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Resumen

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Resumen

Plegable de reporteros son proteínas con fenotipos fácilmente identificables, tales como resistencia a los antibióticos, cuyo plegamiento y función está comprometido cuando fusionado al mal plegamiento de proteínas o marcos de lectura abierto al azar. Hemos desarrollado una estrategia que, mediante el uso de β-lactamasa TEM-1 (la enzima que confiere resistencia a la ampicilina) en una escala genomic, podemos seleccionar colecciones de dominios de la proteína plegada correctamente desde la parte de codificación de la DNA de cualquier genoma intronless. Los fragmentos de proteína obtenidos por este planteamiento, el así llamado "domainome", será bien expresado y soluble, haciéndolas adecuadas para estudios estructurales/funcionales.

Por clonación y mostrando la "domainome" directamente en un sistema de visualización de fagos, hemos demostrado que es posible seleccionar los dominios de la proteína específica con las propiedades de enlace deseado (por ejemplo, a otras proteínas o anticuerpos), proporcionando así esencial información experimental para la identificación de genes anotación o antígeno.

La identificación de los clones más enriquecidos en una población policlonal seleccionada puede lograrse mediante el uso de tecnologías de secuenciación de próxima generación novela (NGS). Por estas razones, presentamos análisis de secuenciación profunda de la propia biblioteca y las salidas de selección para proveer información completa sobre la diversidad, abundancia y asignación precisa de cada uno de lo fragmento seleccionado. Los protocolos presentados aquí muestran los pasos para la construcción de la biblioteca, caracterización y validación.

Introducción

Aquí, describimos un método de alto rendimiento para la construcción y selección de las bibliotecas de los dominios de la proteína soluble y doblado de cualquier fuente partida genic/genómica. El enfoque combina tres tecnologías diferentes: exhibición phage, el uso de un reportero plegable y siguiente generación de secuenciación (NGS) con una herramienta específica para análisis de datos. Los métodos se pueden utilizar en muchos contextos diferentes de investigación basados en proteínas, para la identificación y anotación de nuevos dominios de las proteínas/proteína, caracterización de propiedades estructurales y funcionales de las proteínas conocidas como definición de red de interacción de la proteína.

Muchas preguntas abiertas todavía están presentes en la investigación basada en la proteína y el desarrollo de métodos para la producción de proteína óptima es una necesidad importante de varios campos de investigación. Por ejemplo, a pesar de la disponibilidad de miles de genomas procariotas y eucariotas1correspondiente mapa de proteomas relativa con una anotación directa de los péptidos y proteínas codificadas es todavía faltando para la gran mayoría de los organismos. El catálogo de proteomas completos está emergiendo como una meta difícil que requiere un gran esfuerzo en términos de tiempo y recursos. El estándar de oro para anotación experimental sigue siendo la clonación de todos los abiertos marcos de lectura (ORFs) de un genoma, construyendo el llamado "ORFeome". Funciones de los genes es asignado generalmente basada en homología con genes relacionados de actividad conocida, pero esta aproximación es poco exacta debido a la presencia de muchas anotaciones incorrectas en referencia bases de datos2,3,4, 5. Por otra parte, incluso para las proteínas que se han identificado y anotado, estudios adicionales son necesarios para lograr la caracterización en términos de abundancia, patrones de expresión en diversos contextos, incluyendo propiedades estructurales y funcionales, así como redes de interacción.

Además, puesto que las proteínas se componen de diferentes dominios, cada uno de ellos que muestran características específicas y diferentemente que contribuyen a las funciones de la proteína, el estudio y la definición exacta de estos dominios pueden permitir una imagen más amplia, tanto en el solo gen y a nivel de genoma completo. Toda esta información necesaria hace investigación basada en la proteína un campo amplio y desafiante.

En esta perspectiva, podría darse una importante contribución por métodos imparciales y alto rendimiento para la producción de proteína. Sin embargo, el éxito de estos enfoques, al lado de la inversión considerable, se basa en la capacidad de producir construcciones de la proteína soluble/estable. Esto es una gran limitación de factor ya que se estima que sólo alrededor del 30% de proteínas puede correctamente expresado y producido en suficientes niveles experimentalmente útil6,7,8. Un enfoque para superar esta limitación se basa en el uso de ADN fragmentado al azar para producir polipéptidos diferentes, que juntos proporcionan representación superpuestos de fragmento de genes individuales. Sólo un pequeño porcentaje de los fragmentos de ADN generados al azar son ORFs funcionales mientras que la gran mayoría de ellos es no-funcionales (debido a la presencia de codones de parada dentro de sus secuencias) o codifica para no natural (ORF en un marco que no sea la original) polipéptidos con ningún significado biológico.

