בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד של תאים מתחילים הגידול מחולה סרקומה האדם נגזר xenografts תלי על ידי מיון מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית, באמצעות אנטיגן לוקיציט אנושי-1 (HLA-1) כסמן שלילי, ועל אימות נוסף האפיון של התאים האלה HLA-1-שלילי גידול מתחיל.

Abstract

הקיום והחשיבות של תאים מתחילים הגידול (טיקים) נתמכים על ידי הגדלת ראיות בעשור האחרון. טיקים אלה הוכחו להיות אחראים לחניכה הגידול, גרורות, והתנגדות לסמים. לכן, חשוב לפתח טיפול ספציפיים למיקוד טיק בנוסף אסטרטגיות כימותרפיה הנוכחית, אשר בעיקר להתמקד על הכמות של הלא טיקים. כדי להבין עוד יותר את המנגנון מאחורי ממאירות של טיקים, אנו מתארים שיטה לבודד ולאפיין טיקים בסרקומות אנושיים. בזאת, אנו מראים פרוטוקול מפורט כדי ליצור החולה נגזר שתלי xenografts PDXs) של סרקומות אנושיים ולבודד טיקים על ידי מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) באמצעות מחלקת אנטיגן לוקיציט האדם I (HLA-1) כסמן שלילי. כמו כן, אנו מתארים כיצד לאפיין מבחינה פונקציונלית טיקים אלה, כולל שיטת היווצרות הספירה ושיטת היווצרות הגידול, כדי לגרום לבידול לאורך מסלולים mesenchymal. הבידוד והאפיון של הטיקים PDX לספק רמזים לגילוי של ריאגנטים לטיפול מיקוד פוטנציאלי. יתר על כן, הראיות הגוברת עולה כי פרוטוקול זה עשוי להיות מורחב עוד יותר כדי לבודד ולאפיין טיקים מסוגים אחרים של סרטן האדם.

Introduction

טרוגניות הסלולר intrאטומוראלית של סרטן האדם נתמך על ידי הגדלת ראיות במהלך העשור האחרון¹. בדומה רקמות נורמלי, סרטן רקמת מורכב תת אוכלוסייה קטנה של טיקים (נקרא גם תאי גזע הסרטן), אשר מוצג היכולת ליצירת גידול; בינתיים, רוב התאים הסרטניים התערוכה פנוטיפים הבדיל². אלה טיקים להראות מאפיינים כמו תא גזע, כולל הביטוי של סמן תא גזע ואת היכולת של שני התחדשות עצמית ו-אסימטרית החטיבה התא, ולכן, יכול ליזום את היווצרות של גידול הטרוגנית הסלולר³. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי טיקים הם לא רק אחראי חניכה הגידול אבל הם גם קשורים תוקפנות הגידול⁴, גרורות⁵, התנגדות תרופה⁶. לכן, חשוב להבין את הביולוגיה של טיקים, ובכך, לפתח אסטרטגיית טיפול ספציפי מיקוד אלה טיקים.

FACS מבוססי שיטות שימשו כדי לזהות טיקים באמצעות סמנים טיקים, כולל CD133, CD24, ו CD44¹. רוב הסמנים הללו מבוטאים גם בתאי גזע נורמליים⁷. עם זאת, אף אחד מהסמנים הללו אינו מסמן אך ורק טיקים. התפקידים מולקולות אלה לשחק ממאירות של טיקים עדיין לא ברור. לדוגמה, CD133 יכול להיות מופעל לעתים קרובות על ידי מתילציה DNA, ולכן, זה טרוגניות intertumoral עשוי להפוך את הדיוק של סמנים אלה⁸. ALDH1 הוא סמן כי גם פונקציות כדי לשמור על הסטנס של טיקים⁹. זה נראה יעיל יותר בזיהוי טיקים סרטן השד אבל הוא עדיין בספק בסוגי גידולים אחרים⁹. כמה מסלולים איתות לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה תא גזע, כולל Wnt (שילוב כנפיים הקשורות אתר), TGF-β (שינוי גורם הצמיחה ביתא), ו קיפוד¹. אבל קשה להוכיח כי מסלולים אלה הם טיק ספציפיים להשתמש בפעילות של מסלולים אלה כדי לבודד טיקים מפני גידולים ראשוניים. לפיכך, סמן מהימן של הספר טיק הדרוש בדחיפות.

