Registrazione di pressione intracavernosa per valutare la funzione erettile in roditori

Riepilogo

Registrazione di pressione intracavernosa (ICP) è un metodo importante per valutare la funzione erettile di animali da esperimento. Qui, un protocollo dettagliato è dimostrato per la procedura di registrazione di ICP cateterismo pene crura e quindi elettricamente stimolando i nervi cavernosi in ratti.

Abstract

La disfunzione erettile (de) è definita come l'incapacità di raggiungere o mantenere un'erezione del pene, e questo è diventato un disturbo sessuale maschile prevalente. Roditori sono impiegati da molti studi per ricercare la fisiologia/patologia della funzione erettile. La funzione erettile in roditori può essere valutata misurando la pressione intracavernosa (ICP). In pratica, può essere monitorato ICP dopo stimolazione elettrica dei nervi cavernosi (CNs). La pressione arteriosa dell'arteria carotica (la pressione arteriosa media) è utilizzata come riferimento per ICP. Utilizzando protocolli di registrazione ICP, molti parametri chiave della funzione erettile possono essere misurati dalla curva di risposta di ICP. La misurazione di ICP fornisce ulteriori informazioni rispetto al test di indotto da apomorfina l'erezione del pene ed è più conveniente di monitoraggio telemetrico del corpo spugnoso del pene, rendendo questo metodo quello più popolare per valutare la funzione erettile. Tuttavia, rispetto alla prova effettuata facilmente la funzione erettile indotta da APO, registrazioni di ICP successo richiedono attenzione al dettaglio, la pratica e l'aderenza al metodo dell'operazione. In questo lavoro, un'introduzione alla registrazione di ICP in ratti è fornita per integrare la procedura in modo efficiente.

Introduzione

ED è definito come l'incapacità di raggiungere o mantenere un'erezione ed è diventato un comune disturbo sessuale maschile¹. Animali da esperimento sono utilizzati e forniscono modelli riproducibili per studiare la funzione erettile². Per lungo tempo, diversi modelli di animali più grandi sono state impiegate per indagare la funzione erettile^3,4,5. Anche se i roditori sono relativamente piccoli rispetto agli altri animali, sono utilizzati anche per lo studio della disfunzione erettile maschile a causa di esporre diversi vantaggi⁶. In primo luogo, le caratteristiche morfologiche e funzionali sessuali degli esseri umani sono ricapitolate in roditori. In secondo luogo, rispetto agli animali più grandi utilizzati negli studi di ED, roditori sono più economiche da acquistare, casa e mantenere. Modelli di roditori geneticamente modificati, terzi forniscono vantaggi negli studi comportamentali, nonché neurofisiologici riproducibili e successivi. Di conseguenza, roditori sono rapidamente diventate primarie animali utilizzati per lo studio della disfunzione erettile maschile.

Beneficiando di una priorità bassa genetica pura e coerente della cultura, modelli del roditore hanno fornito dati costantemente riproducibile^5,6,7,8. Tra i numerosi studi disponibili relazionati a molti aspetti delle funzioni erettili, l'apomorfina (APO)-risposta erettile indotta e il test di risposta ICP indotto da stimolazione elettrica sono i metodi più diffusi che riflettano fedelmente erettile funzione^9,10,11,12. Il test di funzione erettile indotta da APO, sviluppato da Heaton et al. ¹³, è un saggio biologico che utilizza il fenomeno che l'amministrazione di apomorfina ai ratti suscita erezioni e sbadigli. Come un semplice, non invadente e stabile bio-test per valutare la funzione erettile, il test di funzione erettile indotta da APO è ampiamente usato in molti studi. Tuttavia, questo test non riflette adeguatamente la qualità delle erezioni o i cambiamenti dinamici nel flusso sanguigno connesso con una risposta erettile¹⁴. Misurazioni di ICP sono stati inizialmente sviluppati da Quinlan et al. ¹⁵. in questo metodo, un catetere viene inserito nell'arteria carotica per misurare la pressione arteriosa sistemica, e un altro catetere viene inserito nel cru cavernosi per registrare l'ICP. Prima o durante l'ICP di registrazione, un agente vasoattivo e/o il campo elettrico stimolazione del ganglio pelvico principale (MPG) o CN erano spesso dato ai ratti¹⁴. Questo test è stato uno strumento affidabile per valutare le terapie e farmaci per la disfunzione erettile e sarà probabilmente utilizzato come un metodo di valutazione vitale in futuro⁶.

Rispetto alla prova effettuata facilmente la funzione erettile indotta da APO, registrazioni di ICP successo richiedono attenzione al dettaglio, la pratica e l'aderenza al metodo dell'operazione. Pertanto, qui, forniamo una descrizione dettagliata di come eseguire la registrazione ICP.

Protocollo

Three-month-old e 18 mese-vecchi ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati nello studio presente. Tutti gli animali sono stati gestiti in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di etica e locali istituzionali Animal Care con uno sforzo per ridurre al minimo la sofferenza animale. I protocolli sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all'Università di tecnologia di Nanchino (Nanjing, Cina).

