Intracavernosal Druck Aufnahme, erektile Funktion bei Nagetieren zu bewerten

Zusammenfassung

Intracavernosal ist Druck (ICP) eine wichtige Methode, die erektile Funktion von Versuchstieren zu bewerten. Hier wird ein detailliertes Protokoll für den Aufnahmevorgang ICP durch Katheterisierung des Schenkel Penis und dann elektrisch stimuliert die kavernösen Nerven bei Ratten gezeigt.

Zusammenfassung

Erektiler Dysfunktion (ED) ist definiert als die Unfähigkeit, zu erreichen oder halten einer Erektion des Penis, und dies ist eine überwiegend männliche sexuelle Störung geworden. Nagetiere sind viele Studien beschäftigt, die Physiologie/Pathologie der erektilen Funktion zu erforschen. Erektilen Funktion bei Nagern kann durch Messung des Intracavernosal Drucks (ICP) ausgewertet werden. In der Praxis kann ICP nach elektrische Stimulation der höhlenartigen Nerven (ZNS) überwacht werden. Der arterielle Druck der Halsschlagader (der mittlere arterielle Druck) dient als Referenz für ICP. ICP Aufnahme Protokolle verwenden, können viele wichtige Parameter der erektilen Funktion aus der ICP-Response-Kurve gemessen werden. Die ICP-Messung bietet mehr Informationen als der Apomorphin-induzierten Erektion des Penis-Test und ist billiger als die telemetrische Überwachung des Corpus cavernosum Penis, so dass diese Methode die beliebteste erektile Funktion auswerten. Jedoch erfordern im Vergleich zu den leicht durchgeführt APO-induzierte erektile Funktionstest, erfolgreiche ICP Aufnahmen Aufmerksamkeit zum Detail, Praxis und Einhaltung der Operationsmethode. In dieser Arbeit erfolgt eine Einführung in die ICP-Aufnahme bei Ratten das Verfahren effizient ergänzen.

Einleitung

ED ist definiert als die Unfähigkeit, zu erreichen oder halten einer Erektion des Penis und eine gemeinsame männliche sexuelle Störung¹geworden. Versuchstiere dienen und liefern reproduzierbare Modelle um erektile Funktion²zu untersuchen. Für eine lange Zeit sind mehrere größere Tiermodellen eingesetzt worden, für die Untersuchung von erektilen Funktion^3,4,5. Obwohl Nagetiere im Vergleich zu anderen Tieren relativ klein sind, dienen sie auch für die Untersuchung der männlichen erektilen Dysfunktion aufgrund mehrere Vorteile⁶ausstellen. Erstens sind die morphologischen und funktionellen Geschlechtsmerkmale des Menschen bei Nagetieren zusammengefaßt. Zweitens sind im Vergleich zu größeren Tieren in ED Studien verwendet, Nagetiere günstiger zu kaufen, Haus, und zu pflegen. Drittens: gentechnisch veränderte Nager-Modelle bieten Vorteile in reproduzierbar und spätere Verhaltensstörungen sowie Neurophysiologische Studien. Nagetiere sind daher schnell die primäre Versuchstiere in der Studie von erektiler Dysfunktion geworden.

Profitiert von einer rein genetischen Hintergrund und konsequente Kulturbedingungen und haben Nager-Modelle konstant reproduzierbare Daten^5,6,7,8bereitgestellt. Unter den zahlreichen verfügbaren Studien in Bezug auf viele Aspekte der erektilen Funktionen, Apomorphin (APO)-induzierte erektile Reaktion Test und der Elektro-Stimulation-induzierten ICP-Response-Test sind die am häufigsten verwendeten Methoden, die zuverlässig erektile reflektieren Funktion^9,10,11,12. Die APO-induzierte erektile Funktionstest, entwickelt von Heaton Et al. ¹³, ist ein Bio-Assay, der nutzt das Phänomen, dass die Verabreichung von Apomorphin Ratten Erektionen und Gähnen entlockt. Als eine einfache, nicht-invasive und stabile Bio-Assay, erektile Funktion zu bewerten ist die APO-induzierte erektile Funktionstest in vielen Studien verbreitet. Dieser Assay spiegelt jedoch nicht ausreichend die Qualität der Erektionen oder die dynamischen Veränderungen des Blutflusses eine erektile Reaktion¹⁴zugeordnet. ICP-Messungen wurden zunächst von Quinlan Et Al. entwickelt. ¹⁵. bei diesem Verfahren wird ein Katheter gelegt, in der Arteria carotis, systemischen Blutdruck zu messen, und einem anderen Katheter wird in die Schwellkörper Crus aufnehmen der ICP eingefügt. Vor oder während der ICP Aufnahme, eine vasoaktive Agent und/oder des elektrischen Feldes Stimulation der großen Becken Ganglion (MPG) oder CN waren häufig gegeben, um die Ratten-¹⁴. Dieser Test wurde ein zuverlässiges Tool zur Bewertung der Therapien und Medikamente für ED und wird wahrscheinlich als eine wichtige Bewertungsmethode in den zukünftigen⁶verwendet werden.

