Interactome-Seq : Un protocole pour la Construction de la bibliothèque de Domainome, de Validation et de sélection par Phage Display et de prochaine génération séquençage

Résumé

Les protocoles décrits permettent la construction, la caractérisation et la sélection (contre une cible de choix) d’une bibliothèque « domainome » fabriquée à partir de n’importe quelle source d’ADN. Ceci est réalisé par un pipeline de recherche qui combine différentes technologies : affichage de phage, reporter pliant et séquençage de génération suivant avec un outil web pour l’analyse des données.

Résumé

Pliage de reporters sont des protéines avec des phénotypes facilement identifiables, telles que la résistance aux antibiotique, dont pliage et la fonction est compromise lorsque fusionnés mal pliage des protéines ou des cadres ouverts de lecture aléatoire. Nous avons mis au point une stratégie où, à l’aide de TEM-1 β-lactamase (l’enzyme conférant la résistance à l’ampicilline) sur une échelle génomique, nous pouvons sélectionner collections de domaines protéiques correctement pliée de la partie codante de l’ADN de n’importe quel génome intronless. Les fragments de protéines obtenues par cette approche, la soi-disant « domainome », sera bien exprimés et solubles, ce qui les rend appropriés pour des études structurales et fonctionnelles.

Par clonage et en affichant le « domainome » directement dans un système d’affichage de phage, nous avons montré qu’il est possible de sélectionner les domaines de la protéine spécifique avec les propriétés de liaison souhaitée (par exemple, aux autres protéines ou à des anticorps), ce qui essentiel données expérimentales pour l’identification des gènes annotation ou antigène.

L’identification des clones plus enrichis dans une population polyclonale choisie est possible en utilisant les technologies de nouvelle génération séquençage (NGS). Pour ces raisons, nous introduisons analyse de séquençage en profondeur de la bibliothèque elle-même et les sorties de la sélection à fournir des renseignements complets sur la diversité, l’abondance et une cartographie précise de chaque fragment sélectionné. Les protocoles présentés ici montrent les principales étapes pour la construction de la bibliothèque, la caractérisation et validation.

Introduction

Nous décrivons ici une méthode de haut-débit pour la construction et la sélection des bibliothèques de domaines de protéines solubles et plissés de toute source de départ génique/génomique. L’approche combine trois technologies différentes : affichage de phage, l’utilisation de reporter pliant et séquençage de prochaine génération (NGS) avec un outil web spécifique pour l’analyse des données. Les méthodes peuvent être utilisées dans différents contextes de recherche axée sur les protéines, pour l’identification et l’annotation de nouveaux domaines de protéines/protéines, caractérisation des propriétés structurales et fonctionnelles des protéines connues, ainsi que la définition de réseau d’interaction de la protéine.

Nombreuses questions en suspens sont encore présentes dans la recherche axée sur les protéines et l’élaboration de méthodes pour la production de protéines optimal est un besoin important pour plusieurs champs d’investigation. Par exemple, malgré la disponibilité de milliers de génomes procaryotes et eucaryotes¹, une carte correspondante des protéomes relatives avec une annotation directe des peptides et des protéines codées est toujours manquante pour la grande majorité des organismes. Le catalogue des protéomes complète s’impose comme un objectif difficile qui exige un effort considérable en termes de temps et de ressources. L’étalon-or pour l’annotation expérimentale reste le clonage de tous l’Open cadres de lecture (ORF) d’un génome, bâtiment le soi-disant « ORFeome ». Généralement la fonction du gène est assignée basée sur l’homologie avec des gènes apparentés d’activité connue, mais cette approche est mal juste en raison de la présence de nombreuses annotations incorrectes dans la référence bases^{2,3,4, 5}. Par ailleurs, même pour des protéines qui ont été identifiées et annotées, autres études soient nécessaires pour réaliser la caractérisation en termes d’abondance, profils d’expression dans des contextes différents, y compris les propriétés structurales et fonctionnelles ainsi que réseaux d’interactions.

En outre, étant donné que les protéines sont composées de différents domaines, chacun d’eux montrant des caractéristiques spécifiques et différemment qui contribuent aux fonctions de la protéine, l’étude et la définition exacte de ces domaines peuvent permettre à un tableau plus complet, tant à l’unique gène au niveau du génome complet. Toutes ces informations nécessaires rend recherche axée sur la protéine un champ vaste et difficile.

