Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Özet

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Özet

Katlama gazetecilere olan katlama ve işlev tehlikeye kötü proteinler veya rasgele açık okuma çerçevesi katlama için erimiş zaman antibiyotik direnci gibi kolayca tanımlanabilen fenotipleri ile proteinlerdir. Biz nerede, TEM-1 β-lactamase (ampisilin direnci veriyor enzim) genomik bir ölçekte kullanarak, biz koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir intronless genom DNA kodlama bölümünden seçebilirsiniz bir strateji geliştirdik. "Domainome" olarak adlandırılan, bir yaklaşım elde edilen protein parçaları de ifade ve çözünür, yapısal/fonksiyonel çalışmalar için uygundur.

Klonlama ve "domainome" bir fajının görüntüleme sistemi içinde görüntüleyerek, biz böylece temel sağlamak istediğiniz bağlama özellikleri (Örneğin, diğer proteinler veya antikor), ile belirli protein etki alanlarını seçmek mümkün olduğunu göstermiştir deneysel bilgi için gen ek açıklama ya da antijen tanıma.

Seçili poliklonal popülasyonda en zenginleştirilmiş klonlar kimliği roman yeni nesil sıralama teknolojileri (NGS) kullanarak elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı biz derin sıralama Analizi kitaplığın kendisi ve çeşitlilik, bereket ve kesin haritalama her seçili parçasının üzerinde tam bilgi sağlamak için seçim çıkışlarını tanıtmak. Burada sunulan protokolleri Kütüphane inşaat, karakterizasyonu ve doğrulama için anahtar adımlar gösterir.

Giriş

Burada, inşaat ve kütüphanelerin katlanmış ve çözünür protein etki alanlarından herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak yelpazesi için yüksek üretilen iş yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşım üç farklı teknolojileri birleştirir: faj ekran, bir katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama (NGS) belirli web aracı ile kullanımı veri analizi için. Yöntemleri protein bazlı araştırma, birçok farklı bağlamlarda kullanılan kimlik ve ek açıklama yeni proteinler/protein etki alanlarının, yapısal ve işlevsel özellikleri bilinen proteinlerin yanı sıra tanımını karakterizasyonu için protein-etkileşim ağı.

Birçok açık sorular protein bazlı araştırma hala mevcut ve en iyi protein üretimi için yöntemler geliştirilmesi araştırma çeşitli alanları için önemli bir ihtiyaç. Örneğin, prokaryotik ve ökaryotik genleri¹binlerce durumu rağmen göreli proteomes ilgili bir harita kodlu proteinleri ve peptidler doğrudan bir ek açıklama ile canlıların büyük çoğunluğu için yok. Tam proteomes kataloğu zaman ve kaynak açısından büyük bir çaba gerektiren zorlu bir hedef olarak ortaya çıkıyor. Deneysel ek açıklama için altın standart tüm açık okuma sözde "ORFeome" Bina çerçeveleri (ORFs) bir genomunun klonlama kalır. Homoloji bilinen faaliyet ilgili genlerle bağlı gen işlevi genellikle atanır ama bu yaklaşım birçok yanlış ek açıklamaları başvuru veritabanları^{2,3,4varlığı nedeniyle kötü doğru 5}. Ayrıca, tespit ve açıklamalı bile için ek çalışmalar karakterizasyonu bolluk, yapısal ve işlevsel özellikleri de dahil olmak üzere farklı bağlamlarda ifade desen açısından elde etmek için gerekli proteinlerdir yanı sıra etkileşim ağları.

Ayrıca, farklı etki, her biri proteinler oluşur bu yana farklı protein işlevleri için katkı ve belirli özellikleri gösteren, çalışma ve bu etki alanlarının tam anlamını daha kapsamlı bir resim, her ikisi de tek izin verebilirsiniz Gen ve tam genom düzeyinde. Bu gerekli tüm bilgileri bir zorlu ve geniş alan protein bazlı araştırma yapar.

Bu açıdan tarafsız ve yüksek işlem hacmi yöntemlerle protein üretimi için önemli bir destek verilebilir. Ancak, bu tür yaklaşımlar, gerekli, önemli yatırım yanında başarısı yeteneği çözünür/stable protein yapıları üretmek için kullanır. Bu büyük bir sınırlayıcı faktör beri bu proteinlerin sadece yaklaşık % 30 başarılı bir şekilde dile getirdi ve deneysel olarak yararlı^6,7,8olmak yeterli düzeylerde üretilen olduğunu tahmin ediyor. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım birlikte bireysel genler örtüşen parçası gösterimini sağlar farklı polipeptitler üretmek için rasgele parçalanmış DNA kullanımına dayanır. Rasgele oluşturulmuş DNA parçalarının sadece küçük bir yüzdesi vardır fonksiyonel ORFs ederken bunların büyük çoğunluğu non-görev (stop kodon onların dizileri içinde varlığı) nedeniyle veya orijinal dışında bir çerçeve içinde un doğal (ORF) için kodlar polipeptitler biyolojik anlamı ile.

