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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Hemos diseñado un sensor de 16 canales de EEG de tipo seco que es no invasivo, deformable y reutilizables. Este papel describe todo el proceso de fabricación el electrodo EEG propuesto para procesamiento de potenciales evocados visuales (VEP) de señales señales medido en un cuero cabelludo de ratón utilizando un seco sensor de EEG no invasivo de multicanal.

Resumen

Para entornos de investigación del cuero cabelludo EEG con ratones de laboratorio, se diseñó un tipo seco 16 canales EEG sensor no invasivo, deformable y reutilizables debido a la faceta estructural émbolo resorte de barril y fuerzas mecánicas resultantes de metal materiales. Todo el proceso para adquirir el VEP respuestas en vivo de un ratón consta de cuatro pasos: montaje del sensor (1), preparación (2) animal, (3) VEP medición y procesamiento de señales (4). Este papel presenta mediciones representativas de las respuestas de la VEP de varios ratones con una resolución de la señal de voltaje submicro y resolución temporal de milisegundos el cien. Aunque el método propuesto es más seguro y más conveniente en comparación con otros divulgados previamente animal métodos de adquisición de EEG, se quedan temas como cómo mejorar la relación señal a ruido y cómo aplicar esta técnica con animales en libre movimiento. El método propuesto utiliza recursos fácilmente disponibles y muestra una respuesta repetitiva del VEP con una calidad de señal satisfactoria. Por lo tanto, este método podría utilizarse para estudios experimentales longitudinales y confiable investigación traslacional explotando paradigmas no invasivo.

Introducción

Como el número de pacientes con enfermedades seniles degenerativas como demencia, Alzheimer, síndromes parkinsonianos y tiempos han aumentado con un envejecimiento de la población y una creciente esperanza de vida, la carga social a largo plazo de estas enfermedades ha también aumentó1,2,3. Además, enfermedades del neurodesarrollo más, como la esquizofrenia y el autismo, se acompañan de trastornos cognitivos y conductuales que afectan toda la vida de2,3,4 de un paciente. Por esta razón, los investigadores han estado luchando para mejorar el diagnóstico, prevención, comprensión patológica, observación de largo plazo y tratamiento de enfermedades del cerebro. Sin embargo, siguen existiendo problemas derivados de la complejidad del cerebro y las patologías de enfermedad no revelada. Investigación traslacional puede ser una herramienta prometedora para la identificación de soluciones ya que permite a la transferencia de la investigación básica a aplicaciones clínicas dentro de un marco de tiempo más corto, a un costo menor y con una tasa de éxito superior en Neurociencia campos5 ,6,7. Otro de los objetivos de la investigación traslacional es examinar la aplicabilidad en seres humanos, que requiere no invasivos abordajes experimentales en animales que permiten las comparaciones con el mismo método para los seres humanos. Estas condiciones han llevado a varias necesidades importantes para el desarrollo de métodos de preparación de animales no invasivo. Un método es la electroencefalografía (EEG), que revela la conectividad cortical cerebral y actividad representan con alta resolución temporal, y que se beneficia de un protocolo no invasivo. La grabación de potenciales relacionados con eventos (ERP) es uno de los paradigmas experimentales típicos que utilizan el EEG.

Se han utilizado numerosos anteriores estudios empleados métodos no invasivos EEG para dirigir temas de los seres humanos, mientras que los métodos invasivos, tales como implantes de tornillos y electrodos de tipo poste, en estudios con animales8,9,10 , 11 , 12. la calidad de la señal y las características de estos métodos dependen significativamente la invasividad de la colocación del sensor. Exitosa investigación traslacional, Garner destacó con las mismas condiciones para los estudios en animales como los utilizados para la investigación en humanos13. Sin embargo, para la investigación básica con animales, metodologías de EEG no invasivo no son frecuentes. Un nuevo enfoque utilizando un sistema de sensores no invasivos del cuero cabelludo EEG centrándose en ratones de laboratorio sería una herramienta confiable y eficiente para la investigación traslacional que se puede aplicar a los paradigmas no invasivo para los seres humanos, también.

