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요약

설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

초록

접이식 기자는 쉽게 식별할 수 있는 고기, 항생제 내성, 단백질 또는 임의의 열려있는 독서 프레임을 접는 제대로 융합 될 때 그 접는 및 기능 손상 등으로 단백질. 우리는 어디, 사용 하 여 가장-1 β-lactamase (암 피 실린 저항을 부여 하는 효소) 게놈 규모, 우리 수 선택 잘못 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션 어떤 intronless 유전자의 DNA의 코딩 부분에서 전략을 개발 했습니다. 이 접근 방식, 소위 "domainome"에 의해 얻은 단백질 조각 잘 표현 하 고 수용 성, 구조/기능 연구에 대 한 적합 한 그들을 만드는 것입니다.

복제 페이지 디스플레이 시스템에 직접 "domainome"를 표시 함으로써, 우리 그것은 원하는 바인딩 속성 (예를 들어, 다른 단백질 또는 항 체), 특정 단백질 도메인 선택할 수 필수 제공 보였다가 유전자 주석 또는 항 원 확인. 에 대 한 실험 정보

새로운 차세대 시퀀싱 기술 (NGS)를 사용 하 여 선택한 polyclonal 인구에 가장 풍부한 클론의 id는 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로 라이브러리 자체의 다양성, 풍부 및 정확한 매핑을 선택한 조각의 각에 완전 한 정보를 제공 하도록 선택 출력 깊은 시퀀싱 분석을 소개 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 라이브러리 건설, 특성화 및 유효성 검사에 대 한 주요 단계를 보여줍니다.

서문

여기, 우리는 높은 처리량 방법 건설과 genic/게놈 시작 소스에서 접힌 및 수용 성 단백질 도메인의 라이브러리의 선택에 대 한 설명. 접근은 세 가지 다른 기술: 파지 디스플레이, 데이터 분석을 위한 접는 기자와 특정 웹 도구 다음 세대 시퀀싱 (NGS)의 사용. 식별 및 새로운 단백질/단백질 도메인의 주석, 알려진된 단백질의 구조 및 기능적 속성의 정의의 특성에 대 한 단백질 기반 연구의 많은 다른 컨텍스트에서 메서드를 사용할 수 있습니다. 단백질 상호 작용 네트워크입니다.

많은 관련 질문은 단백질 기반 연구에 여전히 존재 하 고 최적의 단백질 생산을 위한 방법의 개발은 조사의 여러 분야에 대 한 중요 한 필요. 예를 들어 간결한 하 고 진 핵 게놈1의 수천의 가용성에도 불구 하 고 코딩 된 단백질 및 펩 티 드의 직접 주석으로 상대 proteomes의 해당 지도 아직도 대부분의 유기 체에 대 한 누락 된. 완전 한 proteomes의 카탈로그는 도전 목표 시간 및 자원의 점에서 거 대 한 노력을 요구로 떠오르고 있다. 실험적인 주석에 대 한 황금 표준 남아 모든 오픈 독서 프레임 (ORFs)는 게놈의 소위 "ORFeome" 건물의 복제. 일반적으로 유전자 기능에 알려진된 활동의 관련된 유전자 상 동에 따라 할당 됩니다 하지만이 방식은 많은 잘못 된 주석 참조 데이터베이스2,3,4,의 존재로 인해 제대로 정확한 5. 또한, 심지어 식별 및 주석 된 단백질에 대 한 추가 연구는 풍요, 구조적 및 기능적 속성을 포함 하 여 다른 컨텍스트에서 식 패턴의 관점에서 특성을 달성 하는 데 필요한 뿐만 아니라 상호 작용 네트워크입니다.

또한, 이후 단백질 그들 각각의 다른 도메인으로 구성 된 특정 기능을 표시 하 고 다르게 단백질 기능에 기여 하 고, 연구 하 고 이러한 도메인의 정확한 정의 수 있습니다 더 포괄적인 그림을 모두 단일 유전자 전체 게놈 수준에서. 이 모든 필요한 정보를 만든다 단백질 기반 연구 다양 하 고 도전적인 분야를

이 관점에서 중요 한 기여 단백질 생산을 위한 공평 하 고 높은 처리량 방법으로 주어질 수 있었다. 그러나, 상당한 투자가 필요 하 고, 옆에 같은 방식의 성공 성/안정적인 단백질 구조를 생산 하는 능력에 의존 합니다. 이것은 주요 제한 요소 때문에 단백질의 약 30% 수 수 성공적으로 표현을 실험적으로 유용한6,,78될 충분 한 수준에서 생산 추정 되었다. 이 한계를 극복 하는 방법은 함께 개별 유전자의 겹치는 조각 표현을 제공 하는 다른 polypeptides를 생산 하기 위해 무작위로 파편이 된 DNA의 사용을 기반으로 합니다. 임의로 생성 된 DNA 파편의 단지 작은 백분율은 기능적 ORFs 동안 그들의 대다수 (그들의 순서 안에 정지 codons의 존재) 때문에 작동 하지 않습니다 또는 해제 자연 (원래 다른 프레임에 ORF)에 대 한 인코딩 생물학 의미 없이 polypeptides입니다.

