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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo progettato un sensore di 16 canali EEG a secco-tipo che è invasivo, deformabile e riutilizzabili. Questo articolo descrive l'intero processo di produzione l'elettrodo EEG proposto alla elaborazione del potenziale evocato visivo (VEP) del segnale segnali misurati su un cuoio capelluto del mouse utilizzando un sensore di EEG multicanale non invasiva asciutto.

Abstract

Per ambienti di ricerca di cuoio capelluto EEG con topi di laboratorio, abbiamo progettato un sensore di EEG di 16 canali a secco-tipo che è invasivo, deformabile e riutilizzabili a causa dell'aspetto strutturale stantuffo-primavera-barilotto e resistenze meccaniche risultanti da metallo materiali. L'intero processo di acquisizione il VEP responses in vivo da un mouse è costituito da quattro passaggi: montaggio del sensore (1), la preparazione (2) animali, VEP (3) misura ed elaborazione del segnale (4). Questa carta presenta misurazioni rappresentative delle risposte VEP da più mouse con una risoluzione di segnale submicroniche-tensione e sub-cento risoluzione temporale di millisecondo. Anche se il metodo proposto è più sicuro e più conveniente rispetto ad altri precedentemente segnalati animali metodi incorporante di EEG, ci sono ancora problemi tra cui come migliorare il rapporto segnale-rumore e come applicare questa tecnica con animali liberi di muoversi. Il metodo proposto utilizza risorse facilmente disponibili e Mostra una risposta VEP ripetitiva con una qualità di segnale soddisfacente. Pertanto, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studi sperimentali longitudinali e affidabile ricerca traslazionale sfruttando paradigmi non invasivo.

Introduzione

Come il numero di pazienti con malattie degenerative senili del cervello come demenza, morbo di Alzheimer, sindromi parkinsoniane e ictus sono aumentati con l'invecchiamento della popolazione e una crescente speranza di vita, ha l'onere della società a lungo termine di queste malattie anche aumentato1,2,3. Inoltre, la maggior parte delle malattie dello sviluppo neurologico, come la schizofrenia e l'autismo, sono accompagnati da disturbi cognitivi e comportamentali che interessano tutta la vita di2,3,4 di un paziente. Per questo motivo, i ricercatori hanno lottato per migliorare la diagnosi, prevenzione, comprensione patologica, osservazione a lungo termine e nel trattamento delle malattie del cervello. Tuttavia, i problemi rimangono derivanti dalla complessità del cervello e le patologie di malattia non rivelati. Ricerca traslazionale può essere uno strumento promettente per identificare soluzioni perché consente il trasferimento della ricerca di base alle applicazioni cliniche entro un lasso di tempo più breve, a costi inferiori e con un più alto tasso di successo in neuroscienze campi5 ,6,7. Un altro obiettivo della ricerca traslazionale è quello di esaminare l'applicabilità nei soggetti umani, che richiede approcci sperimentali non invasivi in animali che consentono confronti con lo stesso metodo per gli esseri umani. Queste condizioni hanno portato a diverse esigenze significative per lo sviluppo di metodi di preparazione degli animali non-invasivo. Un metodo è l'elettroencefalografia (EEG), che rivela la connettività corticale cerebrale e attività è bidimensionale ad elevata risoluzione temporale, e che beneficia di un protocollo non invasivo. La registrazione di potenziale evento-correlati (ERP) è uno dei tipici paradigmi sperimentali che utilizzano EEG.

Numerosi studi autonomo non invasiva EEG metodi precedenti per il targeting soggetti gli esseri umani, considerando che i metodi invasivi, come impiantare viti ed elettrodi di tipo di palo, sono stati utilizzati in studi sugli animali8,9,10 , 11 , 12. la qualità del segnale e le caratteristiche di questi metodi dipendono in modo significativo l'invasività del posizionamento del sensore. Per successo ricerca traslazionale, Garner ha sottolineato utilizzando le stesse condizioni per studio sugli animali come quelli utilizzati per la ricerca umana13. Per la ricerca di base utilizzando animali, tuttavia, metodologie non invasive di EEG non sono prevalenti. Un metodo novello usando un sistema di sensori non invasivi del cuoio capelluto EEG concentrandosi su topi di laboratorio sarebbe uno strumento affidabile ed efficiente per la ricerca traslazionale che possa essere applicato ai paradigmi non invasivo per gli esseri umani, pure.

