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Resumo

Nós projetamos um sensor de 16 canais de EEG de tipo seco que é não-invasivo, deformável e re-utilizáveis. Este paper descreve todo o processo de fabricação, o eletrodo de EEG proposto para processamento de potencial evocado visual (VEP) sinal sinaliza medido em um couro cabeludo de rato usando um sensor de EEG invasivo de multi-canal seco.

Resumo

Para ambientes de pesquisa do couro cabeludo EEG com ratos de laboratório, nós projetamos um sensor de EEG de 16 canais do tipo seco que é não-invasivo, deformável e re-utilizáveis por causa do êmbolo-Primavera-barril faceta estrutural e forças mecânicas resultantes de metal materiais. Todo o processo para adquirir o VEP respostas na vivo de um rato é composto por quatro etapas: montagem do sensor (1), preparação (2) animal, medição (3) VEP e processamento de sinal (4). Este trabalho apresenta medições representativas das respostas VEP de vários mouses com uma resolução de sinal submicro-tensão e resolução temporal de sub 100 milissegundos. Embora o método proposto é mais conveniente e mais seguro em comparação com outros anteriormente relatados animais métodos de aquisição de EEG, lá permanecem questões incluindo como melhorar a relação sinal-ruído e como aplicar esta técnica com animais movimentando-se livremente. O método proposto utiliza recursos facilmente disponíveis e mostra uma resposta VEP repetitiva com uma qualidade de sinal satisfatório. Portanto, esse método poderia ser utilizado para estudos experimentais longitudinais e confiável pesquisa translacional explorando paradigmas não-invasiva.

Introdução

Como o número de pacientes com doenças cerebrais degenerativas senis como demência, Alzheimer, Parkinson síndromes e derrame aumentou com o envelhecimento da população e uma crescente expectativa de vida, os encargos sociais a longo prazo destas doenças tem também aumentou a1,2,3. Além disso, a maioria das doenças do desenvolvimento neurológico, como esquizofrenia e autismo, são acompanhadas por distúrbios cognitivos e comportamentais que afetam toda a vida da2,3,4 um paciente. Por este motivo, os pesquisadores têm lutado para melhorar o diagnóstico, prevenção, compreensão patológica, observação a longo prazo e tratamento de doenças cerebrais. No entanto, os problemas permanecem provindo da complexidade do cérebro e patologias de doença não revelada. Investigação de translação pode ser uma ferramenta promissora para a identificação de soluções porque permite a transferência de pesquisa básica para aplicações clínicas, dentro de um prazo mais curto, a um custo menor e com uma maior taxa de sucesso em neurociência campos5 ,6,7. Outro objetivo da pesquisa translacional é examinar a aplicabilidade em seres humanos, que requer abordagens experimentais não-invasiva em animais que permitem comparações com o mesmo método para os seres humanos. Estas condições têm levado a diversas necessidades significativas para o desenvolvimento de métodos de preparação de animais não-invasiva. Um método é a Eletroencefalografia (EEG), que revela a conectividade cortical cerebral e atividade forma bidimensional com alta resolução temporal, e que beneficia de um protocolo não-invasiva. A gravação potencial relacionados a eventos (ERP) é um dos típicos paradigmas experimentais que utilizam EEG.

Numerosos estudos independentes não-invasivo EEG métodos anteriores para segmentação de assuntos humanos, Considerando que os métodos invasivos, tais como parafusos e eletrodos do tipo polo, implante têm sido utilizados em estudos com animais8,9,10 , 11 , 12. a qualidade do sinal e as características desses métodos dependem significativamente a capacidade de invasão da colocação do sensor. Para investigação de translação bem sucedida, Garner enfatizada usando as mesmas condições para estudo animal como aqueles usados para pesquisa humana13. Para a pesquisa básica com animais, no entanto, metodologias de EEG invasivo não são predominantes. Uma nova abordagem, usando um sistema de sensor de couro cabeludo invasivo EEG com foco em ratos de laboratório seria uma ferramenta confiável e eficiente para investigação de translação que pode ser aplicada para os paradigmas não-invasivo para os seres humanos, também.