이러한 모든 문제를 해결 하려면 우리의 그룹 게놈 규모9,10,,1112에서 사용할 수는 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼 통합 다음 방법: 1); 모든 유기 체에서 DNA의 코딩 부분에서 제대로 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션을 선택 하는 방법 상호 작용;의 파트너를 선택 하기 위한 2) 살 균 소 전시 기술 완전히 특성화 연구 전체 위하여 식별 관심;의 클론을 NGS 3) 그리고 4) 간단 하 고 사용자 친화적인 방식으로 위하여 Seq 분석을 수행 하기 위해 어떤 생물 정보학 또는 프로그래밍 기술 없이 사용자에 대 한 데이터 분석을 위한 웹 도구.

이 플랫폼의 사용 조사;의 대안 전략에 비해 중요 한 장점을 제공합니다 위의 모든 방법은 완전히 편견, 높은 처리량 및 전체 게놈까지 단일 유전자에서 배열 하는 연구에 대 한 모듈입니다. 파이프라인의 첫 단계가 특징인 다음 깊이 NGS 연구에서 무작위로 파편이 된 DNA에서 도서관의 창조 이다. 이 라이브러리는 관심의 유전자/파편 periplasmic 공간 (즉, 초 지도자)으로 단백질 분 비에 대 한 신호 순서와 TEM1 β-lactamase 유전자 사이 복제는 설계 된 벡터를 사용 하 여 생성 됩니다. 융해 단백질 암 피 실린 저항 및 복제 조각 프레임 경우에 암 피 실린 압력 하에서 생존 능력 부여 됩니다 이러한 요소와 결과 융해 단백질은 제대로 접힌된10,13 14. 모든 클론 항생제 선택, 소위 "필터링 클론" 구조, ORFs, 그들 (80%)의 대다수는, 실제 유전자9에서 파생 됩니다. 또한,이 전략의 힘 모든 필터링 ORF 클론 제대로 접혀/수용 성 단백질/도메인15인코딩하는 발견에 있다. 많은 클론, 라이브러리 및 매핑 동일한 지역/도메인에 있는 다른 시작 지점 및 끝 지점을, 수용 성 제품에서 발생 가능성이 최소 조각의 편견, 단일 단계 식별 수 있습니다.

기술에 있는 더 개선 라이브러리 특성 NGS의 사용에 의해 제공 됩니다. 이 플랫폼의 조합을 데이터 분석에 대 한 특정 웹 도구 참조 DNA 더 광범위 한 분석 필요성 없이 연구에 중요 한 편견된 정보 선택한 ORFs의 위치와 정확한 뉴클레오티드 시퀀스에 제공 또는 실험적인 노력입니다.

Domainome 라이브러리 선택 컨텍스트로 전송 고 기능 연구를 수행 하는 범용 악기로 사용 될 수 있습니다. 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼 우리가 통합을 우리 위하여 Seq 라는 활용 살 균 소 전시 기술 phagemid 벡터 필터링된 ORF 전송 및 살 균 소 ORF를 만드는 도서관입니다. 일단 단백질 도메인 M13 입자;의 표면에 표시 되는 페이지 디스플레이 컨텍스트를에 다시 복제 이 방법으로 domainome 라이브러리는 유전자 파편 특정 효소 활동 도메인 인코딩 또는 바인딩 속성을 위하여 네트워크 프로 파일링에 대 한 직접 선택할 수 있습니다. 이 방법은 처음 Zacchi 그 외 여러분 에 의해 기술 되었다 16 및 여러 가지 다른 컨텍스트13,,1718에서 나중에 사용.

(를 포함 하 여 효 모 2 잡종 시스템 및 질량 분석19,20) 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 하는 다른 기술에 비해, 하나의 주요 장점은 살 균 소 중 발생 하는 바인딩 파트너의 증폭 선택의 여러 라운드를 표시 합니다. 이 라이브러리에 있는 낮은 풍부한 바인딩 단백질 도메인의 식별 되므로 선택 감도 증가 합니다. ORF 필터 라이브러리를 사용 하 여 수행 하는 선택의 효율성은 비 기능 클론의 부재로 인해 더욱 증가 된다. 마지막으로, 기술 선택을 단백질과 비 단백질 미끼21,22,23,,2425에 대해 수행 될 수 있습니다.

Domainome-페이지 라이브러리를 사용 하 여 페이지 선택 미끼로 다른 병 적인 조건 환자, 예를 들어 면역 질환13, 암 또는 감염 질환의 혈 청에서 나오는 항 체를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 방법은 대규모 식별 하 고 특성 항 원/epitopes 구체적으로 동시에 환자의 항 체에 의해 인식 수 있도록 연구에서 질병의 소위 "항 체 서명"를 얻기 위해 사용 됩니다. 사용 하는 다른 방법에 비해 살 균 소의 디스플레이 선형 및 구조적 항 원 epitopes의 식별 수 있습니다. 특정 서명 식별 잠재적으로 이해 병 인, 새로운 백신 디자인, 새로운 치료 목표의 확인과 개발 도구의 새로운 및 특정 진단 및 예 후에 대 한 중요 한 영향을 미칠 수 있는. 또한, 연구는 전염 성 질병에 초점을 맞추고 때 주요 이점은 면역성 단백질의 발견은 병원 체 재배에서 독립 이다.