Numerosos estudios de EEG del ratón condujeron la manera de comercialización de PCB (placa de circuito impreso) basado en electrodos multicanal14,15,16. Aunque adoptaron un método invasivo, tenían un número limitado de canales (3-8), que hizo más difícil observar dinámica cerebral a gran escala. Además, aplicaciones pueden ser restringidas por su invasividad y alto costo. En otro estudio de investigación, el KIST (Instituto Coreano de ciencia y tecnología) desarrolló un electrodo de película delgada basadas en poliamida de 40 canal y conectado a cráneo17,18,19,20 de un ratón . Este trabajo adquirió el mayor número de canales de EEG del ratón. Era, sin embargo, mecánicamente débil y no es fácil reutilizar; por lo tanto, era inadecuado para las observaciones a largo plazo, a una señal débil, posiblemente causada por una reacción inmune. Mientras tanto, Troncoso y Mégevand adquieren un potencial evocado sensorial (SEP) en cráneos de roedores con treinta y dos electrodos de acero inoxidable garantizados por un Poly(methyl methacrylate) (PMMA, vidrio acrílico) perforada red21,22 , 23. a pesar de su calidad de señal de alto, los electrodos fueron mecánicamente flexible y tierna; por lo tanto, tenía dificultades para ser aplicadas a múltiples experimentos. Además, este método era todavía mínimamente invasiva. Aunque estos métodos proporcionan la calidad de señal buena, la superficie del cráneo de un ratón es limitada, por lo tanto el número de electrodos es restringido usando un electrodo de acero inoxidable de tipo polo. Un número de estudios EEG previos para los ratones mostraron varias limitaciones. En este estudio, mostramos un nuevo método para la medición de EEG aplicable en investigación traslacional preclínica usando un sensor no invasivo de multicanal de tipo seco.

Con el fin de superar las limitaciones del anterior animal metodologías de EEG, que incluyó a la intrínseca complejidad de preparación animal, invasividad, alto costo, desperdicio y débil resistencia mecánica, se intentó desarrollar un nuevo electrodo que exhibe flexibilidad, tipo seco estado, capacidades multicanales, no invasividad y reutilización. En el siguiente protocolo, describimos el proceso de medición grabaciones de (VEP) potenciales evocadas visuales en un cuero cabelludo de ratón utilizando un sensor seco, no invasivo, varios canales de EEG. Este método utiliza recursos fácilmente disponibles, por lo tanto reducir la barrera a la entrada en animal de experimentación en el campo de la ingeniería biomédica.

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Protocolo

Manejo y cuidado de los animales siguieron la pauta institucional del Instituto de Gwangju de la ciencia y tecnología (GIST).

Nota: El procedimiento para la adquisición de la señal de VEP de un ratón en vivo consta de cuatro pasos: montaje del sensor (1), preparación (2) animal, (3) VEP medición y procesamiento de señales (4).