Numerosos estudos de rato EEG liderou o caminho por comercializar PCB (placa de circuito impresso) com base em eletrodos de multi-canal14,15,16. Embora eles adotaram um método invasivo, eles tinham um número limitado de canais (3-8), que tornou mais difícil de observar a dinâmica do cérebro em grande escala. Além disso, aplicativos podem ser restringidos por sua capacidade de invasão e alto custo. Num outro estudo, o KIST (Instituto de Coreia da ciência e tecnologia) desenvolveu um eletrodo de filme fino baseados em poliimida 40 canal e acompanha-lo para crânio17,18,19,20 de um rato . Esta obra adquiriu o maior número de canais de EEG de rato. Foi, no entanto, mecanicamente fraco e não é fácil de reutilizar; Portanto, seria inapropriado para observações a longo prazo, levando a um sinal enfraquecido, possivelmente causado por uma reação imune. Enquanto isso, Troncoso e Mégevand adquiriram um potencial evocado sensorial (SEP) em crânios dos roedores com trinta e dois eletrodos de aço inoxidável garantidos por uma perfurada Poly(methyl methacrylate) (PMMA, vidro acrílico) grade21,22 , 23. apesar de sua qualidade de sinal elevado, os eletrodos foram mecanicamente flexível e macio; Portanto, eles tinham dificuldades sendo aplicadas a vários experimentos. Além disso, este método foi ainda minimamente invasivo. Embora esses métodos fornecem um sinal de boa qualidade, a área de superfície do crânio de um rato é limitada, portanto o número de eletrodos é restrito usando um eletrodo de aço inoxidável tipo polo. Um número de estudos anteriores de EEG para ratos mostrou várias limitações. Neste estudo, vamos mostrar um novo método de medição aplicáveis na investigação de translação pré-clínicos usando um sensor de multi-canal de tipo seco não-invasivo de EEG.

A fim de superar as limitações das metodologias anteriores de EEG animais, que incluía a complexidade intrínseca da preparação do animal, invasividade, alto custo, desperdício e fraca resistência mecânica, procuramos desenvolver um novo eletrodo que exibe flexibilidade, status do tipo seco, capacidades de multi-canal, não-invasividade e reutilização. No protocolo a seguir, descreveremos o processo de medição visuais gravações de potenciais evocadas (VEP) em um couro cabeludo de rato usando um sensor seco, não-invasivo, multi-canal de EEG. Este método utiliza recursos facilmente disponíveis, portanto, reduzindo a barreira de entrada em experimentação animal no campo da engenharia biomédica.

Protocolo

Manuseio e cuidados com animais seguiram a diretriz institucional do Gwangju Instituto de ciência e tecnologia (GIST).

Nota: O procedimento para a aquisição do sinal VEP de um rato no vivo consiste em quatro etapas: montagem do sensor (1), preparação (2) animal, medição (3) VEP e processamento de sinal (4).

1. montagem do sensor

  1. Prepare-se 16 pinos para um eletrodo não-invasiva.
    Nota: Cada eletrodo tipo pino consiste de três partes: um desentupidor de cabeça de sonda, uma mola interna e um barril como mostrado na Figura 1a. O comprimento de cada pino é de 13 mm, e o comprimento de pré-carga da mola ajustável é 1 mm.
  2. Corte dois pedaços de substratos de fibra de vidro (espessura: 1.5 mm) com o tamanho de 15 mm × 17 mm (largura × altura).
    Nota: As funções de substrato de fibra de vidro não-condutor como um isolador, que separa os sinais múltiplos simultaneamente adquiriram do couro cabeludo do rato.
  3. Faz 16 furos de diâmetro 1,2 mm cada usando uma máquina de gravura de precisão, como mostrado na Figura 1 c.
    1. Espalhar-se a coordenação de sonda uniformemente em um intervalo de 2 mm sobre o substrato plano: + 7/0, + 2 + 2 /-2, 0, + 2 / + 2, 0/4, 0 /-2, 0/0 (bregma), 0 / + 2, 0 / + 4, -2-3, -2 /-1, -2 / + 1, -2 / + 3, -4 -4 2, / / 0 , -4 / + 2 (ântero-posterior/lateral com base de bregma, em mm)24,25,26.
  4. Empilhar dois substratos e aplique uma gota de cola adesiva de ação rápida entre camadas de substrato, produzindo uma camada dupla de 3 mm de espessura 16 eletrodos estáveis e paralelos de apoio durante a aquisição do sinal.
  5. Monte os dezesseis eletrodos sobre o substrato, um por um manualmente.
    Nota: O diâmetro do furo menor para cada eletrodo no mesmo comprimento. Cada diâmetro de furo é ligeiramente menor do que o diâmetro mais grosso de um barril dentro o único pino (1,3 mm) que permite a fixação firme de eletrodos sem qualquer afrouxamento.
  6. Solda e Hiperligação parte de solda-Copa terminando do cada eletrodo conector à prova de toque.
  7. Cobrir e ocultar as junções nuas com tubulação de calor-psiquiatra para a isolação elétrica.