Para abordar todas estas cuestiones, nuestro grupo ha desarrollado una proteína de alto rendimiento expresión e interacción plataforma de análisis que puede utilizarse en una escala genomic9,10,11,12. Esta plataforma integra las siguientes técnicas: 1) un método para seleccionar colecciones de dominios de la proteína correctamente doblada de la parte de codificación de ADN de cualquier organismo; 2) la tecnología phage para la selección de socios de las interacciones; 3) la NGS completamente caracterizar el interactoma conjunto objeto de estudio e identificar los clones de interés; y 4) una herramienta web para el análisis de datos para usuarios sin conocimientos de programación ni bioinformática realizar análisis de Seq interactoma en forma sencilla y fácil de usar.

El uso de esta plataforma ofrece ventajas importantes sobre estrategias alternativas de investigación; sobre todo el método es completamente imparcial, alto rendimiento y modular para el estudio de un solo gen hasta un genoma entero. El primer paso de la tubería es la creación de una biblioteca de ADN fragmentado aleatoriamente bajo estudio, que luego se caracteriza profundamente por NGS. Esta biblioteca se genera usando un vector de ingeniería donde se clonan genes/fragmentos de interés entre una secuencia de la señal para la secreción de proteínas en el espacio periplasmic (es decir, un líder de la Sec) y el gen de β-lactamasa TEM1. La proteína de fusión confiere resistencia a la ampicilina y la capacidad de sobrevivir bajo la presión de la ampicilina solamente si fragmentos clonados en marco con estos elementos y la proteína de fusión resultante es correctamente doblada10,13 ,14. Todos los clones rescataron después de la selección de antibióticos, los llamados "clones de filtrado", son ORFs y, una gran mayoría de ellos (más del 80%), se derivan de genes reales9. Por otra parte, el poder de esta estrategia radica en los resultados que todos los clones ORF filtrado son codificación de proteínas correctamente doblado/soluble/dominios15. Como muchos clones, presentes en la biblioteca y la cartografía en el misma región/dominio, tienen diferentes empezando y terminando puntos, esto permite identificar imparcial, solo paso los fragmentos mínimos que pueden resultar en productos solubles.

Otra mejora en la tecnología se da por el uso de NGS para caracterizar a la biblioteca. La combinación de esta plataforma y de una herramienta de web específica para el análisis de los datos da importante información imparcial sobre las secuencias de nucleótido exacta y la ubicación de las ORFs en la referencia de ADN objeto de estudio sin necesidad de análisis más extensos o esfuerzo experimental.

Bibliotecas de Domainome pueden ser transferidas en un contexto de selección y utilizadas como un instrumento universal para llevar a cabo estudios funcionales. El alto rendimiento proteína expresión e interacción plataforma de análisis que integramos y que llamamos interactoma Seq se aprovecha de la tecnología de exhibición phage por transferir el ORF filtrado en un vector de phagemid y la creación de una fago-ORF Biblioteca. Una vez volver a clonar en un contexto de exhibición phage, proteína dominios aparecen en la superficie de las partículas de M13; de esta manera domainome las bibliotecas pueden seleccionarse directamente para fragmentos génicos codifican dominios con actividades enzimáticas específicas o enlace propiedades, permitiendo redes interactoma perfiles. Este enfoque fue inicialmente descrito por Zacchi et al. 16 y utilizado más adelante en varios otros contexto13,17,18.

En comparación con otras tecnologías utilizadas para el estudio de la interacción de proteínas (incluyendo sistema de híbrido dos levaduras y espectrometría de masas19,20), una ventaja importante es la amplificación del socio de enlace que se produce durante el fago Mostrar múltiples rondas de selección. Esto aumenta la sensibilidad de selección permitiendo así la identificación de dominios de bajo abundantes proteínas presentes en la biblioteca. La eficiencia de la selección realizada con filtrado de ORF biblioteca es incrementada debido a la ausencia de clones no funcional. Por último, la tecnología permite la selección a realizar contra la proteína y la proteína no cebos21,22,23,24,25.

Selección de fagos usando la biblioteca domainome-phage se puede realizar usando los anticuerpos procedentes de sueros de pacientes con diferentes condiciones patológicas, por ejemplo enfermedades autoinmunes13, cáncer o infección enfermedades como cebo. Este enfoque se utiliza para obtener la llamada "firma del anticuerpo" de la enfermedad bajo estudio permitiendo masivamente identificar y caracterizar los antígenos/epitopos específicamente reconocidos por los anticuerpos de los pacientes al mismo tiempo. En comparación con otros métodos el uso de phage display permite la identificación de epítopos antigénicos lineal y conformacional. La identificación de una firma específica podría potencialmente tener un impacto importante para entender patogenesia, nuevo diseño de la vacuna, identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de herramientas nuevas y específicas de diagnósticos y pronósticos. Por otra parte, cuando el estudio se centra en las enfermedades infecciosas, una ventaja importante es que el descubrimiento de proteínas inmunogénicas es independiente de cultivo del patógeno.

