Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Resumen

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Resumen

La existencia y la importancia de las células que inician tumores (TIC) han sido apoyadas por el aumento de la evidencia durante la última década. Se ha demostrado que estos TIC son responsables de la iniciación del tumor, la metástasis y la resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, es importante desarrollar una terapia específica de focalización de TIC además de las estrategias de quimioterapia actuales, que se centran principalmente en la mayor parte de los no TIC. Con el fin de comprender mejor el mecanismo detrás de la neoplasia maligna de los TIC, describimos un método para aislar y caracterizar los TIC en los sarcomas humanos. En este documento, mostramos un protocolo detallado para generar xenoinjertos derivados del paciente (PDX) de sarcomas humanos y para aislar los TIC mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando antígeno leucocito humano clase I (HLA-1) como marcador negativo. Además, describimos cómo caracterizar funcionalmente estos TIC, incluyendo un ensayo de formación de esfera y un ensayo de formación tumoral, e inducir la diferenciación a lo largo de las vías mesenquimales. El aislamiento y la caracterización de los TIC PDX proporcionan pistas para el descubrimiento de posibles reactivos de terapia de orientación. Además, la creciente evidencia sugiere que este protocolo puede ampliarse aún más para aislar y caracterizar los TIC de otros tipos de cánceres humanos.

Introducción

La heterogeneidad celular intratumoral de los cánceres humanos ha sido apoyada por el aumento de la evidencia durante la última década¹. Similar al tejido normal, el tejido canceroso consiste en una pequeña subpoblación de TIC (también llamadas células madre cancerosas), que exhiben capacidad de formación de tumores; mientras tanto, la mayor parte de las células cancerosas exhiben fenotipos diferenciados². Estos TIC muestran propiedades similares a las células madre, incluyendo la expresión de un marcador de células madre y la capacidad de la auto-renovación y la división celular asimétrica, y por lo tanto, pueden iniciar la formación de un tumor heterogéneo celular³. Estudios recientes han revelado que los TIC no sólo son responsables dela iniciación del tumor, sino que también están asociados con la agresividad tumoral 4, la metástasis⁵y la resistencia a los medicamentos^6. Por lo tanto, es importante entender la biología de los TIC y, por lo tanto, desarrollar una estrategia de tratamiento específica dirigida a estos TIC.

Se han utilizado métodos basados en FACS para identificar LOS TIC mediante marcadores TIC,incluidos CD133, CD24 y CD44 1. La mayoría de estos marcadores también se expresan en células madre normales⁷. Sin embargo, ninguno de estos marcadores marca únicamente los TIC. Los papeles que desempeñan estas moléculas en la neoplasia maligna de los TIC aún no están claros. Por ejemplo, CD133 puede ser frecuentemente inactivado por la metilación del ADN, y por lo tanto, esta heterogeneidad intertumoral puede hacer que la precisión de estos marcadores⁸. ALDH1 es un marcador que también funciona para mantener la talla de TICs⁹. Parece ser más eficaz en la identificación de tiCs de cáncer de mama, pero sigue siendo cuestionable en otros tipos de tumores⁹. Algunas vías de señalización desempeñan un papel importante en la biología de células madre, como Wnt(sitio de integración relacionada con las alas), TGF-o (factor de crecimiento beta transformador) y Erizo 1. Pero es difícil demostrar que estas vías son específicas de TIC y utilizar la actividad de estas vías para aislar los TIC de los tumores primarios. Por lo tanto, se necesita urgentemente un nuevo marcador TIC fiable.

MHC humano clase I, también llamado HLA-1, es una proteína de superficie celular expresada en casi todas las células nucleadas¹⁰. HLA-1 funciona como un antígeno que presenta una molécula que es específicamente reconocida por las células T CD8¹⁰. El efecto citotóxico de las células T CD8 se puede activar cuando las células cancerosas presentan un antígeno tumoral por HLA-1. Por lo tanto, la falta de HLA-1 en la superficie celular de las células cancerosas puede conducir a una fuga inmune de las células T CD8 citotóxicas. La regulación de HLA-1 se ha descrito en diferentes tipos de cáncer humano y se correlaciona con mal pronóstico, metástasis y resistencia a los medicamentos^11. Hemos demostrado que la pérdida de expresión HLA-1 en la superficie celular se puede utilizar para identificar TIC en sarcomas, así como en el cáncer de próstata^6,12.