Dans cette perspective, on pourrait envisager une contribution importante par des méthodes non biaisées et haut-débit pour la production de protéines. Cependant, le succès de ces approches, à côté de l’investissement considérable nécessaire, repose sur la capacité de produire des protéines solubles/stable des constructions. Il s’agit d’un important facteur limitant car il a été estimé que seulement environ 30 % des protéines peut être correctement exprimée et dressée à un niveau suffisant pour être expérimentalement utile^6,7,8. Une approche à surmonter cette limitation est basée sur l’utilisation de l’ADN fragmenté au hasard pour produire différents polypeptides, qui fournissent ensemble la représentation qui se chevauchent de fragments de gènes individuels. Seul un faible pourcentage de fragments d’ADN générés de façon aléatoire sont fonctionnels ORFs tandis que la grande majorité d'entre eux est non fonctionnelles (en raison de la présence de codons stop à l’intérieur de leurs séquences) ou coder pour contre nature (ORF dans un cadre autre que l’original) POLYPEPTIDES sans signification biologique.

Pour répondre à toutes ces questions, notre groupe a développé un high-throughput protein expression et interaction plateforme d’analyse qui peut être utilisée sur une échelle génomique^9,10,11,12. Cette plate-forme intègre les techniques suivantes : 1) une méthode pour sélectionner les collections de domaines protéiques correctement plié dans la partie codante de l’ADN de n’importe quel organisme ; 2) la technologie d’affichage de le phage de sélection de partenaires d’interactions ; 3) l’end complètement caractériser l’interactome toute l’étude et identifier les clones d’intérêt ; et 4) un outil web pour l’analyse des données pour les utilisateurs sans connaissance en programmation ni de bioinformatique pour effectuer une analyse de l’Interactome-Seq de manière simple et conviviale.

L’utilisation de cette plate-forme offre des avantages importants sur des stratégies alternatives d’enquête ; la méthode est surtout complètement impartiale, haut débit et modulaire pour étude allant d’un seul gène jusqu'à un génome entier. La première étape du pipeline est la création d’une bibliothèque à partir au hasard de fragments d’ADN à l’étude, qui est alors profondément caractérisé par NGS. Cette bibliothèque est générée à l’aide d’un vecteur d’ingénierie où les gènes/fragments d’intérêt sont clonés entre une séquence de signaux pour la sécrétion de protéine dans l’espace périplasmique (c.-à-d., un dirigeant de la Sec) et le gène de β-lactamase TEM1. La protéine de fusion conférera la résistance à l’ampicilline et la capacité de survivre sous la pression de l’ampicilline uniquement si des fragments clonés sont dans le cadre des ces éléments et la protéine de fusion qui en résulte est correctement pliée^{10,13 ,14}. Tous les clones secourus après sélection antibiotique, les clones ce qu’on appelle « filtrés », sont ORFs et, une grande majorité d'entre eux (plus de 80 %) proviennent de gènes real⁹. En outre, la puissance de cette stratégie réside dans les conclusions que tous les clones de l’ORF filtré encodez pour correctement plié/soluble de protéines/domaines¹⁵. Comme nombreux clones, présents dans la bibliothèque et de la cartographie dans la même région/domaine, ont différentes commençant et finissant points, cela permet d’identifier non biaisée, seule étape les fragments minimales qui sont susceptibles d’entraîner des produits solubles.

Une autre amélioration dans la technologie est donnée par l’utilisation de NGS pour caractériser la bibliothèque. La combinaison de cette plate-forme et d’un outil web spécifique pour l’analyse des données donne importante information impartiale sur les séquences nucléotidiques exacte et sur l’emplacement de l’ORF sélectionné sur la référence ADN étudiée sans avoir besoin de plus amples analyses approfondies ou effort expérimental.

Domainome bibliothèques peuvent être transférés dans un contexte de sélection et utilisés comme un instrument universel pour réaliser des études fonctionnelles. La protéine de haut débit expression et interaction plateforme d’analyse que nous avons intégré et que nous avons appelé Interactome-Seq profite de la technologie d’affichage de phage en transférant l’ORF filtrée dans un vecteur de phagemid et en créant un phage-ORF bibliothèque. Une fois re-cloné dans un contexte d’affichage bactériophage, protéine domaines apparaissent à la surface des particules de M13. de cette façon domainome bibliothèques peuvent être directement sélectionnés pour des fragments de gènes codant les domaines avec des activités enzymatiques spécifiques ou lier des propriétés, permettant aux réseaux interactome profilage. Cette approche a été initialement décrite par Zacchi et al. ¹⁶ et plus tard utilisé dans plusieurs d’autres contexte^13,17,18.

Par rapport aux autres technologies utilisées pour étudier l’interaction protéine-protéine (y compris les deux système hybride de levure et de spectrométrie de masse^19,20), un avantage majeur est l’amplification de la partenaire de liaison qui se produit pendant le phage afficher plusieurs séries de sélection. Ceci augmente la sensibilité de sélection permettant ainsi l’identification des domaines des protéines se liant abondante faible présents dans la bibliothèque. L’efficacité de la sélection effectuée avec bibliothèque ORF filtré est encore accrue en raison de l’absence de clones non fonctionnel. Enfin, la technologie permet la sélection à effectuer contre les protéines et non protéique appâts^{21,22,23,24,25}.