우리의 접근 방식은 접는 기자를 "domainome"를 선택 하는 게놈에 사용할 수 있는 확인: DNA의 코딩 부분에서 제대로 접혀, 잘 표현, 수용 성 단백질 도메인 어떤 유기 체에서 cDNA의 컬렉션. 일단 고립 된 단백질 조각을 유전자 주석 뿐만 구조 연구, 항 체 epitope 매핑, 항 원 확인, 등등에 대 한 필수적인 실험 정보를 제공 하는 많은 목적을 위해 유용 하다. NGS에서 제공 하는 높은 처리량 데이터의 완전성 살 균 소 전시 도서관, 등 매우 복잡 한 샘플의 분석을 가능 하 게 그리고 전통적인 힘 드는 따기 및 개별 페이지 구조 클론의 테스트 회피 가능성을 보유 하고있다.

기능 필터링 된 라이브러리의와 극단적인 감도 그리고 NGS 분석의 힘을 동시에 만들 필요 없이 초기 화면에서 직접 각 상호 작용의 책임 단백질 도메인 식별 가능 하다 각 추가 라이브러리 바인딩 단백질. NGS genic/게놈 시작 소스 전체 domainome의 포괄적인 정의를 허용 하 고 데이터 분석 웹 도구는 매우 구체적인 특성 모두는 질적, 양적 관점에서의 획득은 위하여 단백질의 도메인입니다.

