. Empuje suavemente el intestino con torunda en la parte superior de la cavidad abdominal.
   3. Agarre la vejiga con un par de pinzas y extraer la vejiga de la cavidad abdominal. Exponga los lóbulos ventrales de la próstata, que se encuentra en la porción ventral de la uretra.
   4. Tire hacia afuera de los lóbulos ventrales de la próstata, vesícula seminal y conducto deferente para exponer el lóbulo dorsal de la próstata. Encontrar el punto de adherencia de los conductos deferentes y próstata.
   5. Separar el espacio entre la próstata y conductos deferentes. Exponer cuidadosamente la cápsula fibrosa, que se encuentra posterior al punto de la ensambladura de la próstata y conductos deferentes. A continuación se encuentra el ganglio pélvico mayor (figura 2).
      Nota: Los nervios cavernosos y ganglio pélvico mayor pueden verse en la superficie de la próstata.
   6. Cuidadosamente seco y CN con un hisopo estéril. Cuidadosamente aislar y enganchar el nervio cavernoso derecho con los electrodos bipolares.
6. Cateterizar los muslos izquierdos
   1. Corte una pequeña incisión en la piel del pene con unas tijeras de disección y luego raspar con cuidado la piel del eje del pene.
   2. Diseccionar la musculatura del pene estriada. Encontrar la rama superior del hueso pubis.
   3. Exponer el músculo bulboesponjoso, que cubre la bombilla spongious.
   4. Dividir el músculo bulboesponjoso del músculo isquiocavernoso utilizando fórceps curvado.
   5. Aislar cuidadosamente el músculo isquiocavernoso con fórceps curvado y luego se corta el músculo isquiocavernoso para dejar al descubierto la blanca túnica albugínea de los cuerpos cavernosos crus.
   6. Siguiendo la dirección anatómica de los cuerpos cavernosos crus, cuidadosamente Inserte la aguja en el muslo cuerpos cavernosos a través de la blanco de la túnica albugínea.
      Nota: Este es un paso crucial para la cateterización exitosa. Se puede inyectar una pequeña cantidad de solución salina heparinizada, y debe observarse una ligera tumescencia del pene, si la aguja ha sido insertada correctamente.
   7. Con cuidado suelte la aguja y evitar cualquier deslizamiento de la aguja o la interrupción del tubo de conexión. Revise cualquier fuga.

3. estimular la NC

1. Abra el programa de software para la grabación de la señal de presión y empezar la grabación de la señal de presión.
2. Los parámetros de la estimulación: 15 Hertz, anchura de pulso de 5 milisegundos, 5 voltios y una duración de s 60. Estimular la CN a una frecuencia de 15 Hz con una anchura de pulso de 5 ms.
   Nota: Un fuerte aumento del ICP puede observarse mientras se aplica la estimulación eléctrica.
3. Permite un intervalo de 30 minutos de descanso entre estímulos. El máximo de estimulación consecutivo en cada animal es tres veces.

4. fin del procedimiento

1. Después de la grabación, administrar eutanasia inyectando una sobredosis de pentobarbital sódico a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal. Control de su presión arterial para confirmar la muerte de las ratas. Eliminar las ratas y limpiar las herramientas de la cirugía.

5. Análisis de datos

1. Guardar y exportar los datos desde el software. La respuesta se expresa comúnmente como el cociente del ICP a la presión arterial media sistémica (mapa). Se calcula el cociente de pico ICP/mapa para evaluar la función eréctil.
2. Agrupar los datos de al menos cinco ratas y analizan con el software estadístico. Las diferencias se consideran estadísticamente significativos cuando p < 0.05, utilizando la prueba t de Student.

Resultados

Numerosos estudios han demostrado que la disfunción eréctil en personas de edad los varones se está convirtiendo en un problema común. Sin embargo, tratamiento médico es limitado en el manejo de envejecimiento relacionados con ED¹⁶. En modelos de roedores de ED relacionados con el envejecimiento, muchas terapias son probadas en la función eréctil de ratas envejecidas. Como hemos introducido anteriormente, la prueba de grabación de ICP podría usarse para di...

Discusión

Como una medida directa de la función eréctil, el ICP es un método fiable¹⁴. Permite la adquisición de los datos en basal ICP, pico ICP, ICP, tiempo al tiempo de erección y detumescencia, duración de la respuesta, etceterade la meseta. Además de estas directas parámetros medidos, hay algunos otros parámetros de índice: (1) "T80", el tiempo para alcanzar el 80% del pico de ICP; (2) "D20", el tiempo para disminuir al 20% del pico de ICP; (3) "ΔT80", la tasa de aumento en la presi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 2-3 month
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 15-18 month
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Saline	Sigma-Aldrich, S7653		dissolve 8.5 gram sodium chloride in distilled water
Pentobarbital sodium solution	Sigma-Aldrich, P3761		dissolve 1 gram in 100 ml saline
Povidone-iodine	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
Ethanol	China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM)		70% (V/V)
Heparin	Sigma-Aldrich, H3149		dissolve 20000U heparin in 100 ml saline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hypodermic needle	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	23G
Syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	10 ml
Three-way stopcock	Chengdu Instrument factory	TSK 01
Electrode	Chengdu Instrument factory	JST-1
Catheter tube	Chengdu Instrument factory	PE-10, PE-50
Operating scissors	Shanghai operation equipment factory	J22010, J22020
Ophthalmic operating scissors	Shanghai operation equipment factory	Y00010, Y00020
Ophthalmic forceps	Shanghai operation equipment factory	JD1010, JD1020
MicroScissors	World Precision Instruments	WAA260
silk suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	5-0
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stimulator	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		15 Hz, 5 ms pulse, 5 V, 60 s duration and 5 minutes interval
Multichannel signal collection processing system	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		Blood pressure model
Pressure transducer	Beijing Xin Hang Xing Ye Technology Trading Company Limited (model YP100)		40KPa