Sélections de phage à l’aide de la bibliothèque de domainome-phage peuvent être effectuées en utilisant des anticorps provenant de sérums de patients atteints de différentes pathologies, maladies¹³, cancer ou infection par exemple les maladies autoimmunes comme appât. Cette approche est utilisée pour obtenir la soi-disant « anticorps signature » de la maladie à l’étude permettant d’identifier et de caractériser les antigènes/épitopes expressément reconnus par les anticorps du patient en même temps massivement. Par rapport aux autres méthodes, l’utilisation du phage display permet l’identification des linéaires et conformationnelles des épitopes antigéniques. L’identification d’une signature spécifique pourrait avoir un impact important pour la pathogénie de la compréhension, nouvelle conception de vaccins, identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement d’outils diagnostiques et pronostiques nouvelles et spécifiques. En outre, lorsque l’étude est axée sur les maladies infectieuses, un avantage majeur est que la découverte des protéines immunogènes est indépendante de la culture de l’agent pathogène.

Notre approche confirme que les journalistes pliants utilisable à l’échelle génomique pour sélectionner le « domainome » : une collection des domaines de protéine soluble, bien exprimé et correctement plié de la partie codante de l’ADN ou de cDNA de tout organisme. Une fois isolés les fragments de protéines sont utiles à des fins multiples, fournissant des informations essentielles expérimentales pour l’annotation des gènes, aussi bien en ce qui concerne les études structurales, la cartographie des épitopes anticorps, identification de l’antigène, etc.. L’exhaustivité des données haut débit fournies par NGS permet l’analyse des échantillons très complexes, tels que les bibliothèques de phage display et détient le potentiel de contourner la cueillette traditionnelle laborieuse et les essais des clones individuels phage secouru.

En même temps grâce aux fonctionnalités de la bibliothèque filtrée et la sensibilité extrême et la puissance de l’analyse de la NGS, il est possible d’identifier le domaine de la protéine responsable de chaque interaction directement dans l’écran initial, sans la nécessité de créer des bibliothèques supplémentaires pour chaque lié de protéine. NGS permet d’obtenir une définition exhaustive de l’ensemble domainome de n’importe quelle source de départ génique/génomique et l’outil d’analyse de données web permet l’obtention d’une qualification très spécifique d’un point de vue qualitatif et quantitatif de la domaines des interactome protéines.

Protocole

1. construction de la bibliothèque de l’ORF (Figure 1)

