Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

Riepilogo

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Abstract

L'esistenza e l'importanza delle cellule che provocano tumori (TCI) sono state supportate da prove crescenti nel corso dell'ultimo decennio. Questi TIC hanno dimostrato di essere responsabile per l'avvio del tumore, metastasi, e la resistenza ai farmaci. Pertanto, è importante sviluppare una terapia specifica di targeting TIC oltre alle attuali strategie di chemioterapia, che si concentrano principalmente sulla maggior parte dei non-TIC. Al fine di comprendere ulteriormente il meccanismo alla base della malignità dei CC, descriviamo un metodo per isolare e caratterizzare i TIC nei sarcomi umani. Qui, mostriamo un protocollo dettagliato per generare xenopitrali derivati dal paziente (PDX) di sarcomi umani e per isolare i TIC mediante lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando la classe di antigene leucocito umano I (HLA-1) come marcatore negativo. Inoltre, descriviamo come caratterizzare funzionalmente questi TIC, tra cui un saggio di formazione della sfera e un test di formazione del tumore, e per indurre la differenziazione lungo le vie mesenchymic. L'isolamento e la caratterizzazione dei TIC PDX forniscono indizi per la scoperta di potenziali reagenti terapeutici mirati. Inoltre, sempre più prove suggeriscono che questo protocollo può essere ulteriormente esteso per isolare e caratterizzare i CCI da altri tipi di tumori umani.

Introduzione

L'eterogeneità cellulare intratumorale dei tumori umani è stata supportata da prove crescenti durante l'ultimo decennio¹. Simile al tessuto normale, il tessuto tumorale è costituito da una piccola sottopopolazione di TIC (chiamati anche cellule staminali tumorali), che mostrano capacità di formazione del tumore; nel frattempo, la maggior parte delle cellule tumorali presentano fenotipi differenziati². Questi TIC mostrano proprietà simili a cellule staminali, tra cui l'espressione di un marcatore di cellule staminali e la capacità di auto-rinnovamento e divisione cellulare asimmetrica, e quindi, può avviare la formazione di un tumore eterogeneo cellulare³. Recenti studi hanno rivelato che i TIC non sono solo responsabili dell'avvio tumorale, ma sono anche associati all'aggressività tumorale⁴, metastasi⁵e resistenza ai farmaci⁶. Pertanto, è importante comprendere la biologia dei CC e, quindi, sviluppare una strategia di trattamento specifica mirata a questi CPC.

I metodi basati su FACS sono stati utilizzati per identificare i TIC utilizzando i marker TIC, tra cui CD133, CD24 e CD44¹. La maggior parte di questi marcatori sono espressi anche nelle normali cellule staminali⁷. Tuttavia, nessuno di questi marcatori segna esclusivamente i TIC. I ruoli che queste molecole svolgono nella malignità dei CCI non sono ancora chiari. Ad esempio, IL CD133 può essere spesso inattivato dalla metilazione del DNA, e quindi questa eterogeneità intertumorale può rendere l'accuratezza di questi marcatori⁸. ALDH1 è un marcatore che funziona anche per mantenere lo stelo dei TIC⁹. Sembra essere più efficace nell'identificare i TIC del cancro al seno, ma è ancora discutibile in altri tipi di tumore⁹. Alcuni percorsi di segnalazione svolgono un ruolo importante nella biologia delle cellule staminali, tra cui Wnt (sito di integrazione senza ali), TGF-z (trasformare il fattore di crescita beta) e Hedgehog¹. Ma è difficile dimostrare che questi percorsi sono specifici del TIC e utilizzare l'attività di questi percorsi per isolare i TIC dai tumori primari. Pertanto, è urgentemente necessario un nuovo marcatore TIC affidabile.