Bu sorunlara yönelik olarak bizim grup üzerinde genomik ölçek^9,10,11,12-ebilmek var olmak kullanılmış bir yüksek-den geçerek protein ifade ve etkileşim analizi platform geliştirmiştir. Aşağıdaki teknikler bu platforma entegre: 1) koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir organizma; kodlama DNA kısmından seçmek için bir yöntem 2) Ortaklar etkileşimlerin seçmek için fajının ekran teknolojisi; 3) NGS tamamen altında eğitim bütün interactome karakterize ve klonlar ilgi tanımlamak için; ve 4) veri analizi için kolay ve Kullanıcı dostu bir şekilde Interactome-Seq analizi yapmak herhangi bir Biyoinformatik veya programlama bilgisi olmayan kullanıcılar için bir web aracıdır.

Bu platform kullanımı araştırma alternatif stratejileri önemli avantaj sunar; Her şeyden önce tamamen tarafsız, yüksek-den geçerek ve sıra--dan tüm genom kadar tek bir gen çalışma için modüler bir yöntemdir. Boru hattı ilk adım altında eğitim, sonra derin NGS tarafından karakterize rastgele parçalanmış DNA kitaplıktan oluşturulmasıdır. Bu Kütüphane nerede genler/parçaları ilgi için protein salgılanması (yani, sn lideri) periplasmic uzaya bir sinyal serisi ve TEM1 β-lactamase gen arasında klonlanır mühendislik bir vektör kullanılarak oluşturulur. Füzyon proteini ampisilin direnç ve klonlanmış parçaları çerçeve varsa ampisilin baskı altında hayatta yeteneği görüşmek bu öğeleri ve elde edilen füzyon protein ile doğru katlanmış^{10,13 olduğunu ,14}. Tüm klonlar klonlar sözde "filtre" antibiyotik seçimden sonra kurtarıldı, ORFs ve onları (% 80'den fazla) büyük bir çoğunluğu, gerçek genler⁹' dan türetilmiştir. Ayrıca, bu strateji gücünü tüm filtre ORF klonlar için doğru katlanmış/çözünür protein/etki alanları¹⁵Kodladığınız bulgular yer almaktadır. Gibi birçok klonlar, mevcut Kütüphane ve eşleme aynı bölge/etki alanında, farklı başlangıç ve bitiş noktaları, bu tarafsız, tek adım kimlik çözünür ürünlerinde sonuçlanması olası en küçük parçalar sağlar.

Teknoloji daha fazla bir düzelme NGS kullanımı ile Kütüphane karakterize etmek için verilir. Kombinasyonu bu platform ve veri analizi için belirli web aracının altında eğitim daha geniş analizleri, gerek kalmadan başvuru DNA üzerinde önemli tarafsız bilgi tam nükleotit dizileri ve seçili ORFs konumunu verir veya Deneysel çaba.

Domainome kütüphaneler bir seçim bağlam içine transfer ve fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için evrensel bir araç olarak kullanılan. Biz entegre ve Interactome-Seq aradık fajının ekran teknolojisi süzülmüş ORF phagemid vektör aktarmak ve faj ORF oluşturma yararlanır yüksek üretilen iş protein ifade ve etkileşim analizi platformu Kütüphane. Bir kez bir fajının görüntü içeriği, etki alanları M13 parçacıklar; yüzeyinde görüntülenir protein içine yeniden klonlanmış Bu şekilde domainome kütüphaneler doğrudan etki alanları belirli enzimatik faaliyetleri ile kodlama veya bağlama özellikleri, interactome ağlar profil oluşturma sağlayan gen parçaları için seçilebilir. Bu yaklaşım başlangıçta Zacchi vd tarafından tanımlanmıştır ¹⁶ ve daha sonra birkaç diğer içerik^13,17,18içinde kullanılır.

Protein-protein etkileşim (Maya iki hibrid sistemi ve kütle spektrometresi^19,20dahil) çalışma için kullanılan diğer teknolojileri ile karşılaştırıldığında, bir büyük avantaj sağlıyor fajının sırasında oluşur bağlama ortak amplifikasyon birden fazla mermi seçimi görüntüler. Bu böylece düşük bol bağlayıcı proteinler etki alanları Kitaplığı'nda tanımlaması izin seçim hassasiyeti artar. ORF filtre kitaplığı ile yapılan seleksiyonun verimini daha da işlevsel olmayan klonlar yokluğu nedeniyle artar. Son olarak, teknoloji protein ve protein yemler^{21,22,23,24,25}karşı gerçekleştirilecek seçim sağlar.