Nuestro enfoque confirma que los reporteros plegables se pueden utilizar en una escala genomic para seleccionar "domainome": una colección de dominios correctamente doblada, bien expresado, solubilidad de la proteína de la parte de codificación de la DNA o cDNA de cualquier organismo. Una vez aislados los fragmentos de proteínas son útiles para muchos propósitos, que proporciona información experimental esencial para anotación del gene así como por los estudios estructurales, Mapeo epitopo de anticuerpo, identificación de antígeno, etcetera. La integridad de datos de alto rendimiento NGS permite el análisis de muestras altamente complejos, tales como bibliotecas de exhibición phage y tiene el potencial para eludir la tradicional cosecha laboriosa y prueba de clones individuales phage rescatado.

Al mismo tiempo gracias a las características de la biblioteca de filtrado y a la extrema sensibilidad y potencia de los análisis NGS, es posible identificar el dominio de la proteína responsable de cada interacción directamente en una pantalla inicial, sin necesidad de crear bibliotecas adicionales para cada destino proteína. NGS permite para obtener una definición completa de la domainome entera de cualquier fuente partida genic/genómica y la herramienta web de análisis de datos permite la obtención de una caracterización muy específica desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo de la Dominios del interactoma proteínas.

Protocolo

1. construcción de la biblioteca de la ORF (figura 1)