L'MHC umano di classe I, chiamato anche HLA-1, è una proteina della superficie cellulare espressa in quasi tutte le cellule nucleate¹⁰. HLA-1 funziona come un antigene che presenta una molecola che è specificamente riconosciuta dalle cellule T CD8¹⁰. L'effetto citotossico delle cellule T CD8 può essere attivato quando le cellule tumorali presentano un antigene tumorale da HLA-1. Pertanto, la mancanza di HLA-1 sulla superficie cellulare delle cellule tumorali può portare a una fuga immunitaria dalle cellule T CD8 citotossiche. La downregolazione di HLA-1 è stata descritta in diversi tipi di cancro umano ed è correlata con prognosi, metastasi e resistenza ai farmaci¹¹. Abbiamo dimostrato che la perdita di espressione HLA-1 sulla superficie cellulare può essere utilizzata per identificare i TIC nei sarcomi, così come nel cancro alla prostata^6,12.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare i TIC dal sarcoma umano PDX da FACS, utilizzando HLA-1 come marcatore negativo, e per convalidare ulteriormente e caratterizzare questi TC HLA-1-negativi.

Protocollo

Tutti i protocolli per gli esperimenti sui topi discussi qui sono stati conformi alle linee guida istituzionali e approvati dal Mount Sinai Medical Center Institutional Human Research Ethics Committee e dal Animal Care and Use Committee.

1. Elaborazione del campione di tessuto Sarcoma e formazione PDX

1. In base a un protocollo approvato dal Consiglio di Revisione Istituzionale, il personale del servizio di patologia prepari campioni di sarcoma da campioni di chirurgia e mette immediatamente ogni campione sul ghiaccio in una parabola Petri da 100 mm.
2. Collocare il campione in un tubo conico in polistirolo da 15 mL con 6 mL di freddo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 coltura medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina. Elaborare immediatamente il campione di tessuto.
3. (Facoltativo) Solo per l'osteosarcoma, seguire i seguenti passaggi, che possono essere saltati per il sarcoma dei tessuti molli.
   1. Tagliare il tessuto in 20 mm³ pezzi con un bisturi. Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo da 15 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenana (RPMI 1640 con 1 collagenae mg/mL).
   2. Mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min.
   3. Vorticare accuratamente il tubo e, quindi, aggiungere 3 mL di RPMI 1640 integrato con 10% FBS per neutralizzare l'attività collagenase.
   4. Centrifuga per 5 min a 350 x g a temperatura ambiente. Togliete il super-acletterante.
4. Lavorando in un armadio sterile di biosicurezza, posizionare il campione di tessuto in una parabola Petri da 100 mm. Aggiungere al tessuto 500 - L di salina sterile 1x con buffer fosfato (PBS). Con un bisturi sterile, triturare meccanicamente il tessuto in piccoli pezzi fino a quando nessun pezzo di tessuto visibile è più grande di 0,1 mm.
5. Trasferire la sospensione a celle da 500 litri in un colino da 35 m e raccogliere la sospensione filtrata con un tubo di polistirolo da 50 mL. Metti questo tubo di polistirolo da 50 ml con la sospensione cellulare sul ghiaccio.
6. Aggiungere altri 500 l di PBS al tessuto. Triturare per la seconda volta, trasferire la sospensione attraverso il colino cellulare, e raccoglierlo nello stesso tubo da 50 mL.
7. Ripetere questi passaggi (passaggi da 1,5 a 1,6) fino a completa dissociazione della sezione tissutale, di solito da 6x a 8x.
8. Pellet la sospensione cellulare per centrifugazione a 350 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il supernatante, risospendere il pellet utilizzando 5 mL di tampone di emolisi (0,15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃e 0,1 mM EDTA), e incubare la soluzione per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere i globuli rossi.
9. Centrifuga per 5 min a 350 x g a temperatura ambiente e rimuovere il tampone di emolisi. Lavare il pellet con 5 mL di PBS. Centrifuga di nuovo per 5 min a 350 x g e rimuovere il supernatante.
10. Risospendere il pellet con 1 mL di PBS e contare il numero di cellulare vitale utilizzando un emocitometro o qualsiasi altro metodo alternativo. Diluire le cellule a una concentrazione finale di 1 x 10⁷ cellule in 200 - L di PBS. Lasciare la sospensione cellulare sul ghiaccio.
11. Lasciare la matrice della membrana del seminterrato sul ghiaccio per lasciarla sciogliere. Aggiungere 200 l di matrice di membrana del seminterrato alla sospensione cellulare 200. Mescolare delicatamente e tenere sul ghiaccio.
12. Inietta sottocutaneamente la miscela di sospensione cellulare: matrice di membrana del seminterrato (1:1) in due topi NOD scid gamma (NSG) nei loro fianchi. Utilizzare 200 gradi L per ogni iniezione.
13. Monitorare la formazione PDX controllando il sito di iniezione dei topi 2x a settimana. Rimuovere lo xenotrapianto tumorale quando raggiunge 1 cm di diametro.

2. Isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore da PARTE del FACS dal PDX

1. Rimuovere chirurgicamente il PDX dai topi come descritto in precedenza¹².
2. Taglia il tumore a metà. Fissare metà della xenotrapianto con il 4% di paraformaldeide durante la notte. Questo è per l'analisi istologica. Elaborare l'altra metà del tessuto come descritto sopra (passaggi 1.3–1.8) per ottenere una sospensione delle cellule tumorali.
3. Risospendere il pellet con PBS e contare il numero di cellulare vitale.
4. Diluire la sospensione cellulare in PBS integrata con 5% FBS ad una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule / mL. Lasciare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 30 min. Contrassegnare i tubi rispettivamente con il controllo degli isotopi e l'anticorpo. Si noti il numero di celle in ogni tubo.
5. Preparare 2x anticorpo HLA-1-PE diluindo l'anticorpo con PBS integrato con 5% FBS (1:250). Diluire l'anticorpo di controllo dell'isotipo negativo con la stessa condizione. Mescolare la sospensione cellulare dal tubo "anticorpo" con anticorpo diluito (1:1) per rendere la diluizione dell'anticorpo finale 1:500. Mescolare la sospensione cellulare dal tubo "controllo isotopo" con il controllo isotopo (1:1). Mettere le sospensioni cellulari sul ghiaccio per 90 min.
6. Centrifuga per 5 min a 350 x g a 4 gradi centigradi e rimuovere il super-natante. Aggiungere 10 mL di PBS per lavare il pellet 2x.
7. Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilitinal (DAPI) alla PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Aggiungere questa soluzione DAPI al pellet cellulare per creare una sospensione cellulare di 10⁷ celle / mL (utilizzando i numeri di cella del passaggio 2.4).
8. Filtrare la sospensione cellulare attraverso tappi di 35 m in tubi in polistirolo da 12 mm x 75 mm.
9. Utilizzare un citometro di flusso per ordinare la sottopopolazione TIC HLA-1-negative⁶. Gate cellule vitali (DAPI-negativo) e raccogliere sia HLA-1-negativo e -positivo sottopopolazioni in due tubi di raccolta 15 mL, ciascuno contenente 4 mL di RPMI 1640 mezzo di coltura.