Im Vergleich zu den leicht durchgeführt APO-induzierte erektile Funktionstest, erfordern erfolgreiche ICP Aufnahmen Aufmerksamkeit zum Detail, Praxis und Einhaltung der Operationsmethode. Deshalb bieten wir hier eine detaillierte Beschreibung wie ICP Aufnahme durchzuführen.

Protokoll

Drei-Monate-alten und 18-Monate-alten Sprague-Dawley Ratten wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Alle Tiere wurden entsprechend der NIH-Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren bearbeitet. Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden stimmten die lokalen institutionellen Animal Care und Ethik-Kommission, mit dem Bemühen, das Leiden der Tiere zu minimieren. Die Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der technischen Universität Nanjing (Nanjing, China) genehmigt.

Die Ratten wurden in zwei Gruppen entsprechend ihrem Alter und vorläufige Leistung in der APO-induzierte erektile Funktionstest vor der ICP Aufnahme unterteilt: die junge normalen Gruppe (YN) und Alter erektile Dysfunktion Gruppe (AE-Gruppe)¹⁰.

1. Vorbereitung vor der Operation

1. Manuell machen Sie ein paar bipolare Elektroden für die ICP-Aufnahme (Abbildung 1). Leicht biegen Sie die Enden der Elektroden, und stellen Sie den Abstand zwischen zwei Elektroden auf 1-2 mm breit, wie in Figur 1Adargestellt.
2. Schließen Sie die Elektroden an den Stimulator mit Krokodil-Klemmen (Abb. 1AB).
3. Bauen die Kathetersystem: Erstens schließen Sie eine subkutane 23G-Nadel an ein 3-Wege-Ventil mit Schlauch an, dann schließen Sie den Absperrhahn an der Drucksensor. Als nächstes befestigen Sie eine 10-mL-Spritze die dritte Ende des Absperrhahn zu Heparin Kochsalzlösung.
4. Nach dem Befüllen des Gesamtsystems mit Heparin Kochsalzlösung (200 U/mL) auf Dichtheit überprüfen. Drehen Sie dann die 3-Wege-Hahn abschließend die Spritze oder Druck-Wandler Kanal (Abbildung 1).
5. Heben Sie die Nadel 20 cm bis zur Höhe des hölzernen Pad. Kalibrieren Sie den Druck recording-System mit 20 cm H₂O. Danach verschieben Sie die Höhe der Nadel, um die Genauigkeit des Systems der Aufnahme zu überprüfen. Wiederholen Sie die Kalibrierung die Genauigkeit bestätigt wurde.
6. Übertragen Sie die Ratten aus der Tierhaltung auf die OP-Raum, und es ermöglichen Sie ihnen, die OP-Raum für mindestens 30 min gewöhnt.
7. Die autoklaviert Instrumente werden mit 70 % Ethanol kurz vor Operation besprüht.