  1. Preparación del inserto de ADN
    1. Preparación de fragmentos de ADN genómico o sintético
      1. Extracto/purificar DNA usando métodos estándar26.
      2. Fragmento de ADN por sonicación. Si utilizando un sonicador estándar, como un comienzo de sugerencia general con 30 pulsos de s al 100% de potencia.
        Nota: Los experimentos piloto deben hacerse con diversa energía y tiempos de sonicación para establecer las condiciones óptimas para la preparación de ADN. Después de cada prueba determinar el tamaño de los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa.
      3. Carga de la sonicación DNA en gel de agarosa al 1.5%, junto con una escalera de DNA 100 bp. Realizar una electroforesis corto a 5 V/cm durante 15 minutos y cortar la porción del gel que contiene el borrón de transferencia del ADN fragmentado.
      4. Purificar el ADN inserto con un kit de extracción de gel base de columna y medir la concentración utilizando un espectrofotómetro UV.
        Nota: al menos 500 ng de insertos purificadas debe obtenerse después de este paso, al estar ligada con 1 μg de vector digerido, como se describe en el paso 1.3. Comprobar la calidad de la preparación de fragmentos evaluando un260nm/A280nm y un /A260nm230nm proporciones ya que la baja calidad de la muestra afecta la eficacia de la ligadura.
      5. Tratar hasta 5 μg de los insertos con 1 μL de la mezcla de enzima Kit rápido de embotar, según instrucciones del fabricante. Inactivar enzimas calentando a 70 ° C por 10 minutos las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta su uso.
    2. Preparación de fragmentos de cDNA
      1. Extracto de RNA con métodos estándar (por ejemplo, usando TRizol o reactivos similares).
      2. Fragmento de ARNm por calentamiento antes de realizar la transcripción inversa. La longitud final del fragmento de ADN es controlada por el tiempo de ebullición de mRNA y la concentración de cartilla al azar. Por ejemplo, calentar la muestra durante 6 min a 95 ° C.
      3. Preparar el cDNA usando las cartillas al azar con cualquier kit disponible siguiendo el protocolo del fabricante.
      4. Agotar los cDNA de colas de poli-dT por hibridación con biotinilado poli-dA por 3 h a 37 ° C y separar en granos magnéticos estreptavidina según lo descrito por Carninci et al. 13
      5. Recuperar el material no Unido y purificar con un kit de purificación de DNA basado en columna siguiendo las instrucciones del fabricante. Medir la concentración utilizando un espectrofotómetro UV. Ver nota en paso 1.1.1.4.
  2. Preparación del vector filtrado
    1. Digest 5 μg de clonación purificada vector pFILTER312 con 10 U de EcoRV enzima de restricción, protocolo de siguiente del fabricante.
    2. Carga 2 μl (200 ng) del vector digerido, junto con 100 ng de vector no digerido y 1 k bp molecular marcador, en un gel de agarosa al 1%, para verificar la correcta digestión. Inactive por calor el enzima de restricción.
    3. Volumen 1/10 de 10 x buffer de fosfatasa y 1 μl (5 U) de fosfatasa e incubar a 37 ° C para inactivar los 15 minutos calor durante 5 minutos a 65 ° C.
    4. Purificar el plásmido digerido por la extracción de gel de agarosa y medir la concentración utilizando un espectrofotómetro UV. Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta su uso.
  3. Ligadura y transformación
    1. Realizar ligadura como sigue: 1 μg de plásmido digerido añadir 400 ng de insertos fosforiladas (plásmido: insertar relación molar 1:5), 10 μl de 10 x tampón para T4 ADN ligasa, 2 μl de alta concentración T4 ADN ligasa en un volumen final de 100 μl. Incubar la reacción en overni de 16 ° C GHT. Inactive por calor a 65 ° C durante 10 minutos.
    2. Precipitar el producto de la ligadura mediante la adición de 1/10 volumen de solución de acetato de sodio (3 M, pH 5.2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. De la mezcla y congelar a-80 ° C durante 20 minutos.
    3. Centrifugar a velocidad máxima durante 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    4. Añadir 500 μl de etanol frío al 70% para el pellet y centrifugar a máxima velocidad por 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    5. Secar el pellet. Resuspender el ADN precipitado en 10 μl de agua.
    6. Realizar electroporación de la célula bacteriana.
      Nota: El uso de células de alta eficiencia (por encima de 5 x 109 transformantes por μg de ADN) se requiere. Le sugerimos que use Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) producido en casa o comprados de varios fabricantes.
      1. Coloque el número apropiado de 0,1 cm-electroporación cubetas y tubos de microcentrífuga en hielo. Añadir 1 μl de la solución purificada de la ligadura (en DI agua) a 25 μl de las células y el tubo de la película un par de veces.
      2. Transferir la mezcla de ADN de la célula a la cubeta fría Pulse sobre encimera 2 x, limpie el agua desde el exterior de la cubeta, coloque en el pulso de módulo y presione de electroporación.
      3. Realizar electroporación con una máquina estándar electroporator usando 25 μF, Ω 200 y 1,8 kV. Constante de tiempo debe ser ms 4-5.
    7. Añadir 1 mL de medio 2xYT líquido sin ningún antibiótico, transferir a un tubo de 10 mL y permitir crecer a 37 ° C, agitando a 220 rpm durante 1 h.
    8. Transformado de placa DH5αF' 2xYT de 15 cm las placas de agar suplementado con 34 μg/mL cloranfenicol (pFILTER resistencia) y ampicilina (marcador selectivo de ORFs) de 25 μg/mL e incubar durante una noche a 30 ° C.
    9. Diluciones de la placa de la biblioteca en placas de agar de 2xYT 10 cm complementado con cloranfenicol + ampicilina y cloranfenicol, para realizar la valoración de la biblioteca. Incubar durante una noche a 30 ° C.
  4. validación de biblioteca pFILTER ORF
    1. Prueba de 15 a 20 colonias de las placas de cloranfenicol y ampicilina/cloramfenicol para estimar la distribución de tamaño de inserto. Seleccionar colonias solo con una punta y diluirles por separado en 100 μl de medio 2xYT sin antibióticos. Utilizar 0,5 μl de esta solución como plantilla de la DNA para una reacción de PCR, con cualquier estándar polimerasa TaqDNA siguiendo el protocolo del fabricante.
    2. Realizar 25 ciclos de amplificación utilizando un recocido T de 55 ° C y un tiempo de extensión de 40 s a 72 ° C. Secuencias de la cartilla se encuentran en la Tabla de materiales.
    3. Los productos PCR en gel de agarosa al 1.5%, junto con una 100 bp ADN escalera y gestión de la carga.
  5. colección de la biblioteca pFILTER ORF
    1. Recoger las bacterias de las placas de 150 mm añadiendo 3 mL de medio 2xYT fresco y cosecharlos con un raspador estéril, mezclar bien, complementar con el 20% de glicerol estéril y almacenar a-80 ° C en alícuotas pequeñas.
    2. Purificar el DNA plasmídico de una alícuota de la biblioteca (antes de la adición de glicerol) con un kit de extracción de plásmidos basado en la columna, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Medir la concentración con el espectrofotómetro de UV. Las muestras pueden conservarse a-20 ° C hasta ser utilizado para preparación de biblioteca phagemid o caracterización de NGS.