האדם MHC מחלקה אני, נקרא גם HLA-1, הוא חלבון משטח התא המבוטא כמעט כל התאים הנוקלאומים¹⁰. HLA-1 פונקציות כמו אנטיגן הצגת מולקולה המזוהה באופן מפורש על ידי CD8 T תאים¹⁰. ההשפעה ציטוטוקסיט של תאים CD8 T ניתן להפעיל כאשר תאים סרטניים להציג אנטיגן הגידול על ידי HLA-1. לכן, חסר HLA-1 על משטח התא של התאים הסרטניים יכול להוביל לבריחה החיסונית מתאי T ציטוטוקסיט CD8. Downregulation של HLA-1 תוארה בסוגים שונים של סרטן האדם הוא מתואם עם פרוגנוזה נמוכה, גרורות, התנגדות תרופה¹¹. הצגנו כי אובדן ביטוי hla-1 על פני השטח התא יכול לשמש כדי לזהות טיקים ב סרקומות, כמו גם סרטן הערמונית^6,12.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי לבודד טיקים מ-סרקומה האדם PDXs על ידי FACS, באמצעות HLA-1 כסמן שלילי, כדי לוודא עוד ולאפיין אלה HLA-1-שלילי טיקים.

Protocol

כל הפרוטוקולים לניסויי העכבר שנדונו כאן היו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על-ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי בהר סיני, וועדת הבריאות והשימוש בבעלי חיים.

1. עיבוד של דגימת רקמות סרקומה, ו PDX היווצרות

1. תחת הלוח סקירה מוסדית-פרוטוקול מאושר, יש אנשי שירות פתולוגיה להכין דגימות סרקומה מדגימות ניתוח ומיד לשים כל מדגם על הקרח בצלחת פטרי 100 מ"מ.
2. מניחים את המדגם לתוך 15 מ ל פוליסטירן מוקצף עם שפופרת 6 מ ל של הקרה ברוזוול פארק הזיכרון המכון (RPMI) 1640 תרבות בינונית בתוספת של 10% סרום בצורת העובר (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. . תעבד את דגימת הרקמה מיד
3. אופציונלי עבור אוסטאוסרקומה בלבד, בצע את השלבים הבאים, אשר ניתן לדלג על סרקומה רקמות רכות.
   1. חותכים את הרקמה 20 מ"מ³ חתיכות באמצעות אזמל. העבר את חתיכות הרקמה לצינור 15 מ"ל המכיל 3 מ ל של התמיסה הקולגן (RPMI 1640 עם 1 מ"ג/mL קולגן).
   2. הכניסו את הצינור לאמבט מים ב-37 ° c למשך 30 דקות.
   3. ביסודיות מערבולת הצינור, ולאחר מכן, להוסיף 3 מ ל של RPMI 1640 שיושלם עם 10% FBS לנטרל את הפעילות הקולגן.
   4. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g בטמפרטורת החדר. . הסר את הסופרנטאנט
4. לעבוד בארון ביולוגי סטרילי, למקם את דגימת הרקמה בצלחת פטרי 100 מ"מ. הוסף 500 μL של תמיסת מלח מאגור באגירה 1 x פוספט (PBS) לרקמה. עם אזמל סטרילי, קצוצות מכנית הרקמה לחתיכות קטנות עד שום פיסת רקמות נראה גדול יותר מ 0.1 מ"מ.
5. העבר את ההשעיה של התא 500 μl אל מסננת תא 35 יקרומטר ולאסוף את ההשעיה מסוננים עם שפופרת קלקר 50 mL. הניחו את הצינורית ה50 mL עם ההשעיה של התא על הקרח.
6. הוסף עוד 500 μL של PBS לרקמות. Triturate בפעם השנייה, להעביר את ההשעיה דרך מסננת התא, ולאסוף אותו לתוך אותו צינור 50 mL.
7. חזור על שלבים אלה (שלבים 1.5 – 1.6) עד מקטע הרקמה הוא הנתק לחלוטין, בדרך כלל 6x-8x.
8. גלולה ההשעיה התא ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את הגלולה באמצעות 5 מ ל של מאגר המוליזה (0.15 M NH₄Cl, 10 מ"מ khco₃, ו 0.1 מ"מ edta), ו דגירה את הפתרון עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כדוריות הדם האדומות.
9. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g בטמפרטורת החדר ולהסיר את מאגר המוליזיס. רחץ את הגלולה עם 5 מ ל של PBS. צנטריפוגה שוב עבור 5 דקות ב 350 x g ולהסיר את supernatant.
10. השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של PBS ולספור את מספר התא קיימא באמצעות הומוציטוטומטר או כל שיטה חלופית אחרת. לדלל את התאים לריכוז הסופי של 1 x 10⁷ תאים ב 200 ΜL של PBS. . תשאיר את ההשעיה של התא על הקרח
11. להשאיר את מטריצת הממברנה במרתף על הקרח כדי לאפשר לו להמיס. הוסף 200 μL של מטריצת קרום המרתף להשעיה של התאים 200 μL. לערבב בעדינות ולשמור על קרח.
12. תת-עורי להזריק את ההשעיה התא: מטריצה קרום המרתף (1:1) התערובת לתוך שני בהנהון scid גמא (NSG) העכברים לתוך האגפים שלהם. השתמש ב-200 μL עבור כל זריקה.
13. נטר את היווצרות PDX על-ידי בדיקת אתר ההזרקה של העכברים 2x בשבוע. הסר את השתל מבע גידול כאשר הוא מגיע 1 ס מ קוטר.