I ratti sono stati divisi in due gruppi secondo la loro età e preliminari delle prestazioni nel test di funzione erettile indotta da APO prima della registrazione ICP: il giovane normale (YN gruppo) e la disfunzione erettile invecchiato gruppo (Gruppo AE)¹⁰.

1. preparazione prima dell'intervento chirurgico

1. Creare manualmente un paio di elettrodi bipolari per la registrazione di ICP (Figura 1). Leggermente piegare le estremità degli elettrodi e regolare la distanza tra due elettrodi a 1-2 mm di larghezza, come mostrato in Figura 1A.
2. Collegare gli elettrodi all'elettrostimolatore utilizzando due pinze coccodrillo (Figura 1AB).
3. Assemblaggio del sistema di catetere: In primo luogo, collegare un ago ipodermico di 23G per un rubinetto a 3 vie con tubi, quindi collegare il rubinetto al trasduttore di pressione. Successivamente, collegare una siringa 10 mL alla fine terza del rubinetto per fornire soluzione fisiologica dell'eparina.
4. Controllare attentamente per individuare perdite dopo aver riempito l'intero sistema con soluzione fisiologica dell'eparina (200 U/mL). Poi girare il rubinetto a 3 vie per chiudere il canale di siringa o il canale di trasduttore di pressione (Figura 1).
5. Sollevare l'ago 20 cm il livello del pad in legno. Quindi calibrare la pressione registrazione sistema a 20 cm H₂O. Dopo di che, è necessario spostare l'altezza dell'ago per verificare l'accuratezza del sistema di registrazione. Ripetere la calibrazione fino a quando la precisione è stata confermata.
6. Trasferire i ratti dalla struttura animale per sala operatoria e consentire loro di abituarsi alla sala operatoria per almeno 30 min.
7. Gli strumenti in autoclave vengono spruzzati con etanolo al 70% appena prima dell'intervento chirurgico

2. chirurgia procedura

1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital ad una dose di 45 mg/kg di peso corporeo e aspettare per 5-10 min pizzicare le dita dei piedi per confermare un corretto amputate.
2. Radere il pelo dell'addome e del collo con un rasoio elettrico e posizionare il ratto sul dorso su un rilievo di riscaldamento.
3. Pulire l'area di chirurgia con batuffoli di cotone imbevuti di soluzione povidone-iodio 10% seguite da batuffoli di cotone imbevuto di etanolo al 70%. Inoltre, applicare unguento oftalmico per evitare che gli occhi secchi.
4. Cateterismo dell'arteria carotide sinistra.
   1. Afferrare la pelle del collo con la pinzetta e fare un'incisione orizzontale al centro del collo. Incidere i muscoli, attentamente esporre l'arteria carotide sinistra e isolare una sezione di 5 mm della nave.
   2. Attentamente separare l'arteria carotica dal nervo vago usando il forcipe, disegnare una sutura seta sotto l'arteria carotica e mettere una cravatta allentata all'estremità caudale della nave, poi fare un altro nodo stretto all'estremità cranica della nave.
   3. Caudalmente morsetto il vaso con un bulldog morsetto sopra la sutura per fermare il flusso di sangue.
   4. Attentamente fare un'incisione sulla nave con le forbici microsurgical e inserire il catetere arterioso verso il cuore con l'assistenza del gancio e forcipe micro-dissezione.
   5. Fissare la legatura caudale sciolta intorno al catetere per fissarlo. Rimuovere il morsetto del bulldog per ripristinare il flusso sanguigno.
5. Isolare il CN e posizionare l'elettrodo
   1. Sollevare la pelle e i muscoli dell'addome con un paio di pinze. Con le forbici per dissezione, tagliare attraverso l'addome inferiore al pene per fare un'incisione del midline.
   2. Spingere delicatamente l'intestino con tampone nella parte superiore della cavità addominale.
   3. Afferrare la vescica con un paio di pinze e tirare fuori la vescica dalla cavità addominale. Esporre i lobi ventrali della prostata, che si trova sulla parte ventrale dell'uretra.
   4. Tirare fuori i lobi ventrali della prostata, delle vescicole seminali e deferenti per esporre il lobo dorsale della prostata. Trovare il punto di aderenza dei deferenti e prostata.
   5. Separare lo spazio tra la prostata e il dotto deferente. Esporre con cautela la capsula fibrosa, che è posizionata dietro il punto di giunzione della prostata e del dotto deferente. Poi trovare il ganglio pelvico principale (Figura 2).
      Nota: Le principale ganglio pelvico e nervi cavernosi possono essere visto alla superficie della prostata.
   6. Asciugare accuratamente la zona CN con un tampone sterile. Con attenzione isolare e agganciare il nervo cavernoso di destra con gli elettrodi bipolari.
6. Cateterismo la sinistra Crura
   1. Tagliare una piccola incisione nella pelle del pene con le forbici per dissezione e poi accuratamente denudare la pelle del fusto del pene.
   2. Sezionare la muscolatura del pene striata. Trovare il ramo superiore dell'osso del pube.
   3. Esporre il muscolo bulbospongiosus, che copre il bulbo spongioso.
   4. Dividere il muscolo bulbospongiosus dal muscolo ischiocavernosus usando il forcipe curvo.
   5. Isolare accuratamente il muscolo ischiocavernosus con pinzetta e poi tagliare il muscolo ischiocavernosus per esporre la bianca tunica albuginea la crus del cavernosum del corpus.
   6. Seguendo la direzione anatomica la crus del cavernosum del corpus, attentamente inserire l'ago nel cru cavernosi attraverso l'albuginea di tunica bianca.
      Nota: Questo è un passo cruciale per cateterizzazione successo. Può essere iniettata una piccola quantità di soluzione fisiologica eparinizzata, e un lieve tumescence penile dovrebbe essere osservato, se l'ago è stato inserito correttamente.
   7. Attentamente rimuovere l'ago ed evitare qualsiasi scorrevole dell'ago o la rottura del tubo di raccordo. Controllare eventuali perdite.