3. Caratterizzazione delle cellule che hanno invitato il tumore

1. Formazione di sarcosfera
   1. Rendere la sarcosfera di crescita media, utilizzando il mezzo di coltura cellulare alfa-MEM. Aggiungere integratori per fare una concentrazione finale di B-27 integratori (1x), N2 integratori (1x), fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF) (20 ng/mL), e fattore di crescita epidermico (EGF) (20 ng/mL) e penicillina /streptomycin (100 IU/mL). Filtrare il mezzo con un filtro di coltura cellulare di 0,2 m prima dell'uso.
   2. Pellet il sottopopolamento HLA-1-negativo e -positivo ordinato dal punto 2.9 e conta i numeri di cella di ogni sottopopolazione.
   3. Diluire 1,5 x 10⁶ cellule in 15 mL del mezzo di crescita della sarcosfera per rendere la diluizione cellulare di 1 x 10⁵ cellule /mL.
   4. Diluire in modo seriale le cellule con un nuovo mezzo di crescita di sarcosfera per fare 15 mL di ogni diluizione cellulare di 10⁴, 10³e 10² celle / mL. Quindi, preparare quattro piastre di coltura cellulare allegato ultra-basso 96-pozzo, ciascuna per una diluizione cellulare.
   5. Trasferire 100 l di sospensione cellulare da 10⁵ celle/mL di diluizione a ciascun pozzo della prima piastra di coltura cellulare a fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti. Questa piastra ha 10⁴ cellule in ogni pozzo.
   6. Utilizzare le altre tre piastre di coltura cellulare ad attacco ultra-basso del 96-well per le altre tre diluizioni cellulari: 10⁴, 10³e 10² celle / mL. Trasferire 100 l di sospensione cellulare in ogni pozzo delle piastre di coltura cellulare a fissaggio ultra-basso di 96 pozzetto. Queste tre piastre di coltura hanno 1.000 cellule / bene, 100 cellule / bene, e 10 cellule / bene, rispettivamente.
   7. Mettere le piastre in un incubatore di coltura cellulare 37 gradi centigradi, 5% CO_2.
   8. Aggiungere nuovi bFGF ed EGF direttamente al mezzo di coltura cellulare (concentrazione finale di 20 ng/mL) ogni tre giorni senza modificare il mezzo per evitare la perdita di cellule nella coltura delle sospensioni.
   9. Utilizzando un microscopio luminoso, monitorare la formazione di sarcosfera ogni giorno per tre settimane, come mostrato nella Figura 2A.
   10. Dopo tre settimane, contare il numero di pozzi positivi alla sarcosfera e pozzi negativi della sarcosfera di ogni diluizione cellulare sia per le cellule HLA-1-negative che per quelle HLA-1-positive.
   11. Calcolare la frequenza cellulare che forma la sfera in base a una distribuzione di probabilità di Poisson¹³. Confrontare i TC HLA-1-negativi con le cellule sfuse HLA-1-positive.
2. Saggio di formazione del tumore di diluizione seriale
   1. Contare le sottopopolazioni HLA-1-negativo e -positivo dal punto 2.9.
   2. Effettuare diluizioni seriali delle celle con PBS a concentrazioni di 10⁶, 10⁵, 10⁴e 10³ celle /mL. Utilizzare 1 mL di ogni diluizione per la formazione del tumore in 10 topi.
   3. Aggiungere 1 mL di matrice di membrana interrata alla sospensione cellulare da 1 mL di ciascuna diluizione (1:1). Mantenere i 2 mL di ogni miscela sul ghiaccio.
   4. Iniettare sottocutaneamente 200 - L della miscela di matrice della membrana cellulare-basement nei fianchi dei topi NGS, utilizzando cellule HLA-1-negativo per un fianco e cellule HLA-1-positive per l'altro fianco dello stesso topo. Per ogni diluizione, utilizzare 10 topi. Utilizzare siringhe 25G con ago per le iniezioni.