(2) Chirurgie Verfahren

1. Betäuben Sie die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Natrium-Pentobarbital bei einer Dosis von 45 mg/kg Körpergewicht zu, und warten Sie ca. 5-10 min. Kneifen die Zehen, eine richtige Anesthetization zu bestätigen.
2. Rasieren Sie das Fell des Bauches und des Halses mit einen elektrischen Rasierer zu, und legen Sie die Ratte auf seinem Rücken auf ein Heizkissen.
3. Wischen Sie den OP-Bereich mit 10 % Povidon-Jod-Lösung getränkten Wattebällchen gefolgt von 70 % igem Ethanol getränkten Wattebällchen. Darüber hinaus gelten Sie ophthalmologischen Salbe um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
4. Katheterisierung der linken Halsschlagader.
   1. Die Haut des Halses mit der Zange fassen und einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Halses zu machen. Einschneiden der Muskeln, sorgfältig aussetzen der linken Halsschlagader und einen 5-mm-Abschnitt des Schiffes zu isolieren.
   2. Sorgfältig trennen Sie die Halsschlagader vom Nervus Vagus mit Pinzette, zeichnen Sie eine Seide Naht unter der Arteria carotis und kaudalen Ende des Schiffes anziehen Sie eine lose Krawatte, dann machen Sie einen anderen festen Knoten am kranialen Ende des Schiffes zu.
   3. Kaudal Klemmen Sie das Schiff mit einer Bulldogge Klammer über die Naht um den Blutfluss zu stoppen.
   4. Vorsichtig machen Sie einen Einschnitt auf dem Schiff mit mikrochirurgischen Schere, und legen Sie die arteriellen Katheter zum Herzen hin mit Hilfe von Mikro-sezieren Haken und Zange.
   5. Befestigen Sie die losen kaudalen Ligatur um den Katheter zu sichern. Entfernen Sie die Bulldog-Klemme um den Blutfluss wiederherzustellen.
5. Isolieren der CN und platzieren Sie die Elektroden
   1. Heben Sie die Haut und Muskeln des Bauches mit einer Zange. Durchschneiden Sie mit der sezierenden Schere das unterere Abdomen in den Penis, einen Mittellinie Schnitt zu machen.
   2. Schieben Sie den Darm mit Wattestäbchen in den oberen Teil der Bauchhöhle.
   3. Die Blase mit einer Zange fassen und Herausziehen der Blase aus der Bauchhöhle. Setzen Sie die ventralen Lappen der Prostata, die auf dem ventralen Teil der Harnröhre liegt.
   4. Ziehen Sie die ventralen Lappen der Prostata, Samenblase und Samenleiter, den dorsalen Lappen der Prostata verfügbar zu machen. Suchen Sie die Haftung der Samenleiter und Prostata.
   5. Trennen Sie den Abstand zwischen der Prostata und der Samenleiter. Setzen Sie sorgfältig die fibröse Kapsel, die nach der Verknüpfungspunkt der Prostata und Samenleiter befindet. Dann finden Sie die großen Becken Ganglion (Abbildung 2).
      Hinweis: Die großen Becken Ganglion und höhlenartigen Nerven können an der Oberfläche der Prostata eingesehen werden.
   6. Trocknen Sie sorgfältig CN Bereich mit einem sterilen Tupfer. Sorgfältig zu isolieren Sie und Haken Sie rechts kavernösen Nerven mit den bipolaren Elektroden.
6. Katheterisierung der linke Schenkel
   1. Einen kleinen Schnitt in die Haut des Penis mit sezierenden Schere geschnitten, und dann vorsichtig die Haut von den Penisschaft entblößen.
   2. Sezieren der quergestreiften Muskulatur des Penis. Der obere Zweig der Pubis Knochen zu finden.
   3. Aussetzen des Bulbospongiosus Muskels, umfasst die spongiöse Birne.
   4. Teilen Sie die Bulbospongiosus Muskel vom Ischiocavernosus Muskel durch mit gebogenen Pinzette.
   5. Isolieren Sie Ischiocavernosus Muskel mit gebogenen Pinzette sorgfältig zu, und dann schneiden Sie Ischiocavernosus Muskel, der weiße Tunica Albuginea der Crus Corpus Cavernosum aussetzen.
   6. Stechen Sie nach der anatomischen Richtung der Crus Corpus Cavernosum die Nadel vorsichtig in die Crus Schwellkörper durch den weißen Tunica Albuginea.
      Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt zur erfolgreichen Katheterisierung. Eine kleine Menge von heparinisierten Kochsalzlösung injiziert werden kann, und eine leichte penile Tumeszenz sollten beachtet werden, wenn die Nadel richtig eingelegt wurde.
   7. Sorgfältig lösen Sie die Nadel und vermeiden Sie jede gleiten die Nadel oder Unterbrechung der Verbindungsschlauch. Auf Undichtigkeiten prüfen.