프로토콜

1. ORF 라이브러리 (그림 1)의 건설

  1. 삽입 DNA 준비
    1. 합성 또는 genomic DNA에서 조각 준비
      1. 표준 방법26를 사용 하 여 DNA를 추출/정화.
      2. DNA를 조각화 하 여 쥡니다. 100%에 30 s 펄스와 일반적인 제안 시작으로 표준 sonicator를 사용 하 여 경우 전원 출력.
        참고: 파일럿 실험 할 수와 다른 전원 쥡니다 번 DNA 준비에 대 한 최적의 조건을 설정할. 각 테스트 후 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 조각의 크기를 결정 합니다.
      3. 100 bp DNA 사다리 함께 1.5 %agarose 젤에 sonicated DNA를 로드 합니다. 5 V/㎝ 15 분에서 실행 하 고 조각난된 DNA의 얼룩을 포함 하는 젤의 부분을 잘라 짧은 전기 영동을 수행 합니다.
      4. 열 기반 젤 추출 키트 삽입 DNA를 정화 하 고 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정.
        참고: 적어도 500 순화 삽입의 ng는 1.3 단계에서 설명한 대로 소화 벡터의 1 µ g와 출혈을이 단계 후에 얻을 수 있어야. 샘플의 낮은 품질 결 찰 효율에 영향을 미칠 것입니다 이후260nm/A280nm 그리고260nm/A230nm 비율을 평가 하 여 조각 준비의 품질을 확인 합니다.
      5. 제조업체의 지침에 따라 빠른 Blunting 키트 효소 혼합의 1 μ와 삽입의 5 μ g를 취급 합니다. 10 분 샘플 사용까지-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 위한 70 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.
    2. CDNA에서 조각 준비
      1. 표준 방법 (예: TRizol 또는 유사한 시 약을 사용 하 여) RNA를 추출 합니다.
      2. 반전 녹음 방송을 수행 하기 전에 난방에 의해 mRNA를 조각화. 최종 DNA 조각 길이 mRNA 끓는 시간과 임의의 뇌관 농도 의해 제어 됩니다. 95 ° c.에 6 분 예 열 샘플
      3. 무작위 뇌관을 사용 하 여 모든 사용 가능한 키트 제조 업체의 프로토콜을 따르고 cDNA를 준비 합니다.
      4. Biotinylated 폴 리-다 37 ° C에서 3 h와 교 잡에 의해 폴 리 dT 꼬리의 cDNA를 고갈 그리고 Carninci 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 streptavidin 자석 구슬에 별도 13
      5. 바인딩되지 않은 자료를 복구 하 고 제조업체의 지침에 따라 열 기반 DNA 정제 키트와 함께 정화. UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 합니다. 1.1.1.4 단계에서 참고를 참조 하십시오.
  2. 필터링 벡터의 준비
    1. 순화 된 복제의 다이제스트 5 µ g 벡터 10 U의 EcoRV 제한 효소, 다음 제조 업체의 프로토콜 pFILTER312 .
    2. 2 µ L 로드 (200 ng) 100 함께 소화 벡터의 소화 되지 않은 벡터 및 1 k 혈압 분자 마커, 적절 한 소화를 위한 확인 하기 1 %agarose 젤에 ng. 열 제한 효소 비활성화.
    3. 인산 가수분해 효소와 인산 가수분해 효소의 1 µ L (5 U) x 10의 1/10 볼륨을 추가 하 고 37 ° C에서 65 ° c.에 5 분 동안 비활성화 15 분 열에 대 한 품 어
    4. Agarose 젤에서 추출 하 여 소화 플라스 미드 정화 하 고 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 한다. 샘플 사용까지-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 결 찰 및 변환
    1. 다음과 같이 결 찰을 수행: 소화 플라스 미드의 1 µ g 추가 400 phosphorylated 삽입 (플라스 미드: 삽입 어 금 니 비율 1:5), 10 x 10 µ L T4 DNA 리가, 2 µ L의 높은 농도 T4 DNA 리가 100 µ L. 마지막 볼륨에 대 한 버퍼 품 어 16 ° C overni에 반응 ght입니다. 10 분 동안 65 ° C에서 열 비활성화.
    2. 나트륨 아세테이트 솔루션 (3m, pH 5.2)의 1/10 볼륨을 추가 하 여 결 찰 제품을 침전 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨. 혼합 및 20 분에 대 한-80 ℃에서 동결.
    3. 4 ° c.에 20 분 동안 최대 속도로 원심 폐기는 상쾌한.
    4. 펠 릿을 최대 속도에서 4 ° c.에 20 분 동안 원심 추 70% 에탄올 500 µ L를 추가 폐기는 상쾌한.
    5. 공기 건조는 펠 릿. 물 10 µ L로 침전 된 DNA를 resuspend.
    6. 세균성 세포 electroporation을 수행 합니다.
      참고: (DNA의 µ g 당 5 x 109 transformants) 이상 높은 효율 전지를 사용 하 여는 필요 합니다. 대장균 DH5αF를 사용 하는 것이 좋습니다 ' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 티 1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) 생산 집에서 또는 여러 제조 업체에서 구입.
      1. 얼음에 적절 한 수의 microcentrifuge 튜브와 0.1 cm electroporation 큐 벳을 놓습니다. 셀의 25 µ L을 정화 결 찰 솔루션 (디 물)에서 1 µ L을 추가 하 고 튜브를 몇 번 끄 적.
      2. 차가운 베트에 DNA 세포 혼합물을 전송, 2 x 수조에 수돗물, 베트의 외부에서 물을 닦아, electroporation 모듈 및 보도 펄스에.
      3. 25 µ F, 200 Ω, 1.8을 사용 하 여 표준 electroporator 기계 electroporation 수행 kV. 4-5 ms 시간 상수 여야 합니다.
    7. 즉시 어떤 항생제 없이 액체 2xYT 매체의 1 mL, 10 mL 튜브에 전송 더하고 1 h 220 rpm에서 떨고 37 ° C에서 성장할 수 있게.
    8. 판 변형 DH5αF' 15 c m 2xYT에 한 천 배지 34 µ g/mL 페니 (pFILTER 저항)와 25 µ g/mL 암 피 실린 (선택적 마커 ORFs) 보충 하 고 하룻밤 30 ° c.에 품 어
    9. 10 cm 2xYT 한 천 배지 라이브러리 적정 수행 하만, 페니 페니 + 암 피 실린과 보완에 라이브러리의 희석 플레이트. 30 ° c.에서 밤새 품 어
  4. pFILTER ORF 라이브러리 유효성 검사
    1. 삽입 크기 분포 추정 페니, 페니/암 피 실린 접시에서 15-20 식민지를 테스트 합니다. 팁 단일 식민지를 선택 하 고 항생제 없이 2xYT 매체의 100 µ L에서 별도로 그들을 희석. 사용이 솔루션의 0.5 µ L DNA 템플렛으로 PCR 반응에 대 한 모든 표준 TaqDNA 중 합 효소 제조 업체의 프로토콜을 따르고.
    2. 55 ° C와 40 시간의 확장의 어 닐 링 T를 사용 하 여 증폭의 25 주기를 수행 72 ° c.에 s 뇌관 순서 자료의 테이블에에서 제공 됩니다.
    3. 100 bp DNA 사다리 및 실행 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품을 로드 합니다.
  5. pFILTER ORF 라이브러리 컬렉션
    1. 150 m m 플레이트에서 신선한 2xYT 매체의 3 mL를 추가 하 여 박테리아를 수집 하 고 메 마른 스 크레이 퍼와 함께 그들을 수확, 철저 하 게 혼합, 20% 살 균 글리세롤과 그들을 보충 하 고 작은 aliquots에-80 ° C에서 저장.
    2. (전에 글리세롤의 추가) 라이브러리의 한 약 수에서 플라스 미드 DNA를 정화 제조업체의 지침에 따라 열 기반 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여.
    3. UV 분 광 광도와 농도 측정 합니다. 샘플까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다 NGS phagemid 라이브러리 준비 및/또는 특성에 사용할 수.