Domainome-fajının kütüphaneyi kullanan fajının seçimleri farklı patolojik koşulları olan hastalarda, Örneğin otoimmün hastalıklar¹³, kanser ya da enfeksiyon hastalıkları sera yem olarak gelen antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım altında ağır tanımlamak ve özellikle aynı anda hastaların antikorlar tarafından tanınan antijenleri/epitopları karakterize etmek için izin vererek eğitim hastalığının sözde "antikor imza" elde etmek için kullanılır. Kullanımı diğer yöntemlerine göre faj doğrusal ve konformasyon antijenik epitopları tanımlaması görüntülenmesine izin verir. Belirli bir imza tanımlaması potansiyel olarak anlayış Patogenez, yeni aşı tasarım, yeni tedavi hedefleri tanımlaması ve belirli tanılama ve prognostik araçları gelişimi için önemli bir etkisi olabilir. Ayrıca, çalışma bulaşıcı hastalıklar üzerinde odaklanmış zaman immünojenik proteinler keşfi patojen ekimi bağımsızdır bir büyük avantaj sağlıyor.

Yaklaşımımız katlama gazetecilere genomik bir ölçekte "domainome" seçmek için kullanılabilir onaylar: doğru katlanmış, iyi ifade, çözünür protein etki DNA'ın kodlama bölümünden ve/veya herhangi bir organizmadan cDNA topluluğudur. Bir kez izole protein parçaları gen ek açıklama için de yapısal çalışmalar, antikor epitope eşleme, antijen tanıma, vbgelince gerekli deneysel bilgi veren birçok amaç için yararlıdır. NGS tarafından sağlanan yüksek üretilen iş veri bütünlüğü analiz fajının görüntü kitaplıkları gibi son derece karmaşık örnekleri sağlar ve geleneksel zahmetli malzeme çekme ve bireysel fajının kurtarıldı klonları test kaçınmak için potansiyele sahiptir.

Filtre uygulanmış Kütüphanesi ve aşırı duyarlılık ve güç NGS analiz özellikleri sayesinde aynı anda her etkileşimi doğrudan oluşturmak zorunda kalmadan bir başlangıç ekranı, sorumlu protein etki alanını tanımlamak mümkündür her biri için ek kütüphaneler protein bağlı. NGS sağlar herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak tüm domainome kapsamlı bir tanımını almak için ve veri çözümleme web aracı çok özel alan nitelik özellikleri her iki açıdan bir nitel ve nicel elde sağlar interactome protein etki alanları.

Protokol

1. İnşaat ORF Kütüphanesi (Şekil 1)