1. montaje del sensor

  1. Preparar dieciséis pernos para un electrodo no-invasivo.
    Nota: Cada electrodo tipo pin consta de tres partes: un émbolo cabeza de sonda, un resorte interno y un barril como se muestra en la Figura 1a. La longitud de cada perno es 13 mm y la longitud de precarga de muelle ajustable es de 1 mm.
  2. Cortar dos piezas de sustratos de fibra de vidrio (espesor: 1,5 mm) con el tamaño de 15 x 17 mm (ancho x alto).
    Nota: Las funciones de substrato no conductor de fibra de vidrio como aislante, que separa las múltiples señales simultáneamente adquirieron desde el cuero cabelludo del ratón.
  3. Hace dieciséis agujeros de diámetro 1,2 mm utilizando una máquina de grabado de precisión, como se muestra en la figura 1C.
    1. Extendió la coordinación sonda uniformemente a intervalos de 2 mm en el sustrato plano: + 7 0, + 2 + 2 /-2, 0, + 2 / + 2, 0 /-4, 0 /-2, 0/0 (bregma), 0 / + 2, 0 / + 4, -2-3, -2 /-1, -2 y + 1, -2 y + 3, -4 /-2, -4/0 , -4 / + 2 (anteroposterior, lateral con base de bregma, en mm)24,25,26.
  4. Apilar dos substratos y aplique una gota de pegamento adhesivo de acción rápida entre las capas del substrato, produciendo una doble capa de 3 mm de espesor soporte dieciséis electrodos estables y paralelo durante la adquisición de la señal.
  5. Montar los dieciséis electrodos sobre el substrato uno por uno manualmente.
    Nota: El diámetro de orificio más pequeño detiene cada electrodo en la misma longitud. El diámetro de cada agujero es ligeramente más pequeño que el diámetro más grueso de un barril dentro del solo perno (1,3 mm) que permite la fijación estrecha de electrodos sin ningún aflojamiento.
  6. Soldadura y enlazar parte de soldadura final de cada electrodo en el conector de prueba de toque.
  7. Tapar y ocultar a las uniones desnudas con tubería de encogimiento de calor para el aislamiento eléctrico.

2. animal preparación

  1. Anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamine:xylazine 100:10 (100 mg / mL:10 mg/mL) mezcla con la cantidad de 10 μl/g de peso corporal.
    Nota: Compruebe que la anestesia del animal es adecuada tirando una pata o afinando la cola antes de comenzar la preparación.
  2. Aplicar el ungüento oftálmico para mantener húmedo con un hisopo de algodón la córnea de ratón.
  3. Quitar los pelos alrededor de la cabeza y los hombros con un cortapelos, extender crema depilatoria disponible en el mercado y mantenerlo en esta área durante 3-4 minutos.
  4. Retire el depilatorio aplicado con una espátula y luego limpiar el resto con toallitas húmedas aplicando agua varias veces.

3. VEP medición

Nota: Los VEP todo proceso de medición llevó a cabo en una jaula de Faraday oscurezca (ancho x profundidad x altura: 61 × 61 × 60 cm).

  1. Montar la cabeza del ratón sobre el marco estereotáxicas colocando barras de oído en canales de oído del ratón y apretar exactamente en el lugar.
  2. Monte el sensor en el soporte del electrodo a medida (Figura 1b) y fijar el soporte del sensor en el marco estereotáxicas, como se muestra en la Figura 1D.
  3. Localice el sensor flexible de EEG, teniendo en cuenta la posición del electrodo de referencia y la posición de bregma27. Después de eso, baje con cuidado el sensor en la dirección vertical para que los émbolos de electrodo vestida en contacto con el cuero cabelludo del ratón uniformemente sobre el margen curvo.
    Nota: La distancia bajada es menor que 1 mm, que es la longitud ajustable del émbolo.
  4. Compruebe que las impedancias están dentro del rango adecuado de 100 kΩ a MΩ 2. Vuelva a colocar el electrodo cuando cualquier valor de impedancia del perno está fuera de la gama28.
  5. Coloque el aparato de foto ojos de ratón de 20 cm.
  6. Antes de comenzar el experimento, adaptar el ratón durante 10 minutos en la jaula oscura oscura adaptación visual.
    1. Establecer los parámetros de los dispositivos experimentales como sigue: frecuencia de muestreo: 500 Hz; Muesca de filtración: 60 Hz; Intervalo inter-estímulo: 10 s; Duración de Flash: 10 ms; número de estímulos flashes: 100 ensayos/tema.
      Nota: La luz del flash es una luz blanca LED de iluminación que tiene 550 ± 20% lx con una distancia de 20 cm.