2. בידוד של הגידול-מאתחל תאים על ידי FACS מ-PDX

1. הסר את ה-PDX מהעכברים כפי שמתואר קודם לכן^ב-12.
2. . תחתוך את הגידול לחצי לתקן חצי של השתל עם 4% פאראמפורמלדהיד בלילה. . זה בשביל ניתוח היסטולוגית לעבד את החצי השני של הרקמה כמתואר לעיל (שלבים 1.3 – 1.8) כדי לקבל השעיה תא הגידול.
3. . ותספור את מספר התא האפשרי
4. לדלל את ההשעיה התא ב-PBS בתוספת עם 5% FBS לריכוז של 2 x 10⁶ תאים/mL. להשאיר את ההשעיה התא על קרח 30 דקות. חלק את ההשעיה התא מעל שתי שפופרות. סמן את החצוצרות בעזרת. בקרת איזוטופ ונוגדן, בהתאמה שים לב למספר התאים בכל צינורית.
5. להכין 2x HLA-1-PE נוגדן על ידי דילול הנוגדן עם PBS בתוספת עם 5% FBS (1:250). לדלל את הנוגדן בקרת איזוטיפ שלילי עם אותו מצב. לערבב את ההשעיה התא מן הצינור "נוגדן" עם נוגדנים מדולל (1:1) כדי להפוך את הנוגדן הסופי דילול 1:500. ערבב את ההשעיה של התא מצינור "שליטת איזוטופ" עם בקרת איזוטופ (1:1). שים את השעיות התאים על קרח עבור 90 דקות.
6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 10 מ ל של PBS לשטוף את 2x גלולה.
7. הוסף 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) כדי PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. הוסף פתרון DAPI זה לגלולה התא כדי ליצור השעיית תא של 10⁷ תאים/mL (באמצעות מספרי התאים משלב 2.4).
8. לסנן את ההשעיה התא דרך 35 יקרומטר כמוסות מסננת לתוך 12 מ"מ x 75 מילימטר מצינורות פוליסטירן.
9. השתמש cytometer זרם כדי למיין את HLA-1-שלילי TIC אוכלוסיית המשנה⁶. השער תאים קיימא (DAPI-שלילי) ולאסוף את שני אוכלוסיות HLA-1-שלילי ו-חיובי לתוך 2 15 mL אוסף צינורות, כל אחד המכיל 4 מ ל של RPMI 1640 תרבות בינונית.