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar los TIC de los PDX de sarcoma humano por FACS, utilizando HLA-1 como marcador negativo, y para validar y caracterizar aún más estos TIC HLA-1 negativos.

Protocolo

Todos los protocolos para los experimentos con ratones discutidos aquí estaban de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el Comité de ética de investigación humana institucional del Centro Médico Mount Sinai y el Comité de Cuidado y Uso de Animales.

1. Procesamiento de la muestra de tejido del sarcoma y la formación PDX

1. Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional, pida al personal del servicio de patología que prepare muestras de sarcoma de muestras de cirugía e coloque inmediatamente cada muestra en hielo en un plato Petri de 100 mm.
2. Coloque la muestra en un tubo cónico de poliestireno de 15 ml con 6 ml de medio de cultivo frío Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Procesar la muestra de tejido inmediatamente.
3. (Opcional) Solo para el osteosarcoma, siga los siguientes pasos, que se pueden omitir para el sarcoma de tejidoblando.
   1. Cortar el tejido en 20 mm³ piezas usando un bisturí. Transfiera las piezas de tejido a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de solución de colagenasa (RPMI 1640 con 1 mg/ml de colagenasa).
   2. Poner el tubo en un baño de agua a 37 oC durante 30 minutos.
   3. Vórtice a fondo el tubo y, a continuación, añadir 3 mL de RPMI 1640 complementado con 10% FBS para neutralizar la actividad de la colagenasa.
   4. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante.
4. Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril, coloque la muestra de tejido en un plato Petri de 100 mm. Añadir 500 l de solución salina estéril 1x con fosfato (PBS) al tejido. Con un bisturí estéril, triturar mecánicamente el tejido en trozos pequeños hasta que ninguna pieza de tejido visible sea mayor de 0,1 mm.
5. Transfiera la suspensión celular de 500 ml a un colador de células de 35 m y recoja la suspensión filtrada con un tubo de poliestireno de 50 ml. Ponga este tubo de poliestireno de 50 ml con la suspensión celular sobre hielo.
6. Añadir otros 500 l de PBS al tejido. Triturar por segunda vez, transferir la suspensión a través del colador de la célula, y recogerla en el mismo tubo de 50 ml.
7. Repita estos pasos (pasos 1.5–1.6) hasta que la sección del tejido esté completamente disociada, generalmente 6x - 8x.
8. Pellet la suspensión celular por centrifugación a 350 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet usando 5 ml de tampón de hemólisis (0,15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃y 0,1 mM EDTA), e incubar la solución durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos.
9. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente y eliminar el tampón de hemólisis. Lavar el pellet con 5 ml de PBS. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 350 x g y quitar el sobrenadante.
10. Resuspenda el pellet con 1 ml de PBS y cuente el número de celda viable usando un hemocitómetro o cualquier otro método alternativo. Diluir las células a una concentración final de 1 x 10⁷ células en 200 l de PBS. Deje la suspensión de la celda sobre hielo.
11. Deje la matriz de membrana del sótano sobre hielo para permitir que se derrita. Añadir 200 l de matriz de membrana de sótano a la suspensión celular de 200 l. Mezcle suavemente y mantenga en hielo.
12. Inyección subcutánea de la suspensión celular: matriz de membrana de sótano (1:1) mezcla en dos ratones NOD scid gamma (NSG) en sus flancos. Utilice 200 l para cada inyección.
13. Supervise la formación de PDX comprobando el lugar de inyección de los ratones 2 veces por semana. Retire el xenoinjerto tumoral cuando alcance 1 cm de diámetro.