2. animal preparação

  1. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de ketamine:xylazine 100:10 (100 mg / mL:10 mg/mL) mistura com a quantidade de 10 µ l/g de peso corporal.
    Nota: Consulte a que anestesia do animal é adequada por puxar uma perna ou a cauda de ajustes antes de iniciar a preparação.
  2. Aplica a pomada para manter a córnea do mouse úmido com um cotonete.
  3. Remover os pelos ao redor da cabeça e ombros com um aparador de cabelo e então espalhar creme depilatório comercialmente disponível e mantê-lo nesta área para 3-4 min.
  4. Retire o creme depilatório aplicado com uma espátula e depois limpar o resto com toalhetes aplicando água várias vezes.

3. VEP medição

Nota: O VEP todo processo de medição ocorreu em uma gaiola de Faraday escura (largura x profundidade x altura: 61 × 61 × 60 cm).

  1. Monte a cabeça do rato sobre a armação estereotáxica colocando barras de orelha em canais de orelha do rato e apertá-los precisamente no lugar.
  2. Montar o sensor no porta-eletrodo sob medida (Figura 1b) e fixar o suporte do sensor sobre a armação estereotáxica, como mostrado na Figura 1 d.
  3. Localize o sensor flexível de EEG, considerando tanto a posição do eletrodo de referência e a posição de bregma27. Depois disso, baixe muito cuidadosamente o sensor na direção vertical para que os êmbolos de eletrodo matriz entre em contato com o couro cabeludo do rato uniformente a margem curvo.
    Nota: A distância reduzida é menor que 1 mm, que é o comprimento ajustável do êmbolo.
  4. Verifique se as impedâncias estão dentro da faixa adequada de 100 kΩ para MΩ 2. Reposicione o eletrodo quando qualquer valor de impedância do pino está fora do intervalo28.
  5. Posicione o estimulador de foto 20 cm longe dos olhos do rato.
  6. Antes de iniciar o experimento, adapte o mouse durante 10 minutos na jaula escura para adaptação visual escura.
    1. Definir os parâmetros dos dispositivos experimentais da seguinte forma: frequência de amostragem: 500 Hz; Filtragem de entalhe: 60 Hz; Intervalo de estímulo inter: 10 s; Duração de flash: 10 ms; número de estímulos flash: 100 ensaios/assunto.
      Nota: A luz do flash é uma luz branca, iluminação LED, que tem 550 ± 20% lx com uma distância de 20 cm.