2. subcloning de ORFs filtradas en un Vector de Phagemid (figura 2)

  1. Preparación de ORF filtrado fragmentos de la DNA
    1. Configurar digestión de la enzima de la restricción de 5 μg de vector purificado desde el vector de biblioteca pFILTER ORF añadiendo 10 U de BssHII y de incubación según protocolo del fabricante. Inactivar la enzima y la recopilación con 10 U de NheI.
    2. Carga de la DNA digerida en gel de agarosa al 1.5%, junto con una escalera de DNA 100 bp. Realizar una electroforesis corto en 5 V/cm durante 15 minutos o lo suficiente distinguir el borrón de transferencia de los fragmentos suprimidos y cortar la porción del gel que las contengan.
    3. Purificar el ADN inserto con un kit de extracción de gel de base de la columna y medir la concentración utilizando un espectrofotómetro UV.
  2. Preparación de phagemid DNA
    1. Configurar la digestión de la enzima de la restricción de 5 μg de pDAN5 purificada27 en cuanto a los rellenos.
    2. Purificar el plásmido digerido por la corriente ADN digerido en un gel de agarosa de 0,75% y extracto de gel con un juego basado en la columna.
    3. Medir la concentración utilizando un espectrofotómetro UV. Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta su uso.
  3. Recolección, transformación y ligadura de la biblioteca
    1. Realizar la ligadura y la transformación como se describe para pFILTER vector.
    2. Transformado de placa DH5αF' 150 mm 2xYT placas de agar suplementado con ampicilina μg/mL 100 e incubar durante una noche a 30 ° C.
    3. Diluciones de la biblioteca en placas de agar de 2xYT 100 mm suplementado con ampicilina 100 de μg/mL para determinar el tamaño de la biblioteca de la placa.
    4. Realizar la validación de la biblioteca por PCR de clones al azar escogidos como se describe en el paso 1.4.
    5. Recoge la biblioteca phagemid-ORF de la cosecha de bacterias de las placas de 150 mm, mezclar bien, complementarlas con 20% de glicerol estéril y conservar a-80 ° C en pequeñas alícuotas.
    6. Purificar el DNA plasmídico de una alícuota de la biblioteca utilizando un kit de extracción de plásmidos basado en la columna, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    7. Medir la concentración en el espectrofotómetro de UV. Las muestras pueden conservarse a-20 ° C hasta ser utilizadas para la caracterización de NGS.