3. אפיון הגידול בתאים מתחילים

1. מבנה Sarcosphere
   1. להפוך sarcosphere בינונית צמיחה, באמצעות מדיום התרבות תא אלפא. הוסף תוספי מזון כדי להפוך את הריכוז הסופי של תוספי B-27 (1x), N2 תוספי מזון (1x), מקדם הצמיחה פיברופיצוץ בסיסי (bFGF) (20 ng/mL), ומקדם צמיחה עוריות (EGF) (20 ng/mL) ו פניצילין/סטרפטומיצין (100 IU/mL). סנן את המדיום באמצעות מסנן תרבות תא מ0.2 יקרומטר לפני השימוש.
   2. מצנעה את האוכלוסיה המויינת HLA-1-שלילית וחיובית משלב 2.9 וסופרת את מספרי התאים של כל אחד מאוכלוסיית המשנה.
   3. לדלל 1.5 x 10⁶ תאים לתוך 15 מ ל של בינוני גדילה sarcosphere כדי להפוך את הדילול התא של 1 x 10⁵ תאים/mL.
   4. סרילית לדלל את התאים עם sarcosphere טרי צמיחה בינונית כדי להפוך 15 מ ל של כל דילול התא של 10⁴, 10³, ו 10² תאים/mL. אז, להכין 4 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחיות התרבות התא, כל אחד עבור דילול התא.
   5. העבר 100 μL של השעיית תא מתוך 10⁵ תאים/לדילול כל הטוב של הראשון 96-ובכן אולטרה מצורף הקובץ המצורף לצלחת התרבות. צלחת זו יש 10⁴ תאים בכל טוב.
   6. השתמש השני 3 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחות תרבות תא עבור שלושת התאים האחרים: 10⁴, 10³, ו 10² תאים/mL. העבר 100 μL של השעיית התא לכל טוב של 96-ובכן אולטרה מצורף לוחיות הזיהוי של התרבות התא. אלה שלוש לוחיות התרבות יש 1,000 תאים/ובכן, 100 תאים/טוב, ו 10 תאים/ובכן, בהתאמה.
   7. הכניסו את הלוחות לתוך 37 ° c, 5% חממה לתרבית תאים.
   8. להוסיף bFGF ו EGF חדש ישירות למדיום תרבות התא (ריכוז סופי של 20 ng/mL) כל שלושה ימים מבלי לשנות את המדיום כדי למנוע תאים אבודים בתרבות ההשעיה.
   9. באמצעות מיקרוסקופ קל, מפקחים על היווצרות הsarcosphere מדי יום במשך שלושה שבועות, כפי שמוצג באיור 2A.
   10. לאחר שלושה שבועות, ספור את מספר הבארות הsarcosphere והבארות הsarcosphere-שליליות של כל דילול התא עבור תאים שליליים ו-hla-1-שלילי ו-HLA-1-חיוביים.
   11. חישוב תדר התא היוצר את הספירה בהתבסס על התפלגות ההסתברות של פואסון¹³. השווה את הטיקים HLA-1-שלילי עם התאים הגורפת HLA-1-חיוביים.
2. שיטת גידול בדילול סדרתי
   1. ספור את אוכלוסיית המשנה HLA-1-שלילית וחיובית משלב 2.9.
   2. להפוך דילול סדרתי של התאים עם PBS לריכוזים של 10⁶, 10⁵, 10⁴, ו 10³ תאים/mL. השתמש 1 mL של כל דילול עבור היווצרות הגידול ב 10 עכברים.
   3. הוסף 1 מ ל של מטריצה קרום המרתף 1 mL השעיית התא של כל דילול (1:1). שמור את 2 מ ל של כל תערובת על הקרח.
   4. תת-עורי להזריק 200 μL של התא: מטריצה מרתף ממברנה תערובת לתוך מאגפים של עכברים NGS, באמצעות HLA-1-תאים שליליים עבור אגף אחד ותאים HLA-1-חיובי עבור האגף השני של העכבר אותו. עבור כל דילול, השתמש 10 עכברים. השתמש מזרקים 25G עם מחט עבור הזריקות.