   5. Monitorare la formazione del tumore nei topi per quattro-otto settimane, a seconda del tasso di crescita del tumore.
   6. Calcolare la frequenza cellulare che ha intuito il tumore in base alla percentuale di formazione del tumore a diversi numeri di cellule di input. Confrontare i TC HLA-1-negativi con le cellule sfuse HLA-1-positive.
3. Differenziazione indotta lungo percorsi mesenchymi
   1. Utilizzare le sarcosfere formate durante i passaggi precedenti (passaggio 3.1.9). Trasferire le sarcosfere in una nuova piastra di 6 pozze. Coltura la sarcosfera con 2,5 mL di alfa-MEM integrato con 10% FBS per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie della piastra di coltura.
   2. Dopo un attaccamento per due giorni, cambia il mezzo di coltura da alfa-MEM integrato con il 10% di FBS alla miscela 1:1 di alfa-MEM integrata con il 10% Di FBS e il mezzo di crescita delle cellule staminali umane mesenchiche (hMSC).
   3. Dopo due giorni, passare al mezzo di crescita hMSC completo.
   4. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, aspirate il mezzo hMSC e aggiungete il mezzo di differenziazione. Per la differenziazione osteogenica, aggiungere il mezzo di differenziazione osteogenica (mezzo di crescita hMSC integrato con 10 nM di dexamethasone, 5 mM-glicerofosfato, 50 g di acido l-ascorbico e 10 mM di cloruro di litio). Per la differenziazione lipogenica, aggiungere il mezzo di differenziazione degli adipociti (mezzo di crescita hMSC integrato con 0,5 m dexamethasone, 0,5 isobutylmetilxanthine e 50 M indomethacin).
   5. Cambiare il supporto di differenziazione ogni tre giorni.
   6. Dopo tre o quattro settimane, interrompere la differenziazione e lavare le cellule con PBS. Quindi, aspirare il PBS e aggiungere 2 mL di 10% formalina alle cellule per la fissazione. Lasciate che le cellule si siedano per 45 min a temperatura ambiente. Lavarli con acqua deionizzata. Le celle sono ora pronte per la colorazione Alizarin Red S (passaggio 3.3.6.1) o la colorazione O Rossa dell'olio (passaggio 3.3.6.2).
      1. Per rilevare la differenziazione osteogenica, eseguire la colorazione Alizarin Red S. Aspirare acqua e aggiungere 2 mL di soluzione di lavoro Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) alle cellule, e lasciarli a sedersi per 5 min per la colorazione. Lavare le cellule con acqua deionizzata e osservare la reazione al microscopio.
      2. Per rilevare la differenziazione adipogenica, eseguire la colorazione Oil Red O.
         1. Crea una soluzione OO Rosso Olio. Preparare una soluzione di magazzino aggiungendo 300 mg di polvere O rosso olio a 100 mL di isopropanolo.
         2. Entro 2 h prima dell'uso, mescolare tre parti (30 mL) di olio Red O soluzione di stock con due parti (20 mL) di acqua deionizzata. Lasciare riposare la miscela per 10 min a temperatura ambiente.
         3. Filtrare la soluzione di lavoro utilizzando prima dell'uso.
         4. Rimuovere l'acqua dalle cellule preparate secondo il passaggio 3.3.6. Aggiungere 2 mL di 60% isopropanolo per coprire il monostrato cellulare e le cellule siedano per 2 min.
         5. Rimuovere l'isopropanol e aggiungere 2 mL di olio Red O soluzione di lavoro. Lasciare che le cellule si siedano per 5 min a temperatura ambiente.
         6. Sciacquare le cellule con acqua deionizzata e osservare la reazione al microscopio leggero.