3. fago biblioteca preparación y procedimiento de selección

  1. Producción de fago
    1. Diluir una alícuota de existencias de la biblioteca de phagemid en 10 mL de 2xYT líquido caldo suplementado con ampicilina μg/mL 100 para tener un OD600 nm = 0.05.
    2. Crece la biblioteca diluida en un matraz estéril 5 - 10 veces mayor que el volumen original, a 37 ° C con agitación a 220 rpm hasta que alcances OD600 nm = 0.5.
    3. Infectar a las bacterias con fago del ayudante (por ejemplo M13K07) en una multiplicidad de infección de 20:1. Dejar a 37 ° C por 45 min con agitación ocasional (cada 10 minutos).
    4. Centrifugue las bacterias a 4000 x g por 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet de bacterias en 40 mL de 2xYT líquido caldo suplementado con 100 μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 50 crecimiento a 28 ° C con agitación a 220 rpm para pasar la noche.
    5. Al día siguiente, las bacterias de centrifugar a 4000 x g por 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante que contiene los phages.
  2. PEG-precipitación de fagos.
    1. Añadir 1/5 volumen de 0,22 μm filtrado PEG/NaCl solución (20% w/v PEG 6000, 2.5 M NaCl) a los phages despejados e incubar en hielo durante 30-60 minutos.
      Nota: Solución se convirtió en humo después de pocos minutos, indicando una precipitación exitosa phage. La turbidez de la solución aumentará el tiempo de incubación.
    2. Centrifugar a 4000 x g durante 15 min a 4 ° C. Se formará una pelotilla pequeña blanca de fagos.
    3. Resuspender en 1 mL de PBS estéril. Transferir a tubo de 1.5 mL y centrifugar a 4 ° C por 10 min a máxima velocidad para eliminar las bacterias contaminantes. Se forma un sedimento marrón.
    4. Transferir fagos que contienen sobrenadante a un tubo nuevo. Mantenga phages en hielo para sucesiva selección titulación y fago.
  3. Valoración de fago
    1. Preparar diluciones seriadas de la solución de fago. Coloque 10 μl de la solución de fago en 990 μl de PBS para obtener la dilución-2 10. Diluir otra vez esta preparación y de esta obtener una dilución 10-6 10-4 .
    2. Crecer DH5αF' células de las bacterias en medio líquido de 2xYT a 37 ° C con agitación hasta OD600 nm = 0.5 se alcanza. Transfiera 1 mL de la bacteria preparada en tubo de 1,5 mL e inmediatamente infectar con 1 μl de la dilución 10-4 del phage. Incubar sin agitación a 37 ° C por 45 min repetir el mismo procedimiento para la dilución de 10-6 .
    3. Diluciones de la placa de la bacteria infectada en la placa de 100 mm 2xYT. Poner la placa a 30 ° C durante la noche.
    4. Placa de 100 μl de infectado DH5αF' en una placa de agar de 2xYT suplementado con ampicilina 100 de μg/mL para comprobar la ausencia de contaminación en la preparación.
    5. El día después de contar el número de colonias y calcular el título del fago. Título expresa como número de phages/mL. Título esperado es de 1012 y 13 de phages/mL.
  4. Selección de fagos
    1. Selección de fagos utilizando como cebo purificado anticuerpos
      1. Saturar phages por dilución 200 μL de la preparación de fagos en un volumen igual de PBS - 4% descremada e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en rotación lenta. Este paso permite bloqueo de fagos para el atascamiento no específico. Transferencia 30 μl de proteína G granos magnéticos recubiertos a un tubo de 1,5 mL.
      2. Lavar dos veces como sigue: agregar 500 μl de PBS, incubar en una rueda en rotación lenta por 2 min a temperatura ambiente, sacar los granos a un lado del tubo usando un imán y eliminar el sobrenadante.
      3. Incubar los phages saturados con los granos lavados durante 30 min a temperatura ambiente con rotación lenta.
      4. Sacar los granos a un lado usando un campo magnético. Recoger el sobrenadante que contiene los phages para la etapa de selección.
      5. Preparar granos magnéticos al realizar el paso anterior, por conjugar los anticuerpos purificados. Lavar 30 μl de proteína G granos magnéticos recubiertos como se describió anteriormente. Diluir 10 μg de anticuerpos purificados en 500 μl de PBS, añadir a los granos lavados e incube en rotación lenta a temperatura ambiente durante 45 min lavado dos veces con PBS.
        Nota: Realizar dos preparaciones diferentes de granos magnéticos: uno con anticuerpos de interés y con control, por ejemplo, anticuerpos purificaron de donantes sanos. La secuencia de antígenos con anticuerpos se restan en la etapa de análisis de las salidas de control. Por otra parte, bolas magnéticas con anticuerpos de control pueden utilizarse para realizar un paso previo claro de los phages (seguir el protocolo para la incubación con conjugado sin granos).
      6. Selección de fagos: llamar a cuentas a un lado del tubo utilizando un imán, quitar el último lavado, agregar phages e incube con rotación lenta a temperatura ambiente durante 90 min lavar 5 veces con 500 μl de Tween-20 de PBS-0.1% y 5 veces con PBS.
      7. Eluir phages consolidados, que representa la salida de la selección, mezclando los granos con 1 mL de DH5αF' cultivados en OD600 = 0,5. Incubar las bacterias con los granos durante 45 min a 37 ° C con agitación ocasional (cada 10 minutos). Placa de la salida de una placa de agar de 2xYT 150 mm suplementada con ampicilina 100 de μg/mL.
      8. Placa de 100 μl de no diluido y de diferentes diluciones de la salida (10-1 a 10-5) para realizar la valoración. El día después de recoger las bacterias de las placas de 150 mm añadiendo 3 mL de medio 2xYT frescos y cosecha con un raspador estéril, mezclar bien, complementar con el 20% de glicerol estéril y almacenar a-80 ° C en alícuotas pequeñas.
      9. Crecer una alícuota para realizar a una segunda ronda de selección. Repita todo el procedimiento de barrido como se describió anteriormente, excepto en las condiciones de lavado. En este caso lavar 10 veces con PBS - 1% Tween-20 (Vierta la solución en el tubo y vaciar inmediatamente). Luego agregar 500 μl de PBS e incubar en rotación a temperatura ambiente por 10 minutos realizar otros 10 lavados con PBS. Proceder con el paso de elución en cuanto a la primera ronda de selección.
      10. Extraer ADN de plásmido de una alícuota de la salida usando un juego basado en la columna, siguiendo las instrucciones del fabricante. Plásmido de tienda a-20 ° C hasta que se utilizará para secuenciación profunda.
    2. Selección de fagos utilizando como cebo de proteínas recombinantes
      1. Saturar phages por dilución 200 μL de la preparación de fagos en un volumen igual de PBS - 4% descremada e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en rotación lenta.
      2. Añada 100 μl de granos magnéticos de estreptavidina. Incubar durante 1 h a temperatura de ambiente para seleccionar enlace de estreptavidina phages. Retire los phages de la estreptavidina-limite mediante la elaboración de las cuentas a un lado utilizando un imán. Tomar el sobrenadante del paso anterior y agregar proteína biotinilada (en una concentración de 100-550 nM) e incubar en un rotor a temperatura ambiente por 30 min a 1 h.
      3. Preparar granos magnéticos: al realizar el paso anterior, lavar 100 μl de granos estreptavidina-magnéticos con PBS, resuspender en PBS 2% descremada e incubar con rotación a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h.
      4. Selección de fagos: sacar los granos a un lado del tubo utilizando un imán, quitar PBS - 2% leche y suspender cuentas con mezcla de proteínas del fago. Incubar con rotación lenta a temperatura ambiente durante 90 minutos.
      5. Sacar los granos a un lado del tubo utilizando un imán, deseche el sobrenadante y lavar cuidadosamente cinco veces con 500 μl de PBS 0,1% Tween-20. Realizar la elución como se describe en la sesión anterior.