   5. ניטור היווצרות הגידול בעכברים במשך ארבעה עד שמונה שבועות, בהתאם לקצב צמיחת הגידול.
   6. חישוב תדר התא היוזם הגידול על ידי אחוז היווצרות הגידול במספרים שונים תא קלט. השווה את הטיקים HLA-1-שלילי עם התאים הגורפת HLA-1-חיוביים.
3. בידול מושרה לאורך מסלולים של המסכמצ'אל
   1. השתמש בsarcospheres שנוצרו במהלך השלבים הקודמים (שלב 3.1.9). העבירו את הsarcospheres. לצלחת 6-טוב חדשה תרבות הsarcosphere עם 2.5 mL של אלפא-מגברתי בתוספת עם 10% FBS כדי לאפשר לתאים לצרף למשטח התרבות.
   2. לאחר החזקה במשך יומיים, להחליף את מדיום התרבות מ-alpha-הגברת שיושלם עם 10% FBS לתערובת 1:1 של אלפא מגברת בתוספת עם 10% FBS ו-האנושי mesenchymal תא גזע (hMSC) גידול בינוני.
   3. לאחר יומיים, עבור להשלמת הצמיחה hMSC בינונית.
   4. כאשר התאים מגיעים 90% השטף, להפיח את המדיום hMSC ולהוסיף בינוני. עבור בידול אוסטגניים, להוסיף הבחנה אוסטגניים בינונית (hMSC בינונית צמיחה שיושלם עם 10 ננומטר dexamethone, 5 מ"מ β-glycerophosphate, 50 μg/mL-חומצה אסקורבית, ו 10 מ"מ ליתיום כלוריד). עבור בידול ליפוגני, להוסיף אדיפוציט בידול בינוני (hMSC בינונית צמיחה בתוספת עם 0.5 μM dexamethone, 0.5 μM isoבוטיליקסאת, ו 50 μM indomethacin ו).
   5. לשנות את מדיום בידול כל שלושה ימים.
   6. לאחר שלושה עד ארבעה שבועות, להפסיק את הבידול ולשטוף את התאים עם PBS. לאחר מכן, משף את הערוץ ומוסיף 2 מ ל 10% פורמלין לתאים עבור קיבעון. תנו לתאים לשבת 45 דקות בטמפרטורת החדר. רוחצים אותם במים מפוהים. התאים עכשיו מוכנים אליזרין אדום הצביעת (שלב 3.3.6.1) או שמן כתמים Red O (שלב 3.3.6.2).
      1. כדי לזהות בידול אוסטגניים, לבצע כתמים של אליזרין אדום. מכתים מים ומוסיפים 2 מ ל של הפתרון העובד האדום של אליזרין (2% Aliזרין אדום, pH 6.0) לתאים, ולתת להם לשבת 5 דקות לצביעת. רוחצים את התאים במים מפוהים ורואים את התגובה המיקרוסקונית.
      2. כדי לזהות בידול אדיפוגני, לבצע כתמים שמן אדום O.
         1. לעשות פתרון שמן אדום או. הכנת פתרון מניות על ידי הוספת 300 מ"ג של אבקת שמן אדום O ל 100 mL של איזופנול.
         2. בתוך 2 h לפני השימוש, מערבבים שלושה חלקים (30 mL) של פתרון מניות של שמן אדום O עם שני חלקים (20 מ ל) של מים מוהים. אפשר לתערובת לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר.
         3. סנן את פתרון העבודה באמצעות לפני השימוש.
         4. להסיר את המים מן התאים שהוכנו על פי שלב 3.3.6. הוסף 2 מ ל של 60% איזופנול כדי לכסות את תא מונאולייר ואת התאים לשבת 2 דקות.
         5. להסיר את האיזופנול ולהוסיף 2 מ ל של שמן אדום O פתרון עבודה. אפשר לתאים לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר.
         6. שטפו את התאים במים מפוהים וצפו בתגובה שמתחת למיקרוסקופ אור.