1. Préparation de l’ADN de l’insert
   1. Préparation de fragments de DNA génomique ou synthétique
      1. Extrait/purifier l’ADN à l’aide de méthodes standard²⁶.
      2. Des fragments de DNA par sonication. Si en utilisant un sonicateur standard, comme un début de suggestion générale 30 impulsions de s à 100 % puissance de sortie.
         NOTE : Expériences pilote doivent être effectuées avec différentes puissances et fois sonication pour définir les conditions optimales pour la préparation de l’ADN. Après chaque essai, déterminer la taille des fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose.
      3. Charger l’ADN aux ultrasons sur gel d’agarose de 1,5 %, avec une échelle d’ADN bp 100. Effectuer une électrophorèse courte à 5 V/cm pendant 15 min et couper la partie du gel contenant le frottis de l’ADN fragmenté.
      4. Purifier l’ADN de l’insert avec un kit d’extraction basée sur les colonnes de gel et de mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
         NOTE : au moins 500 ng d’inserts purifiés doit être obtenue après cette étape, à être ligaturé avec 1 µg de vecteur digéré, comme décrit dans l’étape 1.3. Vérifier la qualité de préparation des fragments en évaluant un_260nm/A_280nm et un_260nm/A_230nm rapports étant donné la faible qualité de l’échantillon aura une incidence sur l’efficacité de la ligature.
      5. Traiter jusqu'à 5 μg des inserts avec 1 μl du mélange enzymatique rapide Kit émoussant, conformément aux instructions du fabricant. Inactiver les enzymes en chauffage à 70 ° C pour 10 min. échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
   2. Préparation des fragments d’ADNc
      1. Extrait de RNA avec des méthodes standard (par exemple, à l’aide de TRizol ou réactifs similaires).
      2. Fragment de mRNA de chauffage avant d’effectuer la transcription inverse. La longueur de fragment de DNA finale est contrôlée par temps d’ébullition de l’ARNm et concentration des amorces aléatoires. Par exemple, on la chauffe pendant 6 min à 95 ° C.
      3. Préparer le cDNA utilisant des amorces aléatoires avec n’importe quel kit disponible suivant le protocole du fabricant.
      4. Appauvrissent l’ADNc de la queue poly-dT par hybridation avec biotinylé poly-dA pendant 3 h à 37 ° C, puis séparer sur des billes magnétiques de streptavidine tel que décrit par Carninci et al. ¹³
      5. Récupérer le matériel non lié et purifier avec un kit de purification de l’ADN basée sur les colonnes suivant les instructions du fabricant. Mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Voir la Note à l’étape 1.1.1.4.
2. Préparation du vecteur filtrage
   1. Digest 5 µg de clonage purifiée vecteur pFILTER3¹² avec 10 U de EcoRV enzyme de restriction, protocole du fabricant suivant.
   2. Charger 2 µL (200 ng) du vecteur digéré, avec 100 ng du vecteur non digéré et 1 k bp marqueur moléculaire, sur un gel d’agarose à 1 %, à vérifier pour une bonne digestion. Chaleur inactiver les enzymes de restriction.
   3. Ajouter 1/10 volume de 10 x tampon phosphatase et 1 µL (5 U) de la phosphatase et incuber à 37 ° C pendant 15 min. chaleur inactive pendant 5 min à 65 ° C.
   4. Purifier le plasmide digéré par extraction du gel d’agarose et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. La ligature et transformation
   1. Effectuer la ligature comme suit : pour 1 µg de plasmide digéré ajouter 400 ng d’inserts phosphorylées (plasmide : insert rapport molaire 1:5), 10 µL de 10 x tampon pour T4 DNA Ligase, 2 µL de forte concentration T4 DNA ligase en un volume final de 100 µL. Incubez la réaction à 16 ° C overni GHT. Chaleur inactiver à 65 ° C pendant 10 min.
   2. Précipiter le produit de la ligature en ajoutant 1/10 volume de solution d’acétate de sodium (3M, pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Mélanger et congeler à-80 ° C pendant 20 min.
   3. Centrifuger à vitesse maximum pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
   4. Ajouter 500 µL d’éthanol 70 % froid au culot et centrifuger à vitesse maximum pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
   5. Sécher à l’air le culot. Remettre en suspension l’ADN précipité dans 10 µL d’eau.
   6. Effectuer l’électroporation de la cellule bactérienne.
      Remarque : L’utilisation de cellules de haute efficacité (au-dessus de 5 x 10⁹ transformants par µg d’ADN) est nécessaire. Nous vous suggérons d’utiliser Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (TPMN) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) produites dans la maison ou achetés par plusieurs fabricants.
      1. Placer un nombre approprié de microtubes à centrifuger et 0,1 cm-électroporation cuvettes sur la glace. Ajouter 1 µL de la solution purifiée de la ligature (dans l’eau distillée) à 25 µL de cellules et feuilleter le tube quelques fois.
      2. Transvaser le mélange de l’ADN-cell dans la cupule froide, taper sur la partie supérieure du comptoir 2 x, essuyer l’eau de l’extérieur de la cuve, placer dans l’impulsion de module et de la presse d’électroporation.
      3. Effectuer l’électroporation avec une machine standard électroporateur à l’aide de µF 25, 200 Ω et 1.8 kV. Constante de temps doit être de 4-5 ms.
   7. Immédiatement ajouter 1 mL de milieu liquide 2xYT sans n’importe quel antibiotique, transférer dans un tube de 10 mL et laisser pour se développer à 37 ° C, secouant à 220 tr/min pendant 1 h.
   8. Plaque transformé DH5αF' sur 15 cm 2xYT plaques de gélose additionnée de 34 chloramphénicol µg/mL (résistance pFILTER) et à l’ampicilline 25 µg/mL (marqueur sélectif de l’ORF) et incuber pendant la nuit à 30 ° C.
   9. Plaque de dilutions de la bibliothèque sur plaques de gélose de 2xYT 10 cm complété avec chloramphénicol + ampicilline et chloramphénicol seulement, pour effectuer le titrage de la bibliothèque. Incuber pendant la nuit à 30 ° C.
4. validation de bibliothèque pFILTER-ORF
   1. Test de 15-20 colonies de plaques chloramphénicol et de chloramphénicol/ampicilline pour estimer la distribution granulométrique insert. Prélever des colonies unique avec une pointe et Diluez-les séparément dans 100 µL de milieu de 2xYT sans antibiotiques. Utiliser 0,5 µL de cette solution comme matrice d’ADN pour une réaction de PCR, avec n’importe quel standard polymérase TaqDNA suivant le protocole du fabricant.
   2. Effectuer 25 cycles d’amplification utilisant un recuit de T de 55 ° C et une prorogation du délai de 40 s à 72 ° C. Séquences d’amorces sont fournis dans la Table des matières.
   3. Charger les produits PCR sur gel d’agarose de 1,5 %, avec une échelle d’ADN bp 100 et les exécuter.
5. collection de la bibliothèque de pFILTER-ORF
   1. Récolter les germes sur les plaques de 150 mm en ajoutant 3 mL de milieu de 2xYT frais et leur récolte avec un grattoir stérile, bien mélanger, les compléter avec 20 % de glycérol stérile et stocker à-80 ° C dans de petites parties aliquotes.
   2. Purifier l’ADN de plasmide d’une aliquote de la bibliothèque (avant l’addition de glycérol) à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide basée sur les colonnes, suivant les instructions du fabricant.
   3. Mesurer la concentration avec le spectrophotomètre UV. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à servir à phagemid bibliothèque élaboration et/ou de caractérisation de NGS.