4. procedimientos de procesamiento de señales de respuestas VEP

  1. Epoching
    1. Para medir continuamente la serie de datos, extraer cada época para crear solo prueba VEP segmentos del pre-estímulo período (-300 ms) para el período posterior al estímulo (600 m), basados en la aparición del estímulo flash.
      Nota: Puesto que repetidamente nos proporcionan estímulo flash más de 100 ensayos para cada materia, un total de 100 épocas VEP para cada ratón se extraen en este paso. Epoching EEG es un proceso en el que windows de tiempo específicos se extraen de los datos continuamente medidos de la señal de EEG.
  2. Volver a de referencia (media de referencia)
    1. Calcular el promedio de las señales EEG a través de los electrodos catorce canales en cada momento punto y luego restarán el valor promedio de cada canal. Repita este procedimiento para todas las épocas VEP.
  3. Realizar pase de banda filtro de señal de ~ 1-100 Hz con una respuesta de impulso finito (FIR) filtro.
  4. Corrección de línea base
    1. Calcular el promedio de las señales de EEG en el período de estímulo pre (período de referencia, -300 ~ 0 ms) para cada canal, luego restar este promedio desde cada punto en la forma de onda (-300 ~ 600 ms). Ajusta el eje de la amplitud de las respuestas VEP para facilitar la observación de los cambios de la onda cerebral tras la estimulación. Repita este paso para todas las épocas VEP.
  5. Respuestas de gran VEP
    1. Promedio las épocas VEP de prueba solo para crear a solo-tema un promedio de formas de onda de VEP para cada canal. Luego, calcule el promedio de gran conjunto de respuestas VEP para cada canal con respecto a todos los sujetos.

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Resultados

Se calculó la media del conjunto de respuestas VEP de once ratones como se muestra en la figura 2. Este resultado muestra las respuestas VEP obtenidas a través de este experimento desde el período de estimulación previa (-300 ms) para el período posterior al estímulo (600 m), el estímulo se da en el tiempo 0. Es notable que la señal fluctúa sólo por un tiempo (menos de 300 ms) después de la estimulación, mientras que la señal constantemente se es...

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Discusión

En primer lugar nos centramos en el diseño del sensor, priorizando la practicidad reduciendo procedimientos quirúrgicos complejos. El sensor de EEG deformable se compone de dieciséis pines: catorce años de grabación, uno para la tierra y el último para electrodos de referencia. Cada electrodo tiene la estructura de barril de resorte de émbolo, que se aplica la deformabilidad en la superficie de contacto del electrodo, para facilitar la adquisición de señal homogénea y estable desde el cuero cabelludo curvado y ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto de investigación de GIST (GRI), el proyecto de colaboración de investigación esencial-Caltech a través de una beca proporcionada por GIST en el 2017. También el apoyo de beca de investigación (NRF-2016R1A2B4015381) de la Fundación Nacional de investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MEST) y por el programa de investigación básica KBRI a través de Corea cerebro Instituto de investigación financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro Planificación (17-BR-04).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine 50 Inj. (Vial)Yuhan-Ketamine HCl 57.68 mg
Zoletil 50 Inj.Virbac-Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg
Rompun 2% Inj.BAYER-Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL
Hycell solution 2%Samil-Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg
Puralube Vet Ointment 3.5 mgPharmaderm-
Saline solution Inj. JW Pharmaceutical -NaCl 9 g/1000 mL
Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive SkinReckitt Benckiser-depilatory
Skins - Surgical Skin MarkerSurgmedS-3000STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set
Stainless Steel Micro SpatulasHEATHROW SCIENTIFICHS15907 One Round Flat End, 2L x 5/16W"
cotton swap
Stereotaxic, Desktop Digi SingleRWD Life Science68025
Mouse AdapterRWD Life Science68010
Ear Bar for Mouse Non-RuptureRWD Life Science68306
Mitsar-EEG 202-24 MITSARamplifier
EEGStudio EEG acquisition softwareMITSAR
White flash stimulator MITSARMITSAR Flash stimulator
BCI2000 softwareSchalk lab
g.USBampg.tec0216
g.Power-g.USBampg.tec0247
 441 style straight body Touch Proof connectorPlasticsOne441000PSW080001441 - 000 PSW 80" (BLACK)
Standard probeLEENOSK100CSWhttp://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012
Precision engraving machine toolsTINYROBOTinyCNC-6060C
Heat shirink3MFP301

Referencias

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