תוצאות

סרקומה של האדם PDX נוצר ומוכתם. טרוגניות האינטרואטומוראלית הוצגה על ידי הנוגדן האנטי-מימי. השתלת מבע ורכבת משתי אוכלוסיות משנה נפרדות, כלומר hla-1 חיובי ושלילי (איור 1a)¹². ה-סרקומה PDX הראה דמיון היסטולוגית עם הגידול העיקרי הורים (איור 1A). סרקומה PDX טיקים היו מבודדים על ידי FACS. באמצעות שיטת מיון כפולה, התאים HLA-1-שליליים העשירו מאוד מאוכלוסיית תאי ההורים (איור 1B)¹².

גנים הביע בתאי גזע (g., Oct4, Nanog, ו Myc) נמצאו מבוטא במידה רבה בתאים HLA-1-שליליים מבודדים כאשר לעומת עמיתו HLA-1-חיובית (איור 1C). סוקס -9, גן התפתחותי שדווח לשחק תפקידים חשובים בתאי גזע אחרים בסרטן, כגון בתוך קרצינומה של השד, הביעו במפורש בתאי HLA-1-שלילי (איור 1D).

כדי לאמת את אוכלוסיית המשנה הבודדת HLA-1-שלילית, בוצעה שיטת היווצרות sarcosphere כדי לבחון את יכולת החידוש העצמי של התאים. HLA-1-תאים שליליים הצליחו ליצור כדורים עם קלט הראשונית של מעט כמו 10 תאים (איור 1E)¹². על מנת לבחון את יכולת יצירת הגידול, בוצע שיטת היווצרות הגידול הטורית-דילול. אותם מספרים של תאים HLA-1-שליליים ו-חיוביים הוזרקו תת-עורי לתוך כל אגף של העכבר אותו. HLA-1-תאים שליליים הראה יכולת היווצרות הגידול גבוה באופן משמעותי (איור 1F)¹², בעוד xenografts נוצר על ידי שני hla-1-שלילי ו-חיובי האוכלוסיות היו גידולים סלולריים הטרוגנית (איור 1f).

בוצע ניתוח של ביטוי גנים של ה-HLA-1-שלילי טיקים מבודדים¹². גנים הקשורים לבידול תא mesenchymal נורמלי היו גבוהים ב טיקים¹². לכן, בדקנו גם אם HLA-1 טיקים יכול להיות המושרה בידול מסוף ותוצאה יכולת היווצרות הגידול ירד. התוצאות הראו כי התאים HLA-1-שלילי יכול להיות המושרה להבדיל לאורך שני המסלולים האוסטגניים ולהראות חזק שמן אדום O ו Alizarin אדום S צביעת כתמים (איור 1G). לעומת זאת, התאים HLA-1-חיוביים אינם מבדילים תחת אותם תנאים. כך, תוצאות אלה מצביעים על אסטרטגיה מבטיחה טיפול מובחנים כי ניתן להשתמש כדי למקד את החומרים סרקומה.

איור 1: בידוד של HLA-1-תאים שליליים מן הטרוגנית intratumoral סרקומה PDXs. (א) hla-1-שלילי תאים (חיצים) נמצאו סוגים שונים של סרקומות אנושיים על ידי אימונוהיסטוכימיה (ihc). (a ו-b) לנקות סרקומה תא. (c ו-d) ליפוסרקומה פלאומורפית. (e ו-f) . ליואוסרקומה (ז ו ח) גידול ממאיר במעטפת. העצבים ההיקפית (i ו-j) ליפוסרקומה, לא צוין אחרת. (k ו-l) . בסדר. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) סרקומה pdxs היו דומים היסטולוגית לגידול הורים (המטאוקסילין ו-&Amp; אאוזין E] כתם) והראה טרוגניות הסלולר בביטוי hla-1 על ידי ihc. להלן מוצגים תמונות מייצגות של סרקומה PDXs, כולל סרקומה תא ברור (סמ ק), כונדרוסרקומה הבדיל (DCS), ו ליפוסרקומה ביטול (DDL). סרגל קנה מידה = 100 μm. (ג) אוכלוסיית המשנה של התאים hla-1-שליליים בודדה על ידי הזרימה cy, try עם שיטת מיון כפול. מלמעלה למטה: מיון ראשון, מיון שני ובדיקת טוהר. מבודדים HLA-1-שלילי ו HLA-1-תאים חיוביים היו חשופים ניתוח פונקציונלי הבאים, כולל שיטת היווצרות הגידול. התוצאות מאיור זה הן מפרסום קודם של¹². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון של HLA-1-שלילי טיקים על ידי מוסר פונקציונלי. (א) שיטת היווצרות כדור הראה כי כמה כמו 10 hla-1-תאים שליליים הצליחו ליצור כדורים סרקומה. משמאל: תמונות מייצגות של כדורי סרקומה. מימין: תדר יוצר הספירה; מתכוון ± SD. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) hla-1-תאים שליליים מבודדים מתוך ה-סרקומה pdx היו מאוד tuמוריגניים. כאן מוצגים תמונות מייצגות של הגידול שנוצר על ידי תאים HLA-1-שליליים ו-חיוביים מ-DDL. אלף תאים של HLA-1-שלילי ו-HLA-1-תאים DDL חיובי הוזרקו באגפים נפרדים של אותו עכבר. (ג) רמות mrna של תאי גזע הגנים Oct4, Nanog, ו myc הביעו רמות גבוהות יותר בתאים hla-1-שליליים לעומת תאים hla-1-חיוביים. הנתונים מייצגים את הממוצע ± SD (n = 5). (ד) חזק כתמים חיוביים של שמן אדום O ו Alizarin אדום S מראה בידול מסוף לאורך מסלולים האוסטגניים המושרה הנגרמת מטיקים סרקומה. (ה) hla-1 חיסוני של pdxs נוצר על-ידי hla-1-חיובי (שמאל) ושלילי (מימין) אוכלוסיות משנה. סרגל קנה מידה = 100 μm. התוצאות מאיור זה הן מפרסום קודם של¹². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ישנם כמה שלבים קריטיים אשר מגבילים את ההצלחה של פרוטוקול זה כדי לבודד ולאפיין את התאים היוזמים הגידול מ-סרקומה של האדם PDXs. סרקומה האדם כולל סוגי מסוגים שונים רבים. הבחנו כי היווצרות PDX הוא תלוי מאוד בסוגי סרקומה. סרקומות אגרסיבי קליני עם מובחן היסטולוגית פנוטיפ (g., מובחן הסרקומות [שיעור הצלחה 100%, n = 2], הבדיל ליפוסרקומות [הצלחה שיעור 100%, n = 2], ו אמתחת סרקומות [ שיעור הצלחה 100%, n = 3]) יש שיעור הצלחה גבוה של מערך pdx. בינתיים, סרקומות עם פנוטיפים הבדיל (למשל, היטב מובחנת ליפוסרקומות [שיעור הצלחה 0%, n = 3]) להראות נמוך יותר pdx שיעורי היווצרות. ייתכן כי תאים היוזמים את הגידול נמצאים תת-סוגי ממאירים יותר באחוזים גבוהים יותר מאשר בסוגי המשנה פחות ממאירים, מובחנים. בנוסף, אנו ממליצים לסיים את הליך הבידוד היוזם התהליך בידוד בתוך יום אחד ללא כל עצירה כדי למזער כל אובדן של הכדאיות התא.