1. INSERT DNA hazırlanması
   1. Sentetik veya genomik DNA parçaları hazırlık
      1. Özü/standart yöntemleri²⁶kullanarak DNA arındırmak.
      2. DNA tarafından sonication parçası. Genel öneri başlangıç ile 30 s bakliyat % 100 olarak standart bir sonicator kullanarak güç çıkış.
         Not: Farklı güç ve sonication kez DNA hazırlık için en uygun koşulları ayarlama için Pilot deneyler yapılmalıdır. Her test sonra özel jel elektroforez tarafından DNA parçalarının boyutunu belirler.
      3. Sonicated DNA ile birlikte 100 bp DNA merdivenle % 1.5 özel jel üzerine yükleyin. 5 V/cm 15 dakika çalıştırın ve parçalanmış DNA smear içeren jel kısmını kesip kısa bir elektroforez gerçekleştirin.
      4. Sütunlara göre jel ekstraksiyon kiti ile INSERT DNA arındırmak ve konsantrasyon bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün.
         Not: en az 500 ng arıtılmış ekler sindirilir vektör 1 µg ile 1.3 adımda anlatıldığı gibi bakmaksızın için bu adımı sonra elde. Parçaları hazırlık kalitesini_260nm/A_280nm ve_260nm/A_230nm oranları düşük kaliteli örnek ligasyonu verimliliği etkileyecek bu yana değerlendirerek kontrol edin.
      5. Ekler 5 μg 1 μL hızlı Blunting Kit enzim karışımı ile üretici yönergelerine göre tedavi. Enzimler için 10 dk. örnekleri-20 ° C kadar kullanmak saklanabilir 70 ° C'de Isıtma tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
   2. CDNA gelen parçaları hazırlık
      1. RNA (TRizol veya benzer reaktifler kullanarakÖrneğin, ) standart yöntemlerle ayıklayın.
      2. Ters transkripsiyon gerçekleştirmeden önce Isıtma tarafından mRNA parçası. Son DNA parçası uzunluğu mRNA kaynar zaman ve rasgele astar konsantrasyon tarafından kontrol edilir. Örneğin, örnek için 6 min 95 ° C'de ısı
      3. Üreticinin protokol sonrası herhangi bir kullanılabilir kiti ile Random primerler kullanılarak cDNA hazırlayın.
      4. Hibridizasyon biotinylated poli-dA 37 ° C'de 3 h için ile tarafından poly-dT kuyrukları cDNA tüketmek ve streptavidin manyetik boncuklar Carninci vd tarafından açıklandığı gibi ayrı ¹³
      5. İlişkisiz malzeme yeniden elde etmek ve üreticinin yönergeleri izleyerek sütunlara göre DNA arıtma ile bir kit arındırmak. Bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçmek. Not Adım 1.1.1.4 bakın.
2. Filtreleme vektör hazırlanması
   1. Saf klonlama Özeti 5 µg pFILTER3¹² 10 U EcoRV Restriksiyon enzimi, aşağıdaki üreticinin iletişim kuralı ile vektör.
   2. 2 µL yük (200 ng) ile birlikte 100 sindirilir vektörünün ng sindirilmemiş vektör ve 1 k bp moleküler marker, doğru sindirim için kontrol etmek bir % 1'özel jel üzerinde. Isı Restriksiyon enzimi devre dışı bırakabilirsiniz.
   3. 1/10 birim x fosfataz arabellek ve 1 µL (5 U) fosfataz 10 ekleme ve 37 ° C'de 15 dk. ısı devre dışı bırakabilirsiniz için 65 ° C'de 5 min için kuluçkaya
   4. Özel jel çıkarma tarafından sindirilmiş plazmid arındırmak ve konsantrasyon bir UV spektrofotometre kullanarak ölçün. Örnekleri-20 ° C kadar kullanmak depolanabilir.
3. Tüp ligasyonu ve dönüştürme
   1. Tüp ligasyonu aşağıdaki gibi yapın: 400 sindirilir plazmid 1 µg için eklemek ng fosforile ekler (plazmid: INSERT molar oranı 1:5), 10 x 10 µL T4 DNA ligaz, yüksek konsantrasyon T4 DNA ligaz 100 µL. son bir hacim içinde 2 µL için arabellek kuluçkaya 16 ° C overni tepki sağı gösterir. Isı 65 ° c 10 min için devre dışı.
   2. Sodyum asetat çözüm (3 M, pH 5.2) hacmi 1/10 ekleyerek ligasyonu ürün çökelti ve %2.5 100 etanol hacimleri. Mix ve 20 dk-80 ° C'de dondurmak.
   3. 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
   4. Pelet ve 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj soğuk % 70 etanol 500 µL ekleyin Süpernatant atmak.
   5. Hava kuru Pelet. Çöktürülmüş DNA su 10 µL resuspend.
   6. Bakteri Hücre çoğalmasıyla gerçekleştirin.
      Not: Yüksek verimli hücreleri (yukarıda µg DNA'ın başına 5 x 10⁹ transformants) kullanımı gereklidir. Biz Escherichia coli DH5αF kullanmanızı öneririz ' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi 1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) içinde ev veya satın alınan çeşitli üreticilerin üretilen.
      1. Microcentrifuge boru ve 0.1 cm-Elektroporasyon cuvettes uygun sayıda buza koyun. 1 µL arıtılmış ligasyonu çözüm (DI suda) hücrelerin 25 µL ekleyin ve tüp birkaç kere vur.
      2. DNA hücre karışımı soğuk küvet aktarmak, tezgah üzerinde 2 x dokunun, dış küvet su silin, Elektroporasyon modülü ve basın darbe yerleştirin.
      3. Elektroporasyon 25 µF, 200 Ω ve 1.8 kullanarak standart electroporator makina ile gerçekleştirmek kV. 4-5 ms zaman sabiti olmalıdır.
   7. 1 mL sıvı 2xYT orta herhangi bir antibiyotik olmadan hemen ekleyin, 10 mL tüp aktarmak ve 1 h için 220 rpm'de sallayarak 37 ° C'de büyümeye izin.
   8. Plaka dönüştürülmüş DH5αF' 15 cm 2xYT ağar kaplamalar 34 µg/mL kloramfenikol (pFILTER direnç) ve 25 µg/mL ampisilin (ORFs için seçici marker) ile desteklenmiş ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
   9. Dilutions, 10 cm 2xYT ağar kaplamalar kloramfenikol + ampisilin ve Kütüphane titrasyon gerçekleştirmek için yalnızca, kloramfenikol ile desteklenmiş İnternet üzerinde plaka. Bir gecede 30 ° C'de kuluçkaya
4. pFILTER-ORF Kütüphane doğrulama
   1. 15-20 kolonileri Ekle boyutu dağıtım tahmin etmek için kloramfenikol ve kloramfenikol/ampisilin plakalar üzerinden sınayın. Bir ipucu ile tek kolonileri almak ve onları ayrı olarak 2xYT orta antibiyotikler olmadan 100 µL içinde oranında seyreltin. Bu çözümün 0.5 µL PCR reaksiyon için üreticinin protokol sonrası herhangi bir standart TaqDNA polimeraz ile DNA şablon olarak kullanın.
   2. Bir besleme-T 55 ° C ve 40 bir uzatma süresi kullanarak amplifikasyon 25 döngüleri gerçekleştirmek 72 ° C'de s Astar dizileri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.
   3. PCR ürünleri ile birlikte bir 100 bp DNA merdiven ve Çalıştır % 1.5 özel jel üzerinde yük.
5. pFILTER-ORF Kütüphane koleksiyonu
   1. Taze 2xYT orta 3 mL ekleyerek 150 mm plakalar bakteri toplamak ve onları steril bir sıyırıcı toplamaktan, iyice karıştırın, onları % 20 steril Gliserin ile ek ve küçük aliquots içinde-80 ° C'de depolayın.
   2. Bir aliquot (önce gliserol ilavesi) Kütüphanesi plazmid DNA arındırmak üreticisinin yönergeleri izleyerek bir sütun tabanlı plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak.
   3. Konsantrasyonu UV Spektrofotometre ile ölçmek. Örnekleri-20 ° c kadar saklı olmak phagemid Kütüphane hazırlık ve/veya karakterizasyonu için NGS tarafından kullanılmış.