Numerosi studi del mouse EEG ha condotto il senso da commercializzare PCB (circuito stampato) basato su elettrodi multi-canale14,15,16. Anche se hanno adottato un metodo invasivo, avevano un numero limitato di canali (3-8), che ha reso più difficile da osservare la dinamica del cervello su larga scala. Inoltre, le applicazioni possono essere limitate dalla loro invasività e costi elevati. In un altro studio di ricerca, il KIST (Korea Institute of Science and Technology) ha sviluppato un elettrodo di film sottile di polyimide-basato 40 canale e attaccato a cranio17,18,19,20 di un mouse . Questo lavoro ha acquisito il maggior numero di canali del mouse EEG. Era, tuttavia, meccanicamente deboli e non facile da riutilizzare; di conseguenza, era inadeguato per osservazioni a lungo termine, portando a un segnale indebolito, possibilmente causato da una reazione immune. Nel frattempo, Troncoso e Mégevand acquisito un potenziale evocato sensoriale (SEP) sui teschi dei roditori con trenta-due elettrodi in acciaio inox protetti da un di21,di Poly(methyl methacrylate) (PMMA, vetro acrilico) griglia forata22 , 23. nonostante la loro qualità di segnale alto, gli elettrodi erano meccanicamente flessibili e tenera; di conseguenza, avevano difficoltà essendo applicata a esperimenti multipli. Inoltre, questo metodo era ancora minimamente invasivo. Sebbene questi metodi forniscono segnale di buona qualità, la superficie del cranio di un topo è limitata, il numero di elettrodi è pertanto limitato utilizzando un elettrodo di acciaio inox pole-tipo. Una serie di precedenti studi di EEG per topi ha mostrato diverse limitazioni. In questo studio, ci mostrerà un nuovo metodo per la misurazione EEG applicabile nella ricerca traslazionale pre-clinica, utilizzando un sensore di multi-canale a secco-tipo non invasivo.

Al fine di superare i limiti dei precedenti metodologie EEG animale, che includeva l'intrinseca complessità di preparazione degli animali, l'invasività, alti costi, sprechi e debole resistenza meccanica, abbiamo cercato di sviluppare un nuovo elettrodo che esibisce flessibilità, stato di tipo asciutto, le funzionalità multi-canale, non invasività e riutilizzabilità. Nel seguente protocollo, descriviamo il processo di misurazione registrazioni (VEP) potenziali evocate visive su un cuoio capelluto del mouse utilizzando un sensore di EEG asciutto, non invasivo, multi-canale. Questo metodo utilizza risorse facilmente disponibili, quindi abbassare la barriera di ingresso nella sperimentazione animale nel campo dell'ingegneria biomedica.

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Protocollo

Gestione e cura degli animali ha seguito le linee guida istituzionale del Gwangju Institute of Science e Technology (GIST).

Nota: La procedura per l'acquisizione del segnale VEP da un topo in vivo è costituito da quattro passaggi: montaggio del sensore (1), la preparazione (2) animali, VEP (3) misura ed elaborazione del segnale (4).