Risultati

Un sarcoma umano PDX è stato generato e macchiato. L'eterogeneità intratutale è stata dimostrata dall'immunostochimica usando anticorpi HLA-1. Lo xenotrapianto consisteva in due distinte sottopopolazioni, vale a dire HLA-1 positivo e negativo (Figura 1A)¹². Il sarcoma PDX ha mostrato somiglianze istologiche con il tumore primario della genitoriale (Figura 1A). Sarcoma PDX TIC sono stati isolati dalla FACS. Utilizzando un metodo di ordinamento doppio, le cellule HLA-1-negativo sono state altamente arricchite dalla popolazione di cellule parentali (Figura 1B)¹².

I geni espressi nelle cellule staminali (ad esempio, Oct4, Nanog e Myc) sono stati trovati altamente espressi in cellule isolate HLA-1-negativo rispetto alla loro controparte HLA-1-positiva (Figura 1C). Sox-9, un gene dello sviluppo segnalato per svolgere un ruolo importante in altre cellule staminali tumorali, come nel carcinoma mammario, sono stati specificamente espressi in cellule HLA-1-negativo (Figura 1D).

Per convalidare la sottopopolazione isolata HLA-1-negativo, è stato eseguito un saggio di formazione di sarcosfera per esaminare la capacità di auto-rinnovamento delle cellule. Le cellule HLA-1-negativo sono state in grado di formare sfere con un input iniziale di appena 10 celle (Figura 1E)¹². Al fine di esaminare la capacità di formazione del tumore, è stato eseguito un saggio di formazione del tumore di diluizione seriale. Gli stessi numeri di cellule HLA-1-negativo e -positivo sono stati iniettati sottocutaneamente in ogni fianco dello stesso topo. Le cellule HLA-1-negativo hanno mostrato una capacità di formazione del tumore significativamente più elevata (Figura 1F)¹², mentre gli xenografi formati da sottopopolazioni HLA-1-negativi e -positivi erano tumori eterogenei cellulari (Figura 1H).

Abbiamo eseguito un'analisi genica dei TIC isolati HLA-1-negativi¹². I geni associati alla normale differenziazione cellulare mesenchimale sono stati elevati nei TIC¹². Così, abbiamo anche testato se HLA-1 TICs può essere indotto alla differenziazione terminale e provocare una diminuzione della capacità di formazione del tumore. I risultati hanno mostrato che le cellule HLA-1-negativo possono essere indotte a differenziarsi lungo vie lipogeniche e osteogeniche e mostrano forti macchie di O rosso olio e Alizarin Red S (Figura 1G). Al contrario, le cellule HLA-1-positive non si differenziano nelle stesse condizioni. Pertanto, questi risultati indicano una promettente strategia di terapia differenziata che può essere utilizzata per indirizzare i TIC di sarcoma.

Figura 1: Isolamento delle cellule HLA-1-negativo dai PDX del sarcoma eterogeneo intratutale. (A) Le cellule HLA-1-negative (frecce) sono state trovate in diversi sottotipi di sarcomi umani per immunohistochimica (IHC). (a e b) Sarcoma cellulare chiaro. (c e d) Liposarcoma pleomorfico. (e e f) Leiomyosarcoma. (g e h) Tumore maligno di intasia del nervo periferico. (i e j) Liposarcoma, non specificato diversamente. (k e l) Liposarcoma didifferenziato. Barra di scala (B) I Sarcoma PDX erano istologicamente simili al tumore dei genitori (ematossialina e eosina [stain H&E]) e mostravano l'eterogeneità cellulare nell'espressione HLA-1 di IHC. Qui sono mostrate immagini rappresentative di sarcoma PDX, tra cui un sarcoma a cellule chiare (CCS), un condrosarcoma disdifferenziato (DCS), e un liposarcoma disdifferenziato (DDL). Barra di scala - 100 m. (C) La sottopopolazione di cellule HLA-1-negativo è stata isolata dalla citometria di flusso con un metodo a doppio ordinamento. Dall'alto verso il basso: primo ordinamento, secondo ordinamento e controllo di purezza. Le cellule isolate HLA-1-negativo e HLA-1-positive sono state sottoposte a una successiva analisi funzionale, incluso un test di formazione del tumore. I risultati di questa cifra provengono da una precedente pubblicazione¹². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione dei TIC HLA-1-negativi mediante saggi funzionali. (A) Un saggio di formazione di sfere ha mostrato che solo 10 cellule HLA-1-negativo erano in grado di formare sfere di sarcoma. Sinistra: immagini rappresentative delle sfere di sarcoma. A destra: frequenza di formazione della sfera; media : barra della scala SD . Qui mostrate sono immagini rappresentative del tumore formato da hLA-1-negativo e -positivo cellule da DDL. Un migliaio di cellule di cellule DDL HLA-1-negativo e HLA-1-positivo sono state iniettate in fianchi separati dello stesso topo. (C) I livelli di mRNA dei geni delle cellule staminali Oct4, Nanoge Myc sono stati espressi a livelli più elevati nelle cellule HLA-1-negative rispetto alle cellule HLA-1-positive. I dati rappresentano la media : SD (n - 5). (D) Una forte colorazione positiva di OIl Red O e Alizarin Red S mostra una differenziazione terminale lungo percorsi lipogenici e osteogenici che sono indotti dal sarcoma TIC. (E) Immunostaining HLA-1 delle PDX formate da sottopopolazioni HLA-1 positive (sinistra) e -negative (destra). Barra della scala: 100 m. I risultati di questa cifra provengono da una precedente pubblicazione¹². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici che limitano il successo di questo protocollo per isolare e caratterizzare le cellule che invitano a tumore dal sarcoma umano PDX. Abbiamo osservato che la formazione di PDX dipende fortemente dai sottotipi di sarcoma. Sarcomi clinici aggressivi con un fenotipo istologicamente indifferenziato (ad es., sarcoma pleomorfica indifferenziata [tasso di successo 100%, n - 2], liposarcomas disdifferenziati [tasso di successo 100%, n - 2] e sarcomi sinoviali [ tasso di successo 100%, n - 3]) hanno un alto tasso di successo della formazione PDX. Nel frattempo, i sarcomi con fenotipi differenziati (ad es. liposarcomi ben differenziati [tasso di successo 0%, n - 3]) mostrano tassi di formazione PDX più bassi. È possibile che le cellule che provocano tumori siano presenti in sottotipi più maligni a una percentuale più alta rispetto a sottotipi meno maligni e differenziati. Inoltre, si consiglia di completare la procedura di isolamento cellulare di avviamento del tumore entro un giorno senza alcun arresto per ridurre al minimo qualsiasi perdita di vitalità cellulare.