2. subcloning d’ORF filtrée dans un vecteur de Phagemid (Figure 2)

1. Préparation de l’ORF filtré des fragments d’ADN
   1. Mettre en place enzyme de restriction digestion de 5 µg de vecteur purifiée du vecteur bibliothèque pFILTER-ORF ajoutant 10 U de BssHII et en incubant conformément au protocole du fabricant. Inactiver les enzymes et digérer avec 10 U de NheI.
   2. Charger l’ADN digéré sur gel d’agarose de 1,5 %, avec une échelle d’ADN bp 100. Effectuer une électrophorèse courte fonctionnent à 5 V/cm pendant 15 min ou juste assez distinguer le frottis des fragments excisées et couper la partie du gel qui les contiennent.
   3. Purifier l’ADN de l’insert avec un kit d’extraction de gel de base de la colonne et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
2. Préparation d’ADN de phagemid
   1. Mettre en place l’enzyme de restriction digestion de 5 µg de pDAN5 purifié²⁷ en ce qui concerne les inserts.
   2. Purifier le plasmide digéré par ADN digéré en cours d’exécution sur un gel d’agarose de 0,75 % et extrait de gel avec un kit basée sur les colonnes.
   3. Mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. Collecte, transformation et ligature de bibliothèque
   1. Effectuer la ligature et la transformation comme pour le vecteur de pFILTER.
   2. Plaque transformé DH5αF' sur 150 mm plaques de gélose 2xYT complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL et incuber une nuit à 30 ° C.
   3. Plaque de dilutions de la bibliothèque sur plaques de gélose de 2xYT 100 mm complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL pour déterminer la taille de la bibliothèque.
   4. Effectuer la validation de la bibliothèque par PCR des clones choisis au hasard comme indiqué au point 1.4.
   5. Recueillir la bibliothèque phagemid-ORF en récoltant des bactéries provenant de plaques de 150 mm, bien mélanger, les compléter avec 20 % de glycérol stérile et conserver à-80 ° C dans de petites parties aliquotes.
   6. Purifier l’ADN de plasmide d’une aliquote de la bibliothèque à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide basée sur les colonnes, suivant les instructions du fabricant.
   7. Mesurer la concentration dans le spectrophotomètre UV. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à être utilisées pour la caractérisation de la NGS.