4. VEP procedimentos de processamento de sinal de respostas

  1. Epoching
    1. Para medir continuamente dados seriais, extrair cada época para criar single-julgamento VEP segmentos do período pré-estímulo (-300 ms) para o período pós-estímulo (600 ms), baseados-se o aparecimento do estímulo flash.
      Nota: Desde que nós repetidamente fornecer estimulação flash mais de 100 ensaios para cada disciplina, um total de 100 épocas VEP para cada mouse são extraídos nesta etapa. Epoching de EEG é um processo em que janelas de tempo específicas são extraídas os dados de sinal de EEG continuamente medidos.
  2. Re-referenciar (referência média)
    1. Calcule a média de sinais EEG através de eletrodo de catorze todos os canais em cada ponto e em seguida, subtrair o valor em média de cada canal. Repita este procedimento para todas as épocas da VEP.
  3. Band-pass de executar filtragem do sinal de ~ 1-100 Hz usando uma resposta de impulso finita (FIR) do filtro.
  4. Correção de linha de base
    1. Calcular a média dos sinais EEG no período pré-estímulo (período de base, -300 ~ 0 ms) para cada canal, em seguida, subtrair esta média de cada ponto em forma de onda (-300 ~ 600 ms). Isto ajusta o eixo de amplitude das respostas VEP para facilitar a observação das mudanças de ondas cerebrais após estimulação. Repita este passo para todas as épocas VEP.
  5. Respostas de Grand VEP
    1. Média as épocas VEP single-julgamento para criar o único assunto em média para cada canal, formas de onda VEP. Em seguida, calcule a média de grand ensemble de respostas VEP para cada canal em relação a todos os indivíduos.

Resultados

Calculamos a média de conjunto de respostas VEP de onze ratos como mostrado na Figura 2. Este resultado mostra as respostas VEP obtidas através deste experimento do período pré-estimulação (-300 ms) para o período pós-estimulação (600 ms), como a estimulação é dada a hora 0 s. É perceptível que o sinal oscila apenas por um tempo (menos de 300 ms) após a estimulação, enquanto o sinal se estabiliza firmemente ao longo do tempo durante o perío...

Discussão

Em primeiro lugar focamos no projeto do sensor, priorizando praticidade, minimizando procedimentos cirúrgicos complexos. O sensor de EEG deformável é composto de 16 pinos: quatorze para gravação, para o chão e o último para eletrodos de referência. Cada eletrodo tem a estrutura de êmbolo-Primavera-barril, que se aplica à deformação na superfície de contato do eletrodo, então eles facilitam a aquisição do sinal uniforme e estável do couro cabeludo do rato curvo e terna. Tendo em conta o bem-estar dos anim...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pelo GIST Research Institute (GRI), o projeto de colaboração de pesquisa de GIST-Caltech através de uma concessão fornecida pela GIST em 2017. Também apoiada pela bolsa de investigação (NRF-2016R1A2B4015381) de Fundação Nacional de pesquisa (NRF) financiado pelo governo coreano (MEST) e pelo programa de pesquisa básica KBRI através do Instituto de pesquisa do cérebro Coreia financiada pelo Ministério da ciência, das TIC e futuro Planejamento (17-BR-04).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine 50 Inj. (Vial)Yuhan-Ketamine HCl 57.68 mg
Zoletil 50 Inj.Virbac-Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg
Rompun 2% Inj.BAYER-Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL
Hycell solution 2%Samil-Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg
Puralube Vet Ointment 3.5 mgPharmaderm-
Saline solution Inj. JW Pharmaceutical -NaCl 9 g/1000 mL
Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive SkinReckitt Benckiser-depilatory
Skins - Surgical Skin MarkerSurgmedS-3000STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set
Stainless Steel Micro SpatulasHEATHROW SCIENTIFICHS15907 One Round Flat End, 2L x 5/16W"
cotton swap
Stereotaxic, Desktop Digi SingleRWD Life Science68025
Mouse AdapterRWD Life Science68010
Ear Bar for Mouse Non-RuptureRWD Life Science68306
Mitsar-EEG 202-24 MITSARamplifier
EEGStudio EEG acquisition softwareMITSAR
White flash stimulator MITSARMITSAR Flash stimulator
BCI2000 softwareSchalk lab
g.USBampg.tec0216
g.Power-g.USBampg.tec0247
 441 style straight body Touch Proof connectorPlasticsOne441000PSW080001441 - 000 PSW 80" (BLACK)
Standard probeLEENOSK100CSWhttp://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012
Precision engraving machine toolsTINYROBOTinyCNC-6060C
Heat shirink3MFP301

Referências

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