2. subcloning 필터링된 ORFs Phagemid 벡터 (그림 2)에서

  1. ORF의 준비 된 DNA 조각
    1. BssHII의 U 10을 추가 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 잠복기 pFILTER ORF 라이브러리 벡터에서 순화 된 벡터의 5 µ g의 금지 효소 소화를 설정 합니다. 비활성화는 효소와 10 U NheI의 다이제스트.
    2. 100 bp DNA 사다리 함께 1.5 %agarose 젤에 소화 DNA를 로드 합니다. 짧은 전기 이동 법에서 15 분 동안 5 V/cm 또는 충분히 삭제 파편의 얼룩을 구별 하 여 그들을 포함 하는 젤의 부분을 잘라 실행을 수행 합니다.
    3. 열 기반 젤 추출 키트 삽입 DNA를 정화 하 고 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정.
  2. Phagemid DNA의 준비
    1. 금지 효소 소화는 삽입에 관해서는 순화 pDAN527 의 5 µ g의 설정.
    2. 0.75 %agarose 젤에 실행 소화 DNA에 의해 소화 플라스 미드 정화 하 고 열 기반 키트 젤에서 추출.
    3. UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 합니다. 샘플 사용까지-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 라이브러리 결 찰, 변환 및 컬렉션
    1. 결 찰 및 변환 pFILTER 벡터에 대 한 설명 된 대로 수행 합니다.
    2. 판 변형 DH5αF' 150 m m에 2xYT 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 보충 하 고 하룻밤 30 ° c.에 품 어
    3. 100 mm 2xYT 한 천 배지 라이브러리 크기를 확인 하려면 100 µ g/mL 암 피 실린 보충에 라이브러리의 희석 플레이트.
    4. 1.4 단계에서 설명한 대로 무작위로 고른된 클론의 PCR에 의해 도서관 유효성 검사를 수행.
    5. 150 mm 접시에서 박테리아를 수확 하 여 phagemid ORF 라이브러리를 수집, 철저 하 게 혼합, 20% 살 균 글리세롤과 작은 aliquots에-80 ° C에 게 그들을 보충.
    6. 제조업체의 지침에 따라 열 기반 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 라이브러리의 한 약 수에서 플라스 미드 DNA를 정화.
    7. UV 분 광 광도 계에서 농도 측정 합니다. 샘플까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다 NGS 특성화에 대 한 사용 될.