3. phage bibliothèque préparation et procédure de sélection

1. Production de phages
   1. Diluer une aliquote de stock de la bibliothèque phagemid dans 10 mL de bouillon liquide 2xYT complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL afin d’avoir une OD_600nm = 0,05.
   2. Cultiver la bibliothèque diluée dans un flacon stérile 5 - 10 fois plus grand que le volume d’origine, à 37 ° C sous agitation à 220 tr/min, jusqu'à ce que les tronçons OD_600nm = 0,5.
   3. Infecter des bactéries avec le phage d’assistance (par exemple M13K07) à une multiplicité d’infection 20:1. Laissez à 37 ° C pendant 45 min avec agitation occasionnelle (toutes les 10 min).
   4. Centrifuger les bactéries à 4000 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant, nouvelle suspension pellet de bactéries dans 40 mL de 2xYT liquide bouillon additionné de 100 ampicilline µg/mL et 50 µg/mL kanamycine et poussent à 28 ° C sous agitation à 220 tr/min pour la nuit.
   5. Le lendemain, bactéries de la centrifugeuse à 4000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Recueillir le liquide surnageant contenant des phages.
2. PEG-précipitation des phages.
   1. Ajouter 1/5 de volume d’un 0,22 µm filtré solution de PEG/NaCl (20 % p/v PEG 6000, 2,5 M de NaCl) pour les phages défrichées et incuber sur glace pendant 30-60 min.
      NOTE : Solution devenue fumée au bout de quelques minutes, indiquant une précipitation de phage réussie. La turbidité de la solution augmente au cours de la période d’incubation.
   2. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Une petite pastille blanche de phages se formera.
   3. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile. Transfert à tube 1,5 mL et centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à vitesse maximale pour éliminer les bactéries contaminant. Une pastille brune se formera.
   4. Transfert de liquide surnageant contenant des phages dans un nouveau tube. Garder les phages sur la glace pour la sélection de titrage et phage successifs.
3. Titrage de phages
   1. Préparer des dilutions de la solution du phage. Equipez 990 µL de PBS pour obtenir 10^-2 dilution de 10 µL de la solution du phage. Diluer à nouveau cette préparation à faire, 10^-4 de ce obtenir une dilution de 10^-6 .
   2. Pousser DH5αF' cellules de bactéries dans un milieu liquide 2xYT à 37 ° C sous agitation jusqu'à OD_600nm = 0,5 est atteint. Transférer 1 mL de la bactérie préparée en tube 1,5 mL et infecter immédiatement avec 1 µL de la dilution du phage 10^-4 . Incuber sans agiter à 37 ° C pendant 45 min. Répétez la même procédure pour la dilution de 10^-6 .
   3. Dilutions de la plaque de la bactérie infectée dans la plaque de 2xYT 100 mm. Mettre la plaque à 30 ° C durant la nuit.
   4. Plaque de 100 µL de sains DH5αF' sur une gélose 2xYT complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL pour vérifier l’absence de contamination dans la préparation.
   5. Le lendemain de compter le nombre de colonies et calculer le titre phage. Titre explicite comme nombre de phages/mL. Titre prévu est^12-13 10 phages/mL.
4. Sélection de phages
   1. Phage sélection utilisant comme appât anticorps purifiés
      1. Saturer les phages en diluant 200 µL de préparation des phages dans un volume égal de lait écrémé PBS - 4 % et incuber pendant 1 heure à température ambiante en rotation lente. Cette étape permet de bloquer des phages pour liaison non-spécifique. Transférer 30 µL de billes magnétiques revêtues de protéines-G dans un tube de 1,5 mL.
      2. Laver deux fois comme suit : ajouter 500 µL de PBS, incuber sur une roue en rotation lente pendant 2 min à température ambiante, attirer les perles sur un côté du tube à l’aide d’un aimant et éliminer le surnageant.
      3. Incuber les phages saturés avec perles lavés pendant 30 min à température ambiante avec une rotation lente.
      4. Dessiner les perles d’un côté à l’aide d’un champ magnétique. Recueillir le liquide surnageant contenant des phages à utiliser pour l’étape de sélection.