2. Aislamiento de células que inician tumores por FACS del PDX

1. Retire quirúrgicamente el PDX de los ratones como se describió anteriormente¹².
2. Corta el tumor por la mitad. Fije la mitad del xenoinjerto con 4% de paraformaldehído durante la noche. Esto es para análisis histológico. Procesar la otra mitad del tejido como se describió anteriormente (pasos 1.3–1.8) para obtener una suspensión de la célula tumoral.
3. Resuspenda el pellet con PBS y cuente el número de celda viable.
4. Diluir la suspensión celular en PBS suplementada con 5% FBS a una concentración de 2 x 10⁶ células/ml. Deje la suspensión celular sobre hielo durante 30 minutos. Marque los tubos con control de isótopos y anticuerpos, respectivamente. Observe el número de células en cada tubo.
5. Preparar 2 x anticuerpo HLA-1-PE diluyendo el anticuerpo con PBS complementado con 5% DE FBS (1:250). Diluir el anticuerpo de control de isotipo negativo con la misma condición. Mezclar la suspensión celular del tubo "anticuerpo" con anticuerpos diluidos (1:1) para hacer la dilución final del anticuerpo 1:500. Mezclar la suspensión celular del tubo de "control de isótopos" con el control de isótopos (1:1). Ponga las suspensiones de celdas en hielo durante 90 min.
6. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4oC y retira el sobrenadante. Añadir 10 mL de PBS para lavar el pellet 2x.
7. Añadir 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a PBS a una concentración final de 10 g/ml. Agregue esta solución DAPI al pellet celular para hacer una suspensión celular de 10⁷ células/ml (usando los números de celda del paso 2.4).
8. Filtrar la suspensión de la célula a través de tapas de colador de 35 mm en tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm.
9. Utilice un citómetro de flujo para ordenar la subpoblación TIC HLA-1-negativa⁶. Las células viables de la puerta (DAPI-negativa) y recoger las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas en dos tubos de recolección de 15 ml, cada uno con teniendo 4 ml de medio de cultivo RPMI 1640.