3. 살 균 소 도서관 준비 및 선택 절차

  1. 살 균 소 생산
    1. 2xYT 액체 국물 OD600nm 위해서는 100 µ g/mL 암 피 실린 보충의 10 mL로 phagemid 라이브러리의 주식 약 수를 희석 = 0.05.
    2. 메 마른 플라스 크에 희석된 도서관을 원래 볼륨 보다 5-10 배 더 큰 성장, 37 ° C에 도달 명이600nm 까지 220 rpm에 떨고 = 0.5.
    3. 다양 한 감염 20: 1에서 도우미 페이지 (예: M13K07)와 박테리아 감염. 가끔 동요 (매 10 분)와 함께 45 분 동안 37 ° C에 둡니다.
    4. 실 온에서 10 분 동안 4000 x g에서 박테리아 원심 상쾌한 삭제, 다시 2xYT 액체 국물 100 µ g/mL 암 피 실린과 50 µ g/mL 대 보충의 40 mL에 박테리아 펠 릿을 일시 중단 하 고 하룻밤을 위해 220 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 성장.
    5. 다음날, 4000 x g에서 원심 분리기 박테리아 4 ° c.에서 20 분 페이지를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
  2. 못-페이지의 강 수
    1. 0.22 μ m의 1/5 볼륨 필터링 페그/NaCl 솔루션 (20 w/v % 말뚝 6000, 2.5 M NaCl) 삭제 페이지에 추가 하 고 30-60 분 동안 얼음에 품 어.
      참고: 솔루션이 되었다 연기 몇 분 후, 나타내는 성공적인 페이지 강 수 있습니다. 솔루션의 흐려 보육 시간 동안 증가 합니다.
    2. 4 ° c.에 15 분 동안 4000 x g에서 원심 분리기 페이지의 흰색 작은 펠 릿을 형성 합니다.
    3. 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend. 1.5 mL 튜브에 전송 및 오염 물질 박테리아 제거를 최대 속도로 10 분 4 ° C에서 원심. 브라운 펠 릿을 형성 합니다.
    4. 새로운 튜브 표면에 뜨는 포함 페이지를 전송 합니다. 연속 적정 및 살 균 소 선택에 대 한 얼음에 페이지를 유지 합니다.
  3. 살 균 소 적정
    1. 살 균 소 솔루션의 직렬 희석을 준비 합니다. 10-2 희석을 얻기 위해 PBS의 990 µ L에서 살 균 소 솔루션의 10 µ L를 넣어. 다시 희석 10-4 를이 가져올 10-6 희석이이 준비.
    2. 성장 DH5αF' 2xYT OD600nm 까지 떨고 37 ° C에 액체 매체에 박테리아 세포 = 0.5에 도달. 1.5 mL 튜브에 준비 된 박테리아의 1 mL를 전송 하 고 1 µ L 10-4 페이지 희석의 즉시 감염. 45 분 반복 10-6 희석에 대 한 동일한 절차에 대 한 37 ° C에서 흔들어 없이 품 어.
    3. 100 mm 2xYT 격판덮개에 감염 된 박테리아의 플레이트 희석 30 ° C에서 하룻밤 접시를 넣어.
    4. 감염 되지 않은 DH5αF의 100 µ L 플레이트 ' 2xYT agar 접시에 준비에 오염의 부재를 확인 100 µ g/mL 암 피 실린 보충.
    5. 후 일 식민지의 수를 계산 하 고 살 균 소 titer를 계산. Titer 페이지/mL의 수로 표현 한다. 예상된 titer 1012 13 페이지/mL 이다.
  4. 살 균 소 선택
    1. 항 체 정화 하는 미끼로 사용 하는 페이지 선택
      1. 200 µ L의 PBS-4% 무 지방 우유의 동등한 볼륨으로 살 균 소 준비 diluting 하 여 페이지를 포화 하 고 느린 회전에 실 온에서 1 h에 품 어. 이 단계는 불특정 바인딩을 위해 페이지의 차단 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 단백질 G 코팅된 자석 구슬의 30 µ L를 전송.
      2. 다음과 같이 두 번 세척: PBS의 500 µ L, 실 온에서 2 분에 대 한 느린 회전 바퀴에 품 어, 구슬 자석을 사용 하 여 튜브의 한쪽에 그릴 더하고 제거는 상쾌한.
      3. 느린 회전 실 온에서 30 분 동안 씻어 구슬과 포화 페이지를 품 어.
      4. 구슬 한쪽 자기장을 사용 하 여 그립니다. 선택 단계에 사용할 페이지를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
      5. 순화 된 항 체를 변화 하 여 이전 단계를 수행 하는 동안 자석 구슬을 준비 합니다. 위에서 설명한 대로 단백질 G 코팅된 자석 구슬의 30 µ L를 씻어. PBS의 500 µ L에서 순화 된 항 체의 10 µ g을 희석, 세척된 구슬에 추가 하 고 45 분 PBS로 두번 세척에 대 한 실 온에서 천천히 회전에서 품 어.
        참고: 수행 자석 구슬의 2 개의 다른 준비: 관심의 항 체와 제어 항 체, 예, 항 체와 함께 한 건강 한 기증자 로부터 정화. 항 원 항 체는 출력의 분석 단계에서 뺀 컨트롤과 선택의 시퀀스입니다. 또는, 자석 구슬 제어 항 체와 함께 로드 (유엔 활용 구슬 보육에 대 한 프로토콜에 따라) 페이지의 전 개간 단계를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.
      6. 페이지 선택: 구슬 자석을 사용 하 여 튜브의 한쪽에 그릴, 마지막 세척 제거, 페이지 추가 및 느린 회전 90 분 세척 5 회 PBS-0.1% 트윈-20의 500 µ L와 함께 5 번 PBS에 대 한 실 온에서 품 어.
      7. 바운드 페이지, 구슬 DH5αF의 1 mL와 혼합 하 여 선택 항목의 출력을 나타내는 elute' 셀 세600 성장 = 0.5. 가끔 흔들어 (매 10 분)와 함께 37 ° C에서 45 분 동안 구슬 박테리아를 품 어. 150 mm 2xYT 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 보충에 출력 접시
      8. 적정 수행을 100 µ L undiluted의 고 출력 (10-1 10-5)의 다른 희석의 접시. 후 일 수집 박테리아 150 m m 플레이트에서 신선한 2xYT 매체의 3 mL를 추가 하 여 하 고 철저 하 게 혼합 20% 살 균 글리세롤과 그들을 보충 하 고 작은 aliquots에-80 ° C에서 저장 살 균 스 크레이 퍼와 함께 그들을 수확.
      9. 다시 두 번째 수행을 한 약 수 성장 선택의 라운드. 세척 조건 제외 하 고 위에서 설명한 대로 모든 패닝 절차를 반복 합니다. 이 경우에 씻어 10 시간 PBS-1% 트윈-20 (튜브에 솔루션을 부 어 하 고 즉시 다시 부 어). 그런 다음 PBS의 500 µ L을 추가 하 고 PBS와 다른 10 세척을 수행 하는 10 분 동안 실내 온도에 회전에 품 어. 선택의 첫 번째 라운드에 관해서는 차입 단계로 진행 합니다.
      10. 제조업체의 지침에 따라 열 기반 키트를 사용 하 여 출력의 한 약 수에서 플라스 미드 DNA를 추출 합니다. 그것은 깊은 시퀀싱을 위해 사용 될 것입니다 때까지-20 ° C에서 플라스 미드를 저장 합니다.
    2. 살 균 소 선택 미끼 재조합 단백질으로 사용 하 여
      1. 200 µ L의 PBS-4% 무 지방 우유의 동등한 볼륨으로 살 균 소 준비 diluting 하 여 페이지를 포화 하 고 느린 회전에 실 온에서 1 h에 품 어.
      2. Streptavidin 자석 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. Streptavidin 바인딩 페이지를 선택 하 실 온에서 1 h에 품 어. 한쪽에 자석을 사용 하 여 구슬을 그려서 streptavidin 바인딩된 페이지를 제거 합니다. 이전 단계에서 표면에 뜨는 걸릴 biotinylated 단백질 (100-550 nM의 농도)에 추가 하 고 1 시간에 30 분 동안 실내 온도에 회전자에 품 어.
      3. 마그네틱 구슬 준비: 이전 단계를 수행 하는 동안 PBS와 streptavidin 자석 구슬의 100 µ L를 세척, PBS 2% 무 지방 우유에 resuspend 및 회전 1 시간에 30 분 동안 실 온에서 품 어.
      4. 페이지 선택: 구슬 자석을 사용 하 여 튜브의 1 개의 측에, PBS-2% 우유 제거 그리고 살 균 소 단백질 혼합으로 구슬 resuspend. 90 분 동안 실 온에서 천천히 회전 품 어.
      5. 구슬 자석을 사용 하 여 튜브의 1 개의 측에, 삭제는 상쾌한 그리고 세척 그들 신중 하 게 500 µ L의 PBS와 5 번 0.1% 트윈-20. 이전 세션에서 설명 된 대로 차입을 수행 합니다.