      5. Préparer des billes magnétiques lors de l’exécution de l’étape précédente, en conjugant les anticorps purifiés. Laver 30 µL de billes magnétiques revêtues de protéines-G comme décrit ci-dessus. Diluer 10 µg d’anticorps purifiés dans 500 µL de PBS, ajouter aux talons lavées et incuber en rotation lente à température ambiante pendant 45 min. Laver deux fois avec du PBS.
         Remarque : Effectuez deux préparations différentes de billes magnétiques : un avec des anticorps d’intérêt et un contrôle des anticorps, par exemple, les anticorps purifiés de donneurs sains. La séquence des antigènes sélectionné avec contrôle des anticorps sont soustraites au cours de l’étape de l’analyse des résultats. Alternativement, des billes magnétiques chargées avec des anticorps de contrôle peuvent être utilisés pour exécuter une étape de nettoyage préalable des phages (suivre le protocole pour l’incubation avec des billes non conjugués).
      6. Sélection de phages : tirer des perles sur un côté du tube à l’aide d’un aimant, supprimer le dernier lavage, ajouter des phages et incuber avec rotation lente à température ambiante pendant 90 min. laver 5 fois avec 500 µL de PBS-0.1% Tween-20 et 5 fois avec du PBS.
      7. Éluer les phages liés, ce qui représente le résultat de la sélection, en mélangeant les perles avec 1 mL de DH5αF' cellules cultivées à OD₆₀₀ = 0,5. Incuber les bactéries avec des perles pendant 45 min à 37 ° C, avec parfois agitation (toutes les 10 min). Plaque de la sortie sur une gélose de 2xYT de 150 mm complétée avec de l’ampicilline 100 µg/mL.
      8. Plaque de 100 µL de non dilué et des dilutions différentes de la sortie (10^-1 à 10^-5) pour effectuer le titrage. Le lendemain de récolter les germes sur les plaques de 150 mm en ajoutant 3 mL de milieu de 2xYT frais et leur récolte avec un grattoir stérile, bien mélanger, les compléter avec 20 % de glycérol stérile et stocker à-80 ° C dans de petites parties aliquotes.
      9. Cultiver une aliquote à nouveau pour effectuer une seconde ronde de sélection. Répétez toute la procédure panoramique comme décrit ci-dessus à l’exception des conditions de lavage. Dans ce cas laver 10 fois avec PBS - 1 % Tween-20 (versez la solution dans le tube et versez immédiatement). Ensuite, ajouter 500 µL de PBS et incuber sur rotation à température ambiante pendant 10 min. effectuer les autres 10 lavages avec du PBS. Passez à l’étape d’élution en ce qui concerne le premier tour de sélection.
      10. Extraire l’ADN de plasmide d’une aliquote de la sortie à l’aide d’un kit basée sur les colonnes, en suivant les instructions du fabricant. Magasin de plasmide à-20 ° C jusqu'à ce qu’il sera utilisé pour le séquençage en profondeur.
   2. Sélection de phage en utilisant comme appâts des protéines recombinantes
      1. Saturer les phages en diluant 200 µL de préparation des phages dans un volume égal de lait écrémé PBS - 4 % et incuber pendant 1 heure à température ambiante en rotation lente.
      2. Ajouter 100 µL de streptavidine billes magnétiques. Incuber pendant 1 heure à température ambiante pour sélectionner la liaison streptavidine phages. Supprimer les phages de streptavidine-bondissent en dessinant les perles d’un côté à l’aide d’un aimant. Prendre surnageant de l’étape précédente et ajoutez des protéines biotinylées (à une concentration de 100 à 550 nM) et incuber dans un rotor à température ambiante pendant 30 min à 1 h.
      3. Préparer des billes magnétiques : lors de l’exécution de l’étape précédente, laver 100 µL de billes streptavidine-magnétiques avec du PBS, resuspendre dans PBS de lait écrémé en poudre 2 % et incuber avec rotation à température ambiante pendant 30 min à 1 h.
      4. Sélection de phages : attirer des perles sur un côté du tube à l’aide d’un aimant, supprimer lait PBS - 2 % et remettre en suspension les perles avec mélange de phage-protéine. Incuber à rotation lente à température ambiante pendant 90 min.
      5. Attirer des perles sur un côté du tube à l’aide d’un aimant, éliminer le surnageant et lavez-les soigneusement cinq fois avec 500 µL de PBS 0,1 % Tween-20. Effectuer d’élution comme décrit à la session précédente.