1. sensor Assembly

  1. Preparare sedici perni per un elettrodo non invasivo.
    Nota: Ogni elettrodo pin-tipo è costituito da tre parti: un pistone testa di sonda, una molla interna e un barile come mostrato in Figura 1a. La lunghezza di ciascun pin è di 13 mm e la lunghezza del pre-carico molla regolabile è di 1 mm.
  2. Tagliare due pezzi di substrati di fibra di vetro (spessore: 1,5 mm) con la dimensione di 15 × 17 mm (larghezza × altezza).
    Nota: Le funzioni di substrato dielettrico in fibra di vetro come un isolante, che separa i segnali multipli simultaneamente acquistato dal cuoio capelluto del mouse.
  3. Praticare fori di sedici di diametro 1,2 mm ogni utilizzando una macchina di incisione di precisione, come mostrato in Figura 1 c.
    1. Stendere il coordinamento di sonda uniformemente ad un intervallo di 2 mm sul substrato piatto: + 7/0, + 2 /-2, + 2/0, + 2 / + 2, 0 /-4, 0 /-2, 0/0 (bregma), 0 / + 2, 0 / + 4, -2-3, -2 /-1, -2 / + 1, -2 / + 3, -4 /-2, -4/0 , -4 / + 2 (anteroposteriore e laterale con base di bregma, in mm)24,25,26.
  4. Stack due substrati e applicare una goccia di colla adesiva ad azione rapida tra strati di substrato, producendo un doppio strato di spessore di 3 mm sostenere sedici elettrodi paralleli e stabili durante l'acquisizione del segnale.
  5. Assemblare i sedici elettrodi sul substrato uno-ad-uno manualmente.
    Nota: Il diametro del foro più piccolo si ferma ogni elettrodo alla stessa lunghezza. Ogni diametro del foro è leggermente inferiore al diametro più spesso di un barile all'interno di singolo pin (1,3 mm) che consente il fissaggio stretto degli elettrodi senza alcun allentamento.
  6. Saldare e link parte di saldatura-Coppa finale di ciascun elettrodo verso il connettore di prova di tocco.
  7. Coprire e nascondere le giunzioni nude con tubazione degli strizzacervelli di calore per l'isolamento elettrico.

2. preparazione animale

  1. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di ketamine:xylazine 100:10 (100 mg / mL:10 mg/mL) miscela con la quantità di 10 µ l/g di peso corporeo.
    Nota: Controllare che l'anestesia dell'animale è adeguata tirando una gamba o tweaking la coda prima di iniziare la preparazione.
  2. Applicare unguento oculare per mantenere la cornea del mouse umida con un batuffolo di cotone.
  3. Rimuovere i peli intorno alla testa e le spalle con un tagliatore di capelli e quindi diffondere commercialmente disponibile crema depilatoria e tenerlo su quest'area per 3-4 min.
  4. Rimuovere il depilatorie applicata con una spatola e poi pulire il resto con salviettine umidificate applicando acqua diverse volte.

3. misura VEP

Nota: Il VEP intero processo di misura si è svolta in una gabbia di Faraday scura (larghezza x profondità x altezza: 61 × 61 × 60 cm).

  1. Testa del mouse sulla cornice stereotassica posizionando bar orecchio nel canale uditivo del mouse e stringerle proprio in luogo.
  2. Montare il sensore nel supporto elettrodo su misura (Figura 1b) e fissare il supporto del sensore sul telaio stereotassica, come mostrato nella Figura 1 d.
  3. Individuare il sensore flessibile di EEG, considerando sia la posizione dell'elettrodo di riferimento e la posizione di bregma27. Dopo di che, con molta attenzione abbassare il sensore in senso verticale in modo che i tuffatori allinearono elettrodo contatto del cuoio capelluto del mouse in modo uniforme sul margine ricurvo.
    Nota: La distanza abbassata è inferiore a 1 mm, che è la lunghezza regolabile dello stantuffo.
  4. Verifica che le impedenze sono nell'intervallo corretto da 100 kΩ a 2 MΩ. Riposizionare l'elettrodo quando qualsiasi valore di impedenza del pin è fuori la gamma28.
  5. Posizionare lo stimolatore foto 20cm lontano dagli occhi del mouse.
  6. Prima di iniziare l'esperimento, adattare il mouse per 10 minuti nella gabbia per adattamento visivo scuro scura.
    1. Impostare i parametri dei dispositivi sperimentali come segue: frequenza di campionamento: 500 Hz; Filtro notch: 60 Hz; Intervallo di Inter-stimolo: 10 s; Durata del lampo: 10 ms; numero di stimoli flash: 100 prove/soggetto.
      Nota: La luce del flash è una luce bianca, illuminazione a LED che ha 550 ± 20% lx con una distanza di 20 cm.