3. Caracterización de las células que inician tumores

1. Formación de la sarcosfera
   1. Haga que la sarcosfera sea mediana de crecimiento, utilizando un medio de cultivo celular alfa-MEM. Añadir suplementos para hacer una concentración final de suplementos de B-27 (1x), Suplementos de N2 (1x), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (20 ng/ml), y factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20 ng/ml) y penicilina/estreptomicina (100 UI/ml). Filtre el medio con un filtro de cultivo celular de 0,2 m antes de su uso.
   2. Pellet la subpoblación hLA-1-negativa y positiva ordenada del paso 2.9 y contar los números de célula de cada subpoblación.
   3. Diluir 1,5 x 10⁶ células en 15 ml del medio de crecimiento de la sófera para hacer la dilución celular de 1 x 10⁵ células/ml.
   4. Diluir en serie las células con medio de crecimiento de sórtica fresca para hacer 15 ml de dilución celular de 10⁴, 10³y 10² células/ml. Luego, prepare cuatro placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos, cada una para una dilución celular.
   5. Transfiera 100 ml de suspensión celular de la dilución de 10⁵ células/ml a cada pocal de la primera placa de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos. Esta placa tiene 10⁴ células en cada pozo.
   6. Utilice las otras tres placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos para las otras tres diluciones celulares: 10⁴, 10³y 10² células/ml. Transfiera 100 l de suspensión celular a cada pocal de las placas de cultivo de células de fijación ultrabaja de 96 pocillos. Estas tres placas de cultivo tienen 1.000 células/pozo, 100 células/pozo, y 10 células/pozo, respectivamente.
   7. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de 37 oC y 5% de CO_2.
   8. Añadir nuevos bFGF y EGF directamente al medio de cultivo celular (concentración final de 20 ng/ml) cada tres días sin cambiar el medio para evitar las células perdidas en el cultivo de suspensión.
   9. Usando un microscopio de luz, monitoree la formación de la sarcosfera todos los días durante tres semanas, como se muestra en la Figura 2A.
   10. Después de tres semanas, cuente el número de pozos positivos de la sarcásfera y los pozos negativos de la sarcásfera de cada dilución celular para células HLA-1-negativas y HLA-1-positivas.
   11. Calcular la frecuencia de celda de formación de esferas basada en una distribución de probabilidad de Poisson¹³. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1.
2. Ensayo de formación de tumores de dilución en serie
   1. Cuente las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas del paso 2.9.
   2. Hacer diluciones en serie de las células con PBS a concentraciones de 10⁶, 10⁵, 10⁴y 10³ células/ml. Utilice 1 ml de cada dilución para la formación de tumores en 10 ratones.
   3. Añadir 1 ml de matriz de membrana del sótano a la suspensión celular de 1 ml de cada dilución (1:1). Conservar los 2 ml de cada mezcla sobre hielo.
   4. Inyección subcutánea de 200 l de la célula:mezcla de matriz de membrana de sótano en los flancos de ratones NGS, utilizando células HLA-1-negativas para un flanco y células HLA-1-positivas para el otro flanco del mismo ratón. Para cada dilución, utilice 10 ratones. Utilice jeringas 25G con una aguja para las inyecciones.
   5. Controlar la formación de tumores en ratones durante cuatro a ocho semanas, dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor.
   6. Calcular la frecuencia celular que inicia el tumor por el porcentaje de formación de tumores en diferentes números de células de entrada. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1.
3. Diferenciación inducida a lo largo de las vías mesenquimales
   1. Utilice las sarcáselas formadas durante los pasos anteriores (paso 3.1.9). Transfiera las sarcáselas a una nueva placa de 6 pocillos. Cultivo de la sórsfera con 2,5 ml de alfa-MEM complementado con 10% FBS para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa de cultivo.
   2. Después de un accesorio durante dos días, cambie el medio de cultivo de alfa-MEM complementado con 10% FBS a la mezcla 1:1 de alfa-MEM complementado con 10% FBS y medio de crecimiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC).
   3. Después de dos días, cambie a medio de crecimiento hMSC completo.
   4. Cuando las células alcancen una confluencia del 90%, aspire el medio hMSC y agregue un medio de diferenciación. Para la diferenciación osteogénica, añadir medio de diferenciación osteogénica (medio de crecimiento hMSC complementado con 10 nM dexametasona, 5 mM de glicerofosfato, ácido L-ascórbico de 50 g/ml y cloruro de litio de 10 mM). Para la diferenciación lipogénica, añada el medio de diferenciación de adipocitos (medio de crecimiento hMSC complementado con dexametasona de 0,5 m, isobutilometilxantina de 0,5 m y 50 m de indometacina).
   5. Cambie el medio de diferenciación cada tres días.
   6. Después de tres a cuatro semanas, deje de diferenciar y lave las células con PBS. Luego, aspirar el PBS y agregar 2 mL de 10% de formalina a las células para la fijación. Deje que las células se sentén durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lávelos con agua desionizada. Las células ya están listas para la tinción de Alizarin Red S (paso 3.3.6.1) o la tinción de Aceite Rojo O (paso 3.3.6.2).
      1. Para detectar la diferenciación osteogénica, realice la tinción de Alizarin Red S. Aspirar agua y añadir 2 mL de solución de trabajo Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) a las células, y dejarlas sentar durante 5 minutos para la tinción. Lavar las células con agua desionizada y observar la reacción microscópicamente.
      2. Para detectar la diferenciación adipogénica, realice la tinción de aceite rojo O.
         1. Haga una solución de Aceite Rojo O. Preparar una solución en stock añadiendo 300 mg de aceite rojo O en polvo a 100 ml de isopropanol.
         2. Dentro de 2 h antes de usar, mezcle tres partes (30 ml) de la solución de stock de aceite rojo O con dos partes (20 ml) de agua desionizada. Deje que la mezcla se situya durante 10 minutos a temperatura ambiente.
         3. Filtre la solución de trabajo antes de su uso.
         4. Retire el agua de las células preparadas según el paso 3.3.6. Añadir 2 mL de 60% isopropanol para cubrir la monocapa celular y las células se sentan durante 2 min.
         5. Retire el isopropanol y agregue 2 ml de solución de trabajo Oil Red O. Deje que las células se sit durante 5 minutos a temperatura ambiente.
         6. Enjuague las células con agua desionizada y observe la reacción bajo un microscopio de luz.

Resultados

Se generó y teñida un PDX de sarcoma humano. La inmunohistoquímica mostró una heterohistoquímica intratumoral utilizando el anticuerpo HLA-1. El xenoinjerto consistió en dos subpoblaciones distintas, a saber, HLA-1 positiva y negativa (Figura1A)¹². El sarcoma PDX mostró similitudes histológicas con el tumor primario parental (Figura1A). Sarcoma PDX TICs fueron aislados por FACS. Utilizando un método de clasificación doble, las células HLA-1-negativas se enriquecieron altamente a partir de la población de células parentales (Figura1B)¹².