2. bir Phagemid vektör (Şekil 2) filtre uygulanmış ORFs, subcloning

1. ORF hazırlanması DNA parçalarının filtre
   1. 10 U BssHII ekleme ve üreticinin iletişim kuralı göre kuluçka pFILTER-ORF Kütüphane vektöründen arıtılmış vektörünün 5 µg Restriksiyon enzimi sindirim kadar ayarla. Enzim ve Özet 10 U NheI ile devre dışı bırakabilirsiniz.
   2. Sindirilir DNA ile birlikte 100 bp DNA merdivenle % 1.5 özel jel üzerine yükleyin. 5 V/cm 15 dakika koşmak ya da yeterli çıkarılan parçaları smear ayırt etmek ve bunları içeren jel kısmını kesmek bir kısa Elektroforez gerçekleştirin.
   3. Bir sütun bazlı jel ekstraksiyon kiti ile INSERT DNA arındırmak ve bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçün.
2. Phagemid DNA hazırlanması
   1. 5 µg / saf pDAN5²⁷ ekler gelince Restriksiyon enzimi hazım ayarlayın.
   2. % 0.75 özel jel üzerinde çalışan sindirilir DNA tarafından sindirilmiş plazmid arındırmak ve jel sütunlara göre kiti ile ayıklamak.
   3. Bir UV spektrofotometre kullanarak toplama ölçmek. Örnekleri-20 ° C kadar kullanmak depolanabilir.
3. Kütüphane ligasyonu, dönüştürme ve koleksiyon
   1. Tüp ligasyonu ve pFILTER vektör için açıklandığı gibi dönüştürme gerçekleştirmek.
   2. Plaka dönüştürülmüş DH5αF' 150 mm 2xYT ağar kaplamalar 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş ve gecede 30 ° C'de kuluçkaya
   3. Dilutions, 100 mm 2xYT ağar kaplamalar Kütüphane boyutu belirlemek için 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş İnternet üzerinde plaka.
   4. PCR Kütüphane doğrulanması rastgele çekilen klonların 1.4 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
   5. Phagemid-ORF Kütüphane 150 mm plakalar bakterilerden hasat tarafından toplamak, iyice karıştırın, onları % 20 steril gliserol ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C'de ek.
   6. Plazmid DNA'dan üreticisinin yönergeleri izleyerek bir aliquot kullanarak bir sütun tabanlı plazmid ekstraksiyon kiti Kütüphanesi arındırmak.
   7. UV spektrofotometre konsantrasyonu ölçmek. Örnekleri-20 ° c kadar saklanabilir NGS tarafından karakterizasyonu için kullanılır.