4. 페이지 라이브러리 깊은 시퀀싱 플랫폼 (그림 3)

  1. DNA 삽입 pFILTER ORF 라이브러리, pDAN5-ORF-도서관 또는 선정 페이지 라이브러리에서 복구
    1. 도서관의 한 약 수를 녹여는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량, 특정 한 뇌관으로 증폭 하 여 DNA 삽입을 복구.
      참고: 삽입을 구출 하는 데 사용 하는 뇌관 amplicon 풀의 연속 색인 하 고 DNA 삽입의 직접 시퀀싱은 시퀀서를 사용 하 여 복구 되므로 어댑터 시퀀스에 그들의 5' 끝에 연결 됩니다. 그들의 순서는 테이블의 자료에. 어댑터에 굵게 표시 됩니다 특정 뇌관 기울임꼴로 표시 됩니다.
    2. DNA 템플렛으로 (pFILTER/phagemid/선택-살 균 소) 도서관의 2.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응에 대 한.
    3. 다음 프로그램을 사용 하 여: 95 ° C 3 분;에 대 한 30 95 ° C의 25 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s; 72 ° C에 4 ° c.에서 5 분 대기에 대 한
      참고:이 시점에서 그것은 것이 좋습니다는 amplicons의 크기를 확인 하 고 올바른 범위에 다는 것을 확인 하는 Bioanalyzer 또는 TapeStation에 PCR 제품의 1 µ L를 실행.
  2. PCR 정리
    1. 실내 온도 자석 구슬 (예: AMPure)를가지고. 1.5 mL 튜브에 PCR 튜브에서 전체 PCR 제품을 전송. 와 동 30 자석 구슬 구슬은 균등 하 게 분산 되도록 s. PCR 제품, 부드럽게 pipetting으로 혼합을 포함 하는 각 관에 자석 구슬의 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 흔들어 하지 않고 실 온에서 품 어.
    2. 2 분 동안 나는 상쾌한이 지워질 때까지 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다. 마그네틱 스탠드에 PCR 제품, 제거와 삭제는 상쾌한.
    3. 마그네틱 스탠드에 PCR 제품 갓된 80% 에탄올과 구슬 같이 세척: 갓된 80% 에탄올의 200 µ L 각 샘플 잘;를 추가 3 자석 스탠드에 접시를 품 어 s; 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
    4. 두 번째 에탄올 세척, 마그네틱 스탠드;에 PCR 제품을 수행합니다 두 번째 세척의 끝에 신중 하 게 모든 에탄올을 제거 하 고 구슬 10 분 동안 건조를 허용.
    5. 마그네틱 스탠드에서 PCR 제품을 제거, 10 mM Tris pH 8.5의 17.5 µ L 각 관에, 부드럽게를 플라스틱 더하고 아래로 10 번 구슬 완전히 resuspended는 있는지 확인. 2 분 동안 실 온에서 품 어.
    6. 2 분 동안 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하거나는 상쾌한이 지워질 때까지 신중 하 게 새로운 1.5 mL 튜브에 순화 된 PCR 제품을 포함 하는 상쾌한의 15 µ L을 전송. 즉시 색인 PCR에 진행 하지 않는 경우 최대 1 주일에 대 한-25 ° c-15 ° C에서 순화 된 PCR 제품을 저장 합니다.
  3. 인덱스 PCR
    참고: PCR 정리 후 인덱스 PCR를 수행 합니다. 사용 Nextera XT 인덱스 장비; 따라서 그것은 시퀀싱 결과 이중 인덱싱된 라이브러리 다중화 Illumina 실행 내에서 가능할 것 이다.
    1. 각 제품을 포함 하는 15 μ 새로운 PCR 튜브에 정화 하 고 다음 반응 포함 모든 전송: 정화 amplicon 제품, 인덱스 뇌관 1 5 µ L 및 인덱스 뇌관 2, 2 x PCR 혼합; 25 µ L의 5 µ L의 15 µ L 50 µ L의 최종 볼륨입니다.
    2. 다음 프로그램을 사용 하 여 열 cycler에 PCR를 수행: 3 분, 30 95 ° C의 8 주기 동안 95 ° C s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s; 72 ° C 5 분, 다음 4 ° c.에서 개최
  4. PCR 정리 2
    1. 설명 섹션 4.2에에서 PCR 대 청소 다음 변경 같은 프로토콜에 따라: 첫 번째 단계에서 PCR 제품의 각 50 µ L에 자석 구슬의 56 µ L을 추가.
    2. 정화의 마지막 단계에서 10 mM Tris pH 8.5의 27.5 µ L에 구슬 resuspend 하 고 새 튜브 (이것은 정량화 한 다음 시퀀싱 준비 정화 최종 라이브러리)을 25 µ L를 전송.
    3. 라이브러리 정량화를 진행 하지 경우 최대 1 주일에 대 한-25 ° c-15 ° C에서 접시를 저장 합니다.
  5. 시퀀싱 라이브러리의 질적 및 양적 평가
    1. 정화, 후 실행 1 µ L 1시 10분의 크기를 확인 하 고 최종 라이브러리 추적의 영역을 선택 하 고 그것을 계량 하는 bioanalyzer에 마지막 라이브러리의 희석.
    2. 동시에 제조 업체의 프로토콜 당 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 여 실시간 PCR에 의해 도서관 정량화를 수행 합니다.
  6. 시퀀싱 하는 라이브러리
    1. 다른 듀얼 인덱싱된 시퀀싱 라이브러리 함께 생산 듀얼 인덱싱된 라이브러리 풀. 시퀀스를 생성 하 여 라이브러리의이 종류 오래 읽고, 첫 번째 케이스 250bp PE 읽기 및 두 번째 경우 300 bp PE는 Hiseq2500 또는 MiSeq 계기를 사용 하 여 적어도 250 bp 짝된 끝 읽습니다.