Se encontró que los genes expresados en células madre (por ejemplo, Oct4, Nanog y Myc) se expresaban altamente en células aisladas de HLA-1-negativas en comparación con su contraparte Positiva de HLA-1 (Figura1C). Sox-9, un gen del desarrollo reportado para desempeñar un papel importante en otras células madre cancerosas, como en el carcinoma de mama, se expresaron específicamente en células HLA-1-negativas (Figura1D).

Para validar la subpoblación aislada HLA-1-negativa, se realizó un ensayo de formación de sarcósfera para examinar la capacidad de auto-renovación de las células. Las células HLA-1-negativas fueron capaces de formar esferas con una entrada inicial de tan solo 10 celdas (Figura 1E)¹². Con el fin de examinar la capacidad de formación de tumores, se realizó un ensayo de formación de tumores de dilución en serie. Los mismos números de células HLA-1-negativas y -positivas se inyectaron por vía subcutánea en cada flanco del mismo ratón. Las células HLA-1-negativas mostraron una capacidad de formación tumoral significativamente mayor (Figura1F)¹², mientras que los xenoinjertos formados por subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas eran tumores heterogéneos celulares (Figura1H).

Realizamos un análisis de expresión génica de los TIC aislados HLA-1-negativos¹². Los genes asociados con la diferenciación normal de células mesenquimales fueron elevados en LOS TIC^12. Por lo tanto, también probamos si los TIC HLA-1 pueden inducirse a la diferenciación terminal y dar lugar a una disminución de la capacidad de formación de tumores. Los resultados mostraron que las células HLA-1-negativas pueden ser inducidas para diferenciara a lo largo de las vías lipogénicas y osteogénicas y muestran fuerte aceite rojo O y alizarin a la mancha roja (Figura1G). Por el contrario, las células Positivas HLA-1 no se diferencian en las mismas condiciones. Por lo tanto, estos resultados indican una prometedora estrategia de terapia diferenciada que se puede utilizar para atacar los TIC de sarcoma.

Figura 1: Aislamiento de células HLA-1-negativas de PDX de sarcoma heterotúmicos intratumorales. (A) Células HLA-1-negativas (flechas) se encontraron en diferentes subtipos de sarcomas humanos por inmunohistoquímica (IHC). (a y b) Sarcoma de células claras. (c y d) Liposarcoma pleomórfico. (e y f) Leiomyosarcoma. (g y h) Tumor maligno de la vaina del nervio periférico. (i y j) Liposarcoma, no especificado de otro modo. (k y l) Liposarcoma desdiferenciado. La barra de escala de 100 m. (B) los PDX de sarcoma eran histológicamente similares al tumor parental (mancha de hematoxilina y eosina [H&E]) y mostraban heterogeneidad celular en la expresión HLA-1 de IHC. Aquí se muestran imágenes representativas de los PDX del sarcoma, incluyendo un sarcoma de células claras (CCS), un condrosarcoma desdiferenciado (DCS) y un liposarcoma desdiferenciado (DDL). Barra de escala a 100 m. (C) La subpoblación de células HLA-1-negativas se aisló mediante citometría de flujo con un método de doble ordenación. De arriba abajo: primera clasificación, segunda clasificación y comprobación de pureza. Las células aisladas HLA-1-negativas y HLA-1-positivas fueron sometidas a un análisis funcional posterior, incluyendo un ensayo de formación tumoral. Los resultados de esta cifra son de una publicación anterior¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Caracterización de LOS TIC HLA-1-negativos mediante ensayos funcionales. (A) Un ensayo de formación de esferas mostró que tan solo 10 células HLA-1-negativas eran capaces de formar esferas de sarcoma. Izquierda: imágenes representativas de esferas de sarcoma. Derecha: frecuencia de formación de esferas; Media : SD. Barra de escala de100 m. (B ) Las células HLA-1-negativas aisladas del sarcoma PDX eran altamente tumorigénicas. Aquí se muestran imágenes representativas del tumor formado por células HLA-1-negativas y -positivas de DDL. Se inyectaron mil células de células DDL HLA-1-negativas y HLA-1-positivas en flancos separados del mismo ratón. (C) Los niveles de ARNm de los genes de células madre Oct4, Nanogy Myc se expresaron en niveles más altos en células HLA-1-negativas en comparación con las células positivas de HLA-1. Los datos representan la media de SD (n s 5). (D) La fuerte tinción positiva de Aceite Rojo O y Alizarin Red S muestra una diferenciación terminal a lo largo de las vías lipogénicas y osteogénicas que se inducen a partir de TIC de sarcoma. (E) Inmunomanchación HLA-1 de PDX formadapor por subpoblaciones HLA-1-positivas (izquierda) y -negativas (derecha). Barra de escala a 100 m. Los resultados de esta cifra son de una publicación anterior¹². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Hay varios pasos críticos que limitan el éxito de este protocolo para aislar y caracterizar las células que inician tumores de las PDX del sarcoma humano. Observamos que la formación de PDX depende en gran medida de los subtipos de sarcoma. Sarcomas clínicos agresivos con fenotipo histológicamente indiferenciado (p. ej., sarcomas plémficos indiferenciados [tasa de éxito 100%, n a 2], liposarcomas desdiferenciados [tasa de éxito 100%, n a 2] y sarcomas sinoviales [ tasa de éxito 100%, n . 3]) tienen una alta tasa de éxito de la formación de PDX. Mientras tanto, los sarcomas con fenotipos diferenciados (por ejemplo, liposarcomas bien diferenciados [tasa de éxito 0%, n a 3]) muestran tasas de formación pdX más bajas. Es posible que las células que inician tumores estén presentes en subtipos más malignos en un porcentaje mayor que en subtipos menos malignos y diferenciados. Además, recomendamos terminar el procedimiento de aislamiento celular que inicia el tumor en un día sin ningún tipo de parada para minimizar cualquier pérdida de viabilidad celular.