(3) stimulieren Sie die CN

1. Öffnen Sie das Softwareprogramm für Druck Signalaufzeichnung und starten Sie die Druck-Signal-Aufnahme.
2. Legen Sie die Parameter der Stimulation: 15 Hertz, Pulsbreite von 5 Millisekunden, 5 Volt und eine 60 s Dauer. Stimulieren Sie kN bei einer Frequenz von 15 Hz mit einer Pulsbreite von 5 ms.
   Hinweis: Ein starken Anstieg des ICP kann beobachtet werden, während der Anwendung der elektrischen Stimulation.
3. Eine 30-minütige Ruhepause zwischen Stimulationen zu ermöglichen. Das Maximum der aufeinander folgenden Stimulation in jedes Tier ist dreimal.

(4) das Verfahren beenden

1. Verwalten Sie nach der Aufnahme Euthanasie durch die Injektion von einer Überdosis von Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 150 mg/kg Körpergewicht. Bestätigen Sie den Tod von Ratten, durch die Überprüfung ihrer arteriellen Drucks. Die Ratten, und reinigen Sie die Chirurgie-Tools.

(5) Datenanalyse

1. Speichern und Exportieren der Daten aus der Software. Die Antwort wird gemeinhin als das Verhältnis von ICP zu systemischen arteriellen Mitteldruck (MAP) dargestellt. Das Verhältnis von Peak ICP/MAP wurde berechnet, um die erektile Funktion bewerten.
2. Pool-Daten von mindestens fünf Ratten und analysieren mit Statistiksoftware. Unterschiede sind statistisch signifikant angesehen, wenn p < 0,05, mit der Student t-Test.

Ergebnisse

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Erektionsstörungen im Alter Männchen ist immer ein weit verbreitetes Problem. Medizinischer Behandlung ist jedoch bei der Verwaltung der alterungsbedingte ED¹⁶begrenzt. In Nager-Modelle der alterungsbedingte ED werden viele Therapien auf die erektile Funktion des gealterten Ratten getestet. Wie wir oben eingeführt haben, könnte der ICP-Aufnahme-Test verwendet werden, unterscheiden die ED-Tiere von der Gesamtbevölkerung vo...

Diskussion

ICP ist ein direktes Maß der erektilen Funktion eine zuverlässige Methode¹⁴. Es ermöglicht die Erfassung von Daten auf basale ICP, ICP, Spitze plateau, ICP, Erektion und Abschwellung gelegentlich, Dauer der Reaktion, etc.. Neben diesen gemessenen Parameter direkten, gibt es einige andere Indexparameter: (1) "T80", die Zeit zu 80 % des Peak ICP; (2) "D20", die Zeit auf 20 % des Peak ICP zu verringern; (3) "ΔT80", die Rate der Zunahme des Drucks (pro Sekunde) bei T80; und (4) "ΔD20", d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 2-3 month
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 15-18 month
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Saline	Sigma-Aldrich, S7653		dissolve 8.5 gram sodium chloride in distilled water
Pentobarbital sodium solution	Sigma-Aldrich, P3761		dissolve 1 gram in 100 ml saline
Povidone-iodine	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
Ethanol	China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM)		70% (V/V)
Heparin	Sigma-Aldrich, H3149		dissolve 20000U heparin in 100 ml saline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hypodermic needle	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	23G
Syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	10 ml
Three-way stopcock	Chengdu Instrument factory	TSK 01
Electrode	Chengdu Instrument factory	JST-1
Catheter tube	Chengdu Instrument factory	PE-10, PE-50
Operating scissors	Shanghai operation equipment factory	J22010, J22020
Ophthalmic operating scissors	Shanghai operation equipment factory	Y00010, Y00020
Ophthalmic forceps	Shanghai operation equipment factory	JD1010, JD1020
MicroScissors	World Precision Instruments	WAA260
silk suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	5-0
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stimulator	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		15 Hz, 5 ms pulse, 5 V, 60 s duration and 5 minutes interval
Multichannel signal collection processing system	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		Blood pressure model
Pressure transducer	Beijing Xin Hang Xing Ye Technology Trading Company Limited (model YP100)		40KPa