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Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar que el cultivo del pigmento retiniano epitelial (RPE) células en membrana de Bruch humano enfermo o envejecido. Este método es adecuado para el estudio de comportamiento de células RPE en matriz extracelular comprometida.

Resumen

Aparte de vitaminas y antioxidantes recomendados por el estudio de la enfermedad de ojo asociada, no hay ningún tratamiento eficaz para la "seca" o atrófica relacionada con la edad degeneración macular (AMD) que representa el 90% de los casos. Las terapias son necesarias para reducir o retardar el desarrollo de atrofia geográfica (GA), y entender la patología de la membrana de Bruch es parte de este proceso. Alteraciones en la membrana de Bruch humano preceden la progresión de la DMAE, contribuyendo al daño del pigmento retiniano epitelial (RPE) las células. Debido a la falta de suficientes modelos animales para el estudio de AMD, modelos ex vivo de la membrana de Bruch humana de servir como una herramienta útil para estudiar el comportamiento de las células RPE de inmortalizó y líneas de células primarias, así como líneas RPE derivan de tallo pluripotentes inducidas células (iPSCs). Aquí, presentamos un método detallado que permite determinar los efectos del comportamiento de células RPE sembradas en explantes de membrana de Bruch humanos cosechados de donantes humanos, incluyendo fijación, apoptosis y proliferación, capacidad fagocitan externo de fotorreceptor segmentos, establecimiento de la polaridad y expresión génica. Este ensayo proporciona un modelo ex vivo de la membrana de Bruch de evaluar las características funcionales de las células RPE cuando sembradas en matriz