4. phage bibliothèque plate-forme de séquençage en profondeur (Figure 3)

1. ADN insère récupération de pFILTER-ORF-bibliothèque, pDAN5-ORF-bibliothèque ou sélectionné-phage-bibliothèques
   1. Décongeler une aliquote de la bibliothèque, quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre, récupérer les insertions d’ADN par amplification avec des amorces spécifiques.
      Remarque : Les amorces utilisées pour sauver les inserts sont liés à leur extrémité 5' des séquences d’adaptateurs, ce qui permet l’indexation successives des pools d’amplicons obtenus et le séquençage direct des inserts ADN récupéré en utilisant les séquenceurs. Leur séquence est dans la Table des matières. Les adaptateurs sont indiquées en gras, et les amorces spécifiques sont indiqués en italique.
   2. Utiliser 2,5 µL de la bibliothèque (pFILTER/phagemid/sélectionné-phage) comme matrice d’ADN pour une réaction de PCR.
   3. Utiliser le programme suivant : 95 ° C pendant 3 min ; 25 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s ; 72 ° C pendant 5 min. cale à 4 ° C.
      Remarque : À ce stade, il est recommandé d’exécuter 1 µL du produit PCR sur un Bioanalyzer ou un TapeStation pour vérifier la taille des amplicons et vérifier qu’ils sont dans la plage correcte.
2. PCR nettoyage
   1. Amener les billes magnétiques (par exemple, AMPure) à température ambiante. Transférer l’intégralité du produit PCR du tube PCR dans un tube de 1,5 mL. Vortex les billes magnétiques pour 30 s pour s’assurer que les perles sont réparties. Ajouter 20 µL de billes magnétiques dans chaque tube contenant le produit PCR, mélange de pipetage doucement. Incuber à température ambiante sans agiter pendant 5 min.
   2. Placer la plaque sur un support magnétique pendant 2 min ou jusqu'à ce que le liquide surnageant a été compensé. Avec les produits PCR sur le support magnétique, retirer et jeter le surnageant.
   3. Laver les billes avec l’éthanol à 80 % fraîchement préparés, avec les produits PCR sur le support magnétique, comme suit : ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % fraîchement préparés pour chaque échantillon ; Incuber les plaques sur le support magnétique pendant 3 s ; soigneusement, enlever et jeter le surnageant.
   4. Effectuer un second lavage de l’éthanol, avec les produits PCR sur le support magnétique ; à la fin du deuxième lavage soigneusement enlever tout l’éthanol et permettre les perles à sécher à l’air pendant 10 min.
   5. Enlever les produits PCR du support magnétique, ajouter 17,5 µL de 10 mM Tris pH 8,5 dans chaque tube, Pipetez doucement vers le haut et en bas 10 fois, assurez-vous que les perles sont entièrement resuspendues. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
   6. Placer le tube sur le support magnétique pendant 2 min ou jusqu'à ce que le liquide surnageant a dégagé, transvaser avec soin 15 µL de surnageant contenant des produits PCR purifiés dans un nouveau tube de 1,5 mL. Stocker les produits PCR purifiés à-15 ° C à-25 ° C pendant une semaine si vous ne passez pas immédiatement à Index PCR.
3. Indice de PCR
   Remarque : Après avoir nettoyer les PCR, effectuez Index PCR. Utilisez le kit Nextera XT Index ; Il est donc possible de séquencer les bibliothèques indexées doubles résultantes dans multiplexé Illumina s’exécute.
   1. Transférer tous les 15 μL contenant chaque produit purifié dans un nouveau tube PCR et mis en place la réaction suivante contenant : 15 µL du produit de l’amplicon purifiée, 5 µL de Primer l’indice 1 et 5 µL d’Index Primer 2, 25 µL du mélange 2 à x PCR ; volume final de 50 µL.
   2. Effectuer la PCR sur un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 95 ° C pendant 3 min, 8 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s ; 72° C pendant 5 min, puis maintenez à 4 ° C.
4. PCR nettoyage 2
   1. Suivez le même protocole décrit dans la section 4.2 pour PCR nettoyage avec les modifications suivantes : dans un premier temps ajouter 56 µL de billes magnétiques pour chaque 50 µL de produit de PCR.
   2. Remettre en suspension les perles en 27,5 µL de 10 mM Tris pH 8,5 dans la dernière étape de la purification et le transfert de 25 µL dans un nouveau tube (c’est la bibliothèque finale purifiée prête pour la quantification et puis séquençage).
   3. Stocker la plaque à-15 ° C à-25 ° C pendant une semaine, si ne pas procéder à une Quantification de la bibliothèque.
5. Évaluation qualitative et quantitative de la bibliothèque de séquençage
   1. Après purification, exécutez 1 µL d’une 01:10 dilution de la bibliothèque finale sur un bioanalyzer pour vérifier la taille et quantifier en sélectionnant la région de la trace de la bibliothèque final.
   2. En parallèle, effectuer la quantification de la bibliothèque par PCR en temps réel en utilisant un kit de quantification de bibliothèque par protocole du fabricant.
6. Bibliothèques de séquençage
   1. Mettre en commun les bibliothèques indexées doubles produites conjointement avec d’autres bibliothèques double séquençage indexée. Séquence de que ce type de bibliothèque en générant lit depuis longtemps, au moins 250 fin appariés de bp en utilisant aussi bien les Hiseq2500 ou les instruments de MiSeq d’obtenir dans le premier cas 250bp PE se lit et dans le deuxième cas 300 bp PE lit.

5. analyse de données bioinformatiques en utilisant l’outil de Web Interactome-Seq

1. Analyser les lectures provenaient de séquençage de la bibliothèque pFILTER/phagemid/sélectionné-phage avec le pipeline de l’analyse de données Interactome-seq. L’outil web est disponible gratuitement à l’adresse suivante : http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Résultats

L’approche de filtrage est schématisé à la Figure 1. Chaque type d’ADN intronless peut être utilisé. La première partie de l’approche de filtrage est représentée Figure 1 a : après le chargement sur gel d’agarose ou un bioanalyzer, une bonne fragmentation de l’ADN d’intérêt apparaît comme un frottis des fragments avec une distribution de longueur à la taille désirée de bp 150-750. Une image représentan...

Discussion

La création d’une bibliothèque filtrée de haute qualité sur ORF très diversifiée est la première étape critique dans l’ensemble de la procédure puisque cela affectera toutes les étapes subséquentes de l’oléoduc.

Une importante caractéristique avantageuse de notre méthode est que n’importe quelle source d’ADN (intronless) (ARN, ADN génomique, PCR dérivées ou ADN synthétique) est adapté à la construction de la bibliothèque. Le premier paramètre qui doit être pris...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer	Bandelin	HD2070	or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	or equivalent
Molecular Biology Agarose	BioRad	161-3102	or equivalent
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	or equivalent
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	or equivalent
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	or equivalent
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	or equivalent
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2	general lab supplier
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
DH5aF' bacteria cells	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes	general lab supplier
1,5 ml tubes	general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
150 mm plates	general lab supplier
100 mm plates	general lab supplier
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	or equivalent
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Sodium Cloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10003D	or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Nonfat dried milk powder	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP beads	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT dual Index Primers	Illumina	FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation	Agilent
Forward PCR primer	general lab supplier		5’ TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer	general lab supplier		5’ TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS	general lab supplier		5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS	general lab supplier		5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;