3. fajının Kütüphane hazırlık ve seçim prosedürü

1. Feyc üretim
   1. Hisse senedi aliquot phagemid Kütüphane 2xYT sıvı suyu bir OD_600nm için 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş 10 mL seyreltik 0,05 =.
   2. Steril bir şişesi seyreltilmiş kütüphanede 5 - 10 kat özgün birimi daha büyük büyümek, 37 ° C'de ulaştığı_600nm OD kadar 220 devir / dakikada sallayarak ile 0,5 =.
   3. Bakteri enfeksiyonu 20:1 çokluğu, yardımcı phage (Örneğin M13K07) ile enfekte. Ara sıra ajitasyon (her 10 min) ile 45 dk 37 ° C'de bırakın.
   4. Bakteri, 4000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak, bakteri Pelet 40 ml 2xYT sıvı suyu 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin ile yeniden askıya alma ve 28 ° C'de gece için 220 devir / dakikada sallayarak ile büyümek.
   5. Sonra santrifüj bakteri 4000 x g de gün için 4 ° C'de 20 dk Phages içeren süpernatant toplamak.
2. PEG-yağış, phages.
   1. 0,22 µm hacmi 1/5 PEG/NaCl çözüm (w % 20/6000 PEG, v 2.5 M NaCl) temizlenen phages için filtre ekleyin ve 30-60 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
      Not: Çözüm birkaç dakika sonra başarılı fajının yağış gösteren dumanlı oldu. Çözüm yoğunluğunun kuluçka zamanla artacaktır.
   2. 4 ° C'de 15 dakika 4000 x g, santrifüj Phages bir beyaz küçük Pelet oluşturacak.
   3. 1 mL steril PBS resuspend. 1.5 mL tüp aktarmak ve 4 ° c kirletici bakteri kaldırmak için maksimum hızda 10 dk santrifüj kapasitesi. Kahverengi bir Pelet oluşturacak.
   4. Phages için yeni bir tüp içeren transfer süpernatant. Phages birbirini izleyen titrasyon ve faj seçimi için buz üzerinde tutun.
3. Feyc titrasyon
   1. Feyc çözüm seri dilutions hazırlayın. Feyc çözüm 10 µL 10^-2 seyreltme elde etmek için PBS 990 µL içinde koymak. Tekrar 10^-4 yapmak ve bundan 10^-6 seyreltme elde etmek için bu hazırlık oranında seyreltin.
   2. DH5αF büyümek ' 2xYT sıvı orta 37 ° C'de OD_600nm kadar sallayarak ile bakteri hücreleri = 0,5 ulaşıldığında. 1 mL hazırlanmış bakterilerin 1,5 mL tüp içine aktarmak ve hemen 10^-4 fajının seyreltme 1 µL ile enfekte. 45 dk. tekrar 10^-6 seyreltme için aynı yordamı için 37 ° C'de sallayarak olmadan kuluçkaya.
   3. 100 mm 2xYT levha içine plaka dilutions enfekte bakteri. Plaka gecede 30 ° C'de koymak.
   4. Hastalık bulaşmamış tek DH5αF 100 µL plaka ' 2xYT agar tabağa takıma kirlenme hazırlık yokluğu kontrol etmek için 100 µg/mL ampisilin ile.
   5. Bir gün sonra kolonileri saymak ve faj titresi hesaplayın. Titresi sayısı phages/mL olarak hızlı. Beklenen titresi 10^12-13 phages/ml'dir.
4. Feyc seçimi
   1. Feyc seçimini arıtılmış antikorlar yem olarak kullanarak
      1. Feyc hazırlık PBS - %4 yağsız süt eşit bir hacmi içine 200 µL sulandrarak tarafından phages doyurmak ve yavaş dönüşümlü olarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Bu adımı phages belirsiz bağlama için engellenmesini sağlar. Protein-G kaplamalı manyetik boncuklar 30 µL 1,5 mL tüp aktarın.
      2. Aşağıdaki gibi iki kez yıkayın: PBS 500 µL ekleme, oda sıcaklığında 2 min için yavaş dönme bir tekerlek üzerinde kuluçkaya, boncuklar bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana çizmek ve süpernatant kaldırma.
      3. Yıkanmış boncuk yavaş rotasyon ile Oda sıcaklığında 30 dakika ile doymuş phages kuluçkaya.
      4. Boncuk manyetik alanını kullanarak bir yana çizin. Phages seçim adım için kullanılacak içeren süpernatant toplamak.