4. el fago biblioteca secuenciación profunda plataforma (figura 3)

  1. Insertos de DNA de pFILTER-ORF-biblioteca, pDAN5-ORF-biblioteca o bibliotecas de fagos seleccionados
    1. Descongelar una alícuota de la biblioteca, cuantificar mediante el uso de un espectrofotómetro, recupera las inserciones de ADN por amplificación con iniciadores específicos.
      Nota: Los iniciadores utilizados para rescatar a los insertos están ligados en su extremo 5' secuencias de adaptadores, lo que permite la indexación de direcciones sucesivas de las piscinas de amplicones obtenidos y la secuencia directa de los insertos de ADN recuperados mediante el uso de los secuenciadores. Su secuencia es en la Tabla de materiales. Los adaptadores están indicados en negrita, y los cebadores específicos se indican en cursiva.
    2. Utilizar 2,5 μl de la biblioteca (pFILTER/phagemid/seleccionado-phage) como plantilla de la DNA para una reacción de PCR.
    3. Utilizar el siguiente programa: 95 ° C por 3 min; 25 ciclos de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C para el asimiento de 5 min a 4 ° C.
      Nota: en este punto se recomienda ejecutar 1 μl del producto PCR en un Bioanalizador o TapeStation para verificar el tamaño de los amplicones y verificar que estén en el rango correcto.
  2. Limpiar el PCR
    1. Poner las bolas magnéticas (por ejemplo, Aonang) a temperatura ambiente. Transferir todo el producto PCR desde el tubo PCR en un tubo de 1,5 mL. Vórtice las bolas magnéticas para 30 s para asegurarse de que los granos están uniformemente dispersos. Añadir 20 μl de granos magnéticos a cada tubo que contiene el producto PCR, mezclar mediante pipeteo suave. Incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 5 minutos.
    2. Coloque la placa en un soporte magnético por 2 min o hasta que haya desaparecido el sobrenadante. Con los productos de la polimerización en cadena en el soporte magnético, retire y descarte el sobrenadante.
    3. Lavar los granos con etanol de 80% recién preparada, con los productos PCR en el soporte magnético, como sigue: agregar 200 μL de etanol al 80% recién preparada para cada muestra bien; Incube la placa en el soporte magnético para 3 s; cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
    4. Realizar un segundo lavado con etanol, con los productos PCR en el soporte magnético; al final del segundo lavado cuidadosamente retire el etanol y los granos de secar al aire durante 10 minutos.
    5. Eliminar los productos PCR del soporte magnético, agregar 17.5 μl de 10 mM de Tris de pH 8.5 a cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces, asegúrese de que los granos son completamente suspendidos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    6. Coloque el tubo en el soporte magnético para 2 min o hasta que haya desaparecido el sobrenadante, con cuidado de transferencia 15 μl del sobrenadante que contiene los productos PCR purificados a un nuevo tubo de 1,5 mL. Almacenar los productos PCR purificados de-15 ° C a-25 ° C durante hasta una semana si no procede inmediatamente a la PCR de índice.
  3. Índice de polimerización en cadena
    Nota: Después de limpiar el PCR, realizar PCR de índice. Utilice el kit de Nextera XT índice; así será posible la secuencia de las librerías indexadas doble resultantes dentro de multiplexado funciona Illumina.
    1. Transferir todos los 15 μL que contiene cada producto purificado en un nuevo tubo PCR y configurar la siguiente reacción que contiene: 15 μl del producto de amplicón purificado, 5 μl de índice cartilla 1 y 5 μl de índice cartilla 2, 25 μl de la mezcla de x PCR 2; volumen final de 50 μl.
    2. Realizar PCR en un termociclador con el siguiente programa: 95 ° C por 3 min, 8 ciclos de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s; 72° C por 5 min, después llevar a cabo a 4 ° C.
  4. PCR de limpiar 2
    1. Seguir el mismo protocolo descrito en la sección 4.2 para PCR limpiar con los siguientes cambios: en el primer paso añadir 56 μl de granos magnéticos a cada 50 μl del producto de PCR.
    2. Suspender los granos en 27,5 μl de 10 mM Tris, pH 8.5 en el último paso de purificación y transferir 25 μl a un tubo nuevo (esta es la purificada biblioteca final lista para la cuantificación y luego secuenciación).
    3. Almacenar la placa a-15 ° C a-25 ° C durante hasta una semana si no proceder a la cuantificación de la biblioteca.
  5. Evaluación cualitativa y cuantitativa de la biblioteca de la secuencia
    1. Después de la purificación, ejecute 1 μl de un 1:10 dilución de la biblioteca final en un equipo bioanalyzer para verificar el tamaño y cuantificar seleccionando la región de la traza definitiva de la biblioteca.
    2. Paralelamente realizar la cuantificación de la biblioteca por PCR en tiempo Real mediante un kit de cuantificación de la biblioteca según el protocolo del fabricante.
  6. Bibliotecas de secuenciación
    1. Piscina las librerías indexadas duales producidas junto con otras bibliotecas de doble secuencia indexadas. Secuencia de que este tipo de biblioteca generando mucho Lee, por lo menos 250 extremo apareado bp usando el Hiseq2500 o los instrumentos de MiSeq para obtener en el primer caso 250bp PE Lee y en el segundo caso 300 bp PE Lee.