Abbiamo identificato che le cellule HLA-1-negativo esistono ampiamente nei sarcomi umani. Ma la percentuale di cellule HLA-1-negativo può variare tra i campioni di diversi pazienti. Con questo metodo, abbiamo isolato con successo le cellule che hanno avuto come intuimento del tumore da campioni che hanno cellule HLA-1-negative che vanno da meno dello 0,5% a più del 30%¹². È importante caratterizzare le cellule HLA-1-negative funzionalmente dalla formazione della sfera e dai saggi di formazione del tumore per confermare l'identità cellulare che ha invitato il tumore delle cellule isolate HLA-1-negativo.

Tuttavia, il protocollo qui presentato presenta anche delle limitazioni. I dati precedenti hanno mostrato che l'espressione di HLA-1 è regolata epigeneticamente, il che è coerente con l'osservazione dell'eterogeneità cellulare dell'espressione HLA-1 all'interno dello stesso tumore¹². Sono state rilevate mutazioni genomiche dell'HLA-1 nei sarcomi e in altri tipi di cancro. Le mutazioni nei geni HLA-1 possono portare alla completa perdita di HLA-1 sulla superficie cellulare nell'intero tumore o all'espressione di HLA-1 mutato non funzionante. In entrambi i casi, la negatività HLA-1 non può essere utilizzata per identificare i TIC all'interno del tumore.

Utilizzando HLA-1 come marcatore negativo, abbiamo isolato con successo i TIC da una varietà di sottotipi di sarcoma umano e convalidato i nostri risultati mediante analisi funzionale. Così, siamo stati in grado di eseguire studi molecolari tra cui l'analisi dell'espressione genica sui CPC, al fine di sviluppare un trattamento specifico mirato a questi CC.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm cell culture filter	ThermoFisher	450-0020
100 mm Petri dish	Falcon	353003
15 mL conical tube	Falcon	352196
35 μm cell strainer	Falcon	352340
50 mL polystyrene tube	Falcon	352070
96-well ultra-low attachment cell culture plate	Corning	7007
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
B-27	Gibco	08-0085SA
bFGF	Invitrogen	PHG0021
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
EGF	Invitrogen	PHG0311
HLA-1-PE antibody	Abcam	ab43545
hMSC growth medium	ATCC	PCS-500-030
indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
isobutylmethylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
Isotype Control Antibody	Abcam	ab103534
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
lithium chloride	Sigma-Aldrich	62476
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354230
MEM Alpha	Gibco	12571-063
N2	Gibco	17502-048
NSG mice	The Jackson Lab	005557
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
PBS	Corning	21-040-CM
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Syringe with needle	BD	309626
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422