      5. Manyetik boncuklar arıtılmış antikorlar conjugating tarafından önceki adımı gerçekleştirirken hazırlayın. Protein-G kaplamalı manyetik boncuklar 30 µL yukarıda açıklandığı gibi yıkayın. PBS 500 µL arıtılmış antikorların 10 µg sulandırmak, yıkanmış boncuk ekleyin ve yavaş rotasyon 45 dk. PBS ile iki kez yıkama için oda sıcaklığında kuluçkaya.
         Not: manyetik boncuklar iki farklı hazırlıkları gerçekleştirme: bir antikor ilgi ile ve bir denetim antikorlar, örneğin, antikorlar ile saf sağlıklı bağış. Antikorlar çıkışlarını analiz adımı sırasında çıkarılan kontrolü ile seçilen antijenleri sırası. Alternatif olarak, manyetik boncuklar denetim antikorlar ile yüklenen (un konjuge boncuk ile kuluçka için iletişim kuralı izleyin) phages ön temizleme adımında gerçekleştirmek için kullanılabilir.
      6. Feyc seçimi: boncuk bir yana bir mıknatıs kullanarak tüp çizmek, son yıkama kaldırmak, phages ekleyin ve yavaş döndürme 90 dk. 5 kere ile 500 µL PBS-0.1% ara-20 ve PBS ile 5 kez yıkama için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      7. İlişkili phages, boncuk DH5αF 1 mL ile karıştırılarak seçimi, çıkışını temsil eden elute' OD₆₀₀ yetiştirilen hücrelerin 0,5 =. 37 ° C'de (her 10 min) ara sıra sallayarak ile 45 dk boncuk ile bakteri kuluçkaya. Çıkış 100 µg/mL ampisilin ile desteklenmiş bir tabakta 150 mm 2xYT agar plaka.
      8. Titrasyon gerçekleştirmek için 100 µL su katılmamış ve farklı dilutions (10^-1 10^-5) çıktının plaka. Ertesi gün 3 mL taze 2xYT orta ekleyerek 150 mm plakalar bakteri toplamak ve onları steril bir sıyırıcı toplamaktan iyice karıştırın, onları % 20 steril Gliserin ile ek ve küçük aliquots içinde-80 ° C'de depolayın.
      9. Bir saniye daha gerçekleştirmek için bir aliquot seçim yuvarlak büyümek. Çamaşır koşullar hariç yukarıda açıklandığı gibi tüm kaydırma yordamı yineleyin. Bu durumda yıkama 10 kez PBS - %1 ara-20 ile (çözüm tüpe dökün ve hemen yeniden dökmek). Daha sonra PBS 500 µL ekleyin ve 10 dk. gerçekleştirmek için PBS ile 10 diğer yıkar döndürme oda sıcaklığında üzerinde kuluçkaya. Seçimi ilk turunda gelince elüsyon adımla devam edin.
      10. Plazmid DNA üreticilerin yönergeleri izleyerek bir sütun tabanlı kit kullanarak çıktı bir aliquot ayıklayın. Derin sıralama için kullanılacak kadar plazmid-20 ° C'de depolayın.
   2. Yem rekombinant proteinler kullanarak fajının seçimi
      1. Feyc hazırlık PBS - %4 yağsız süt eşit bir hacmi içine 200 µL sulandrarak tarafından phages doyurmak ve yavaş dönüşümlü olarak oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
      2. Streptavidin manyetik boncuklar 100 µL ekleyin. Streptavidin bağlama phages seçmek için oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Streptavidin bağlı phages bir yana bir mıknatıs kullanarak boncuk çizerek kaldırın. Önceki adımından süpernatant alıp biotinylated protein (içinde bir konsantrasyon 100-550 nm) ekleyin ve 1 h 30 dk için oda sıcaklığında bir rotor üzerinde kuluçkaya.
      3. Manyetik boncuklar hazırlamak: önceki adımı gerçekleştirirken, PBS ile streptavidin manyetik boncuklar 100 µL yıkama, PBS % 2 yağsız süt resuspend ve döndürme, oda sıcaklığında 30 dk 1 h için kuluçkaya.
      4. Feyc seçimi: çizmek boncuk bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana, PBS - %2 süt çıkarmak ve boncuk faj-protein karışımı ile resuspend. 90 dakika oda sıcaklığında yavaş döndürme kuluçkaya.
      5. Boncuk bir mıknatıs kullanarak tüp bir yana çizmek, süpernatant atmak ve dikkatle %0,1 500 µL PBS ile beş kez yıkayın ara-20. Elüsyon önceki oturumda açıklandığı gibi gerçekleştirin.