5. Análisis de datos bioinformática mediante la herramienta de Web interactoma-Seq

  1. Analizar la Lee originada de secuenciación biblioteca pFILTER/phagemid/seleccionado-fago con el gasoducto de análisis de datos interactoma-seq. La herramienta web está disponible gratuitamente en la siguiente dirección: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Resultados

El enfoque de filtrado es esquematizado en la figura 1. Puede utilizarse cada tipo de ADN intronless. En la figura 1A se representa la primera parte de lo filtrado: después de la carga en un gel de agarosa o un equipo bioanalyzer, una buena fragmentación de la DNA de interés aparece como un borrón de transferencia de los fragmentos con una distribución de longitud en el tamaño deseado de 150-750 bp. Se da una imagen de repr...

Discusión

La creación de una biblioteca alta calidad muy diversa ORFs filtrada es el primer paso crítico en todo el procedimiento ya que afectará a todos los pasos subsecuentes de la tubería.

Una característica importante de la ventaja de nuestro método es que cualquier fuente de ADN (intronless) (ADNc, ADN genómico, derivado de la PCR o ADN sintético) es conveniente para la construcción de la biblioteca. El primer parámetro que debe tenerse en cuenta es que la longitud de los fragmentos de AD...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del Ministerio de Educación Italiano y la Universidad (2010P3S8BR_002 CP).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Sonopuls ultrasonic homogenizerBandelinHD2070or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo ScientificSM0321or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA LadderThermo Fisher ScientificSM0311or equivalent
Molecular Biology AgaroseBioRad161-3102or equivalent
Green Gel PlusFisher Molecular BiologyFS-GEL01or equivalent
6x DNA Loading DyeThermo Fisher ScientificR0611or equivalent
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704or equivalent
Quick Blunting KitNew England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368813
Streptavidin Magnetic BeadsNew England BiolabsS1420Sor equivalent
QIAquick PCR purification KitQiagen28104or equivalent
EcoRVNew England BiolabsR0195L
Antarctic PhosphataseNew England BiolabsM0289S
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2general lab supplier
Ethanol for molecular biologySigma-AldrichE7023or equivalent
DH5aF' bacteria cellsThermo Fisher Scientific
0,2 ml tubesgeneral lab supplier
1,5 ml tubesgeneral lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettesBiosigma4905020
Electroporator 2510Eppendorf
2x YT mediumSigma-AldrichY1003
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA9518
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
DreamTaq DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificEP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)general lab supplier
150 mm platesgeneral lab supplier
100 mm platesgeneral lab supplier
GlycerolSigma-AldrichG5516
BssHIINew England BiolabsR0199L
NheINew England BiolabsR0131L
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104or equivalent
M13KO7 Helper PhageGE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticusSigma-AldrichK1377
Polyethylene glycol (PEG)Sigma-AldrichP5413
Sodium Cloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014
PBSgeneral lab supplier
Dynabeads Protein G for ImmunoprecipitationThermo Fisher Scientific10003Dor equivalent
MagnaRack Magnetic Separation RackThermo Fisher ScientificCS15000or equivalent
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Nonfat dried milk powderEuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems, Fisher Scientific7958935001
AMPure XP beadsAgencourt, Beckman CoulterA63881
Nextera XT dual Index PrimersIlluminaFC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500Illumina
SpectrophotomerNanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStationAgilent
Forward PCR primergeneral lab supplier5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primergeneral lab supplier5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGSgeneral lab supplier5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGSgeneral lab supplier5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

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