3. stimolare il CN

1. Aprire il programma software per la registrazione del segnale di pressione e avviare la registrazione del segnale di pressione.
2. Impostare i parametri della stimolazione: 15 Hertz, larghezza di impulso di 5 millisecondi, 5 volt e una durata di 60 s. Stimolare CN a una frequenza di 15 Hz con una larghezza di impulso di 5 ms.
   Nota: Un forte aumento dell'ICP può essere osservato mentre applicando la stimolazione elettrica.
3. Consentire un intervallo di 30 minuti di riposo tra stimolazioni. Il massimo della stimolazione consecutivo di ogni animale è tre volte.

4. terminare la procedura

1. Dopo la registrazione, è possibile amministrare l'eutanasia iniettando una dose eccessiva di sodio pentobarbital ad una dose di 150 mg/kg di peso corporeo. Confermare la morte dei ratti di controllo della loro pressione arteriosa. Rimuovere i ratti e pulire gli attrezzi di chirurgia.

5. analisi dei dati

1. Salvare ed esportare i dati dal software. La risposta è comunemente espressa come il rapporto tra ICP sistemica pressione arteriosa media (MAP). Il rapporto del picco ICP/mappa era calcolato per valutare la funzione erettile.
2. I dati del pool da almeno cinque ratti e analizzare con software statistico. Le differenze sono considerate statisticamente significative p < 0,05, utilizzando il test t di Student.

Risultati

Numerosi studi hanno dimostrato che la disfunzione erettile in invecchiato maschi sta diventando un problema comune. Tuttavia, il trattamento medico è limitato nella gestione della relazione con l'invecchiamento ED¹⁶. Nei modelli del roditore di relazione con l'invecchiamento ED, molte terapie sono testate sulla funzione erettile dei ratti invecchiati. Quanto abbiamo introdotto sopra, il test di registrazione ICP poteva essere utilizzato per distinguere gli animal...

Discussione

Come una misura diretta della funzione erettile, ICP è un metodo affidabile di¹⁴. Permette l'acquisizione di dati su basale ICP, ICP, picco del plateau ICP, tempo per tempo di erezione e detumescenza, durata della risposta, ecc. Oltre a questi diretti parametri misurati, ci sono alcuni altri parametri di indice: (1) "T80", il tempo per raggiungere l'80% del picco ICP; (2) "D20", il tempo per ridurre al 20% del picco ICP; (3) "ΔT80", il tasso di aumento della pressione (al secondo) a T80...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 2-3 month
Rats			Strain: Sprague-Dawley Age: 15-18 month
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Saline	Sigma-Aldrich, S7653		dissolve 8.5 gram sodium chloride in distilled water
Pentobarbital sodium solution	Sigma-Aldrich, P3761		dissolve 1 gram in 100 ml saline
Povidone-iodine	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
Ethanol	China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM)		70% (V/V)
Heparin	Sigma-Aldrich, H3149		dissolve 20000U heparin in 100 ml saline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hypodermic needle	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	23G
Syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	10 ml
Three-way stopcock	Chengdu Instrument factory	TSK 01
Electrode	Chengdu Instrument factory	JST-1
Catheter tube	Chengdu Instrument factory	PE-10, PE-50
Operating scissors	Shanghai operation equipment factory	J22010, J22020
Ophthalmic operating scissors	Shanghai operation equipment factory	Y00010, Y00020
Ophthalmic forceps	Shanghai operation equipment factory	JD1010, JD1020
MicroScissors	World Precision Instruments	WAA260
silk suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	5-0
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stimulator	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		15 Hz, 5 ms pulse, 5 V, 60 s duration and 5 minutes interval
Multichannel signal collection processing system	Nanjing medease science and technology co. ltd (model 4C501H)		Blood pressure model
Pressure transducer	Beijing Xin Hang Xing Ye Technology Trading Company Limited (model YP100)		40KPa