5. 위하여-Seq 웹 도구를 사용 하 여 Bioinformatic 데이터 분석

  1. 읽기 위하여 seq 데이터 분석 파이프라인 pFILTER/phagemid/선택-살 균 소 도서관 시퀀싱에서 유래 분석. 웹 도구는 다음 주소에서 자유롭게 사용할 수: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

결과

필터링 접근은 그림 1에서 도식화. Intronless DNA의 각 종류를 사용할 수 있습니다. 그림 1A 에서 필터링 접근의 첫 번째 부분 표시 됩니다: agarose 젤에 있는 bioanalyzer 후, 관심의 DNA의 좋은 조각 조각 150-750 bp의 원하는 크기에 길이 분포의 얼룩으로 나타납니다. 얻은 조각난된 DNA의 대표적인 가상 젤 이미지는 주어진 다. 조각 agarose ?...

토론

높은 품질 높은 다양 한 ORFs 필터링 된 도서관의 창조 때문에 파이프라인의 모든 이후 단계에 영향을 미칠 것입니다 전체 절차의 첫 번째 중요 한 단계입니다.

우리의 방법의 중요 한 유리한 기능 (intronless) DNA (cDNA, genomic DNA, PCR 파생 이나 합성 DNA)의 모든 소스 라이브러리 건설에 적합 이다. 고려 되어야 하는 첫 번째 매개 변수는 pFILTER 벡터에 복제 하는 DNA 파편의 길이 게놈 또...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 이탈리아 교육부 및 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CP에 2010P3S8BR_002).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Sonopuls ultrasonic homogenizerBandelinHD2070or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo ScientificSM0321or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA LadderThermo Fisher ScientificSM0311or equivalent
Molecular Biology AgaroseBioRad161-3102or equivalent
Green Gel PlusFisher Molecular BiologyFS-GEL01or equivalent
6x DNA Loading DyeThermo Fisher ScientificR0611or equivalent
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704or equivalent
Quick Blunting KitNew England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368813
Streptavidin Magnetic BeadsNew England BiolabsS1420Sor equivalent
QIAquick PCR purification KitQiagen28104or equivalent
EcoRVNew England BiolabsR0195L
Antarctic PhosphataseNew England BiolabsM0289S
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2general lab supplier
Ethanol for molecular biologySigma-AldrichE7023or equivalent
DH5aF' bacteria cellsThermo Fisher Scientific
0,2 ml tubesgeneral lab supplier
1,5 ml tubesgeneral lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettesBiosigma4905020
Electroporator 2510Eppendorf
2x YT mediumSigma-AldrichY1003
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA9518
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
DreamTaq DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificEP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)general lab supplier
150 mm platesgeneral lab supplier
100 mm platesgeneral lab supplier
GlycerolSigma-AldrichG5516
BssHIINew England BiolabsR0199L
NheINew England BiolabsR0131L
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104or equivalent
M13KO7 Helper PhageGE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticusSigma-AldrichK1377
Polyethylene glycol (PEG)Sigma-AldrichP5413
Sodium Cloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014
PBSgeneral lab supplier
Dynabeads Protein G for ImmunoprecipitationThermo Fisher Scientific10003Dor equivalent
MagnaRack Magnetic Separation RackThermo Fisher ScientificCS15000or equivalent
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Nonfat dried milk powderEuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems, Fisher Scientific7958935001
AMPure XP beadsAgencourt, Beckman CoulterA63881
Nextera XT dual Index PrimersIlluminaFC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500Illumina
SpectrophotomerNanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStationAgilent
Forward PCR primergeneral lab supplier5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primergeneral lab supplier5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGSgeneral lab supplier5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGSgeneral lab supplier5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

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