Hemos identificado que las células HLA-1-negativas existen ampliamente en los sarcomas humanos. Pero el porcentaje de células HLA-1-negativas puede variar entre muestras de diferentes pacientes. Por este método, hemos aislado con éxito las células que inician tumores de muestras que tienen células HLA-1-negativas que van desde menos de 0.5% a más de 30%¹². Es importante caracterizar las células HLA-1-negativas funcionalmente por la formación de esferas y ensayos de formación de tumores para confirmar la identidad celular que inicia el tumor de células aisladas HLA-1-negativas.

Sin embargo, el protocolo presentado aquí también tiene limitaciones. Los datos anteriores mostraron que la expresión HLA-1 está regulada epigenéticamente, lo que es consistente con la observación de la heterogeneidad celular de la expresión HLA-1 dentro del mismo tumor^12. Se detectaron mutaciones genómicas de HLA-1 en sarcomas y otros tipos de cáncer. Las mutaciones en los genes HLA-1 pueden conducir a la pérdida completa de HLA-1 en la superficie celular de todo el tumor o a expresar HLA-1 mutado no funcional. En cualquier caso, la negatividad HLA-1 no se puede utilizar para identificar los TIC dentro del tumor.

Utilizando HLA-1 como marcador negativo, hemos aislado con éxito LOS TIC de una variedad de subtipos de sarcoma humano y validado nuestros resultados mediante análisis funcionales. Así, pudimos realizar estudios moleculares, incluido el análisis de la expresión génica en los TIC, con el fin de desarrollar un tratamiento específico dirigido a estos TIC.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm cell culture filter	ThermoFisher	450-0020
100 mm Petri dish	Falcon	353003
15 mL conical tube	Falcon	352196
35 μm cell strainer	Falcon	352340
50 mL polystyrene tube	Falcon	352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate	Corning	7007
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
B-27	Gibco	08-0085SA
bFGF	Invitrogen	PHG0021
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
EGF	Invitrogen	PHG0311
HLA-1-PE antibody	Abcam	ab43545
hMSC growth medium	ATCC	PCS-500-030
indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
isobutylmethylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
Isotype Control Antibody	Abcam	ab103534
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354230
MEM Alpha	Gibco	12571-063
N2	Gibco	17502-048
NSG mice	The Jackson Lab	005557
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
PBS	Corning	21-040-CM
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Syringe with needle	BD	309626
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422