4. le procedure di elaborazione del segnale di risposte VEP

  1. Epoching
    1. Per misura continua dei dati seriali, estrarre ogni epoca per creare singolo-trial VEP segmenti dal periodo pre-stimolo (-300 ms) per il periodo post-stimolo (600 ms), basati sull'inizio dello stimolo flash.
      Nota: Poiché forniamo ripetutamente stimolo istantaneo oltre 100 prove per ogni soggetto, un totale di 100 epoche VEP per ogni mouse vengono estratti in questo passaggio. Epoching di EEG è un processo in cui specifica finestra temporale vengono estratti dai dati misurati in continuo del segnale EEG.
  2. Ri di riferimento (media di riferimento)
    1. Calcolare la media dei segnali EEG attraverso tutti i elettrodo quattordici canali in ogni momento scegliere e quindi sottraggono il valore medio da ogni canale. Ripetere questa procedura per tutte le epoche VEP.
  3. Eseguire passa-banda di filtraggio del segnale da ~ 1-100 Hz mediante una risposta limitata di impulso (FIR) filtro.
  4. Correzione della linea di base
    1. Calcolare la media dei segnali EEG nel periodo pre-stimolo (periodo di previsione, -300 ~ 0 ms) per ogni canale, quindi sottrarre la media da ciascun punto nella forma d'onda (-300 ~ 600 ms). Questa regola l'asse di ampiezza delle risposte VEP per facilitare l'osservazione dei cambiamenti dell'onda di cervello dopo stimolazione. Ripetere questo passaggio per tutte le epoche VEP.
  5. Grand VEP risposte
    1. Media le epoche VEP singolo-trial per creare singolo-oggetto media di forme d'onda VEP per ogni canale. Quindi, calcolare la media di grand ensemble delle risposte VEP per ogni canale per quanto riguarda tutti i soggetti.

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Risultati

Abbiamo calcolato la media di ensemble di risposte VEP da undici topi come mostrato nella Figura 2. Questo risultato mostra le risposte VEP ottenute attraverso questo esperimento dal periodo pre-stimolazione (-300 ms) per il periodo post-stimolazione (600 ms), come la stimolazione è dato al tempo 0 s. È evidente che il segnale oscilla solo per un po' di tempo (meno di 300 ms) dopo la stimolazione, mentre il segnale si stabilizza costantemente durante il per...

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Discussione

In primo luogo ci siamo concentrati sul design del sensore, priorità praticità riducendo al minimo le procedure chirurgiche complesse. Il sensore di EEG deformabile è composto da sedici perni: quattordici per registrazione, uno per terra e l'ultimo per elettrodi di riferimento. Ogni elettrodo ha la struttura di stantuffo-primavera-barilotto, che si applica deformabilità sulla superficie di contatto dell'elettrodo, quindi facilitano l'acquisizione del segnale stabile e uniforme dal cuoio capelluto del mouse curvo e te...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dalla GIST Research Institute (GRI), il progetto di collaborazione di ricerca GIST-Caltech attraverso una sovvenzione fornita da GIST nel 2017. Supportato anche da assegno di ricerca (NRF-2016R1A2B4015381) della nazionale Research Foundation (NRF) finanziato dal governo coreano (MEST) e dal programma di ricerca di base di KBRI attraverso Corea del Brain Research Institute finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro Pianificazione (17-BR-04).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine 50 Inj. (Vial)Yuhan-Ketamine HCl 57.68 mg
Zoletil 50 Inj.Virbac-Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg
Rompun 2% Inj.BAYER-Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL
Hycell solution 2%Samil-Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg
Puralube Vet Ointment 3.5 mgPharmaderm-
Saline solution Inj. JW Pharmaceutical -NaCl 9 g/1000 mL
Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive SkinReckitt Benckiser-depilatory
Skins - Surgical Skin MarkerSurgmedS-3000STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set
Stainless Steel Micro SpatulasHEATHROW SCIENTIFICHS15907 One Round Flat End, 2L x 5/16W"
cotton swap
Stereotaxic, Desktop Digi SingleRWD Life Science68025
Mouse AdapterRWD Life Science68010
Ear Bar for Mouse Non-RuptureRWD Life Science68306
Mitsar-EEG 202-24 MITSARamplifier
EEGStudio EEG acquisition softwareMITSAR
White flash stimulator MITSARMITSAR Flash stimulator
BCI2000 softwareSchalk lab
g.USBampg.tec0216
g.Power-g.USBampg.tec0247
 441 style straight body Touch Proof connectorPlasticsOne441000PSW080001441 - 000 PSW 80" (BLACK)
Standard probeLEENOSK100CSWhttp://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012
Precision engraving machine toolsTINYROBOTinyCNC-6060C
Heat shirink3MFP301

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