זיהינו שתאי HLA-1-שליליים. קיימים באופן נרחב בסרקומות אנושיים אבל אחוז התאים HLA-1-שלילי יכול להשתנות בין דגימות מחולים שונים. בשיטה זו, יש לנו בהצלחה בידוד תאים מתחילים הגידול מדגימות כי יש HLA-1-שלילי תאים החל פחות מ 0.5% כדי יותר מ 30%¹². חשוב לאפיין את התאים hla-1-שלילית פונקציונלי על ידי היווצרות הספירה היווצרות הגידול בחני לאשר את הגידול-יוזם זהות התא של התאים hla-1-שליליים מבודדים.

עם זאת, לפרוטוקול המוצג כאן יש גם מגבלות. הנתונים הקודמים הראו כי HLA-1 ביטוי הוא מוסדר גנטית, אשר עקבי עם התבוננות של טרוגניות הסלולר של HLA-1 בתוך הגידול אותו¹². HLA-1 מוטציות גנומית זוהו סרקומות וסוגי סרטן אחרים. מוטציות ב HLA-1 גנים עשויים להוביל לאובדן מוחלט של HLA-1 על משטח התא בגידול כולו או כדי לבטא מוטציה לא תפקודית HLA-1. בכל מקרה, לא ניתן להשתמש ב-HLA-1 שליליות כדי לזהות טיקים בתוך הגידול.

באמצעות HLA-1 כסמן שלילי, יש לנו בהצלחה מבודד טיקים מתוך מגוון של תתי-סוגי סרקומה אנושיים ומאומת התוצאות שלנו על ידי ניתוח פונקציונלי. כך, הצלחנו לבצע מחקרים מולקולריים כולל ניתוח ביטוי גנים על טיקים, כדי לפתח טיפול ספציפי מיקוד אלה טיקים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm cell culture filter	ThermoFisher	450-0020
100 mm Petri dish	Falcon	353003
15 mL conical tube	Falcon	352196
35 μm cell strainer	Falcon	352340
50 mL polystyrene tube	Falcon	352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate	Corning	7007
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
B-27	Gibco	08-0085SA
bFGF	Invitrogen	PHG0021
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
EGF	Invitrogen	PHG0311
HLA-1-PE antibody	Abcam	ab43545
hMSC growth medium	ATCC	PCS-500-030
indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
isobutylmethylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
Isotype Control Antibody	Abcam	ab103534
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354230
MEM Alpha	Gibco	12571-063
N2	Gibco	17502-048
NSG mice	The Jackson Lab	005557
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
PBS	Corning	21-040-CM
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Syringe with needle	BD	309626
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422