4. fajının Kütüphane derin sıralama platformu (Şekil 3)

1. DNA pFILTER-ORF-Kütüphane, pDAN5-ORF-Kütüphane veya seçili fajının kitaplıkları kurtarma ekler
   1. Kitaplığın bir aliquot tezcan, bir spektrofotometre kullanarak ölçmek, DNA ekler tarafından amplifikasyon belirli astar ile yeniden elde etmek.
      Not: ekler kurtarmak için kullanılan astar onların 5' için sonunda adaptörleri dizileri, böylece amplicon havuzları, dizin oluşturma ardışık elde edilen ve DNA ekler doğrudan sıralama Sequencer kullanarak kurtarıldı izin bağlıdır. Onların Malzemeleri tablosırasıdır. Adaptörler gösterilir içinde kalın, ve belirli astar italik olarak gösterilir.
   2. (PFILTER/phagemid/seçili-fajının) kitaplığının 2.5 µL PCR reaksiyon için DNA şablon olarak kullanın.
   3. Aşağıdaki programı kullanın: 95 ° C 3 dakika; 25 95 ° C devredir 30 s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s; 5 dk. tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: Bu noktada bir Bioanalyzer veya TapeStation amplicons boyutunu doğrulayın ve doğru aralıkta olup olmadığını kontrol için 1 µL PCR ürünü çalıştırmak için önerilir.
2. PCR temizlik
   1. Manyetik boncuklar (Örneğin, AMPure) Oda sıcaklığına getirmek. Tüm PCR ürünü 1,5 mL tüp PCR tüpünden aktarın. Girdap manyetik boncuklar için 30 s boncuk eşit dağınık emin olmak için. Manyetik boncuklar 20 µL PCR ürünü, yavaşça pipetting tarafından karışımı içeren her tüpün ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dk'ya sallayarak olmadan kuluçkaya.
   2. Plaka bir manyetik stand 2 dk ya kadar süpernatant temizledi üzerine yerleştirin. Manyetik stand PCR ürünlerle kaldırmak ve süpernatant atın.
   3. Boncuk manyetik standında PCR ürünleri ile taze hazırlanmış %80 etanol ile aşağıdaki gibi yıkayın: taze hazırlanmış %80 etanol 200 µL eklemek her örnek için iyi; Plaka 3 için manyetik stand üzerinde kuluçkaya s; dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
   4. Manyetik stand PCR ürünleri ile ikinci bir etanol yıkama gerçekleştirmek; İkinci yıkama sonunda dikkatle tüm etanol kaldırmak ve boncuk 10 dakikadır kurumasını sağlar.
   5. Manyetik standından PCR ürünleri kaldırmak, 10 mM Tris pH 8,5 17,5 µL her tüpün ekleyin, pipet yavaşça ve aşağı 10 kat, boncuk tam olarak resuspended emin olun. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   6. 2 min için manyetik stand tüpü yerleştirin veya süpernatant temizledi kadar dikkatli bir şekilde yeni bir 1,5 mL tüp için saflaştırılmış PCR ürünleri içeren süpernatant ile 15 µL aktarmak. Hemen Dizin PCR için devam etmeyin arıtılmış PCR ürünleri-15 ° c-25 ° c için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.
3. Dizin PCR
   Not: PCR temizledikten sonra Dizin PCR gerçekleştirin. Nextera XT Dizin setini kullanın; Böylece elde edilen Çift Kişilik Dizin oluşturulmuş kitaplıklar çoğaltılmış Illumina ishal içinde sıralamak mümkün olacaktır.
   1. Tüm 15 μL her ürün içeren yeni bir PCR tüpüne saflaştırılmış ve küme aşağıdaki reaksiyon içeren kadar transfer: saf amplicon ürün, 5 µL Dizin astar 1 ve 5 µL Dizin astar 2, 2 x PCR Mix; 25 µL 15 µL 50 µL son hacmi.
   2. PCR aşağıdaki programı kullanarak bir termal cycler üzerinde gerçekleştirmek: 3 dk, 8 devredir 30 95 ° c için 95 ° C s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s; 72° C 5 dk, sonra 4 ° C'de tutun
4. PCR temizlik 2
   1. Bölümünde 4.2 PCR için temiz kadar aşağıdaki değişikliklerle açıklanan aynı iletişim kuralını uygulayın: ilk adımda manyetik boncuklar 56 µL PCR ürünü her 50 µL için ekleyin.
   2. 10 mM Tris pH 8,5 arıtma son adımında 27,5 µL boncuk resuspend ve (Bu arıtılmış son Kütüphane miktar ve sonra sıralama için hazır olduğunu) yeni bir tüp 25 µL aktarmak.
   3. Kütüphane miktar için devam değil plaka-15 ° c-25 ° c için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.
5. Sıralama kitaplığı kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi
   1. 1:10 1 µL arıtma sonra çalıştırmak, boyutu doğrulamak ve bu son Kütüphane izleme bölge seçerek ölçmek için bir bioanalyzer İnternet üzerinde son seyreltme.
   2. Paralel olarak gerçek zamanlı PCR tarafından Kütüphane miktar bir kütüphane miktar kit başına üreticinin iletişim kuralı kullanarak gerçekleştirin.
6. Sıralama kitaplıkları
   1. Diğer ikili dizin oluşturulmuş sıralama kütüphaneleri ile birlikte üretilen ikili dizin oluşturulmuş kitaplıklar havuz. Bu tür kitaplığı oluşturarak uzun okur, sıra ilk büyük 250bp PE okuma ve ikinci durumda 300 bp PE elde etmek için Hiseq2500 veya MiSeq aletleri kullanarak en az 250 bp eşleştirilmiş sonunda okur.

5. Interactome-Seq Web aracını kullanarak Bioinformatic veri analizi

1. PFILTER/phagemid/seçili-fajının kütüphane sıralama Interactome seq veri analiz boru hattı ile kökenli okuma analiz. Web Araç serbestçe aşağıdaki adresten edinilebilir: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Sonuçlar

Filtreleme yaklaşım Şekil 1' de kapsamlıdır. İntronless DNA her tür-ebilmek var olmak kullanılmış. Şekil 1A ' filtreleme yaklaşım ilk bölümünü temsil edilir: 150-750 BP istenen boyutunda bir uzunluğu dağıtım ile parçalarının bir smear olarak ilgi DNA'ın iyi bir parçalanma bir özel jel veya bir bioanalyzer yükledikten sonra görünür. Elde parçalanmış DNA'ın bir temsilcisi sanal jel görüntüsü v...

Tartışmalar

Boru hattı tüm sonraki adımları etkileyecek bu yana, bir yüksek kaliteli son derece çeşitli ORFs filtre uygulanmış Kütüphane tüm prosedürü içinde belgili tanımlık ilk kritik adım oluşturulmasıdır.

Bizim Yöntem önemli bir avantajlı özelliği herhangi bir kaynak (intronless) DNA (cDNA, genomik DNA, elde edilen PCR veya sentetik DNA) kütüphane yapımı için uygun olmasıdır. Dikkate alınması gereken ilk pFILTER vektör klonlanmış DNA parçalarının uzunluğu geno...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer	Bandelin	HD2070	or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	or equivalent
Molecular Biology Agarose	BioRad	161-3102	or equivalent
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	or equivalent
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	or equivalent
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	or equivalent
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	or equivalent
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2	general lab supplier
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
DH5aF' bacteria cells	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes	general lab supplier
1,5 ml tubes	general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
150 mm plates	general lab supplier
100 mm plates	general lab supplier
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	or equivalent
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Sodium Cloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10003D	or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Nonfat dried milk powder	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP beads	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT dual Index Primers	Illumina	FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation	Agilent
Forward PCR primer	general lab supplier		5’ TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer	general lab supplier		5’ TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS	general lab supplier		5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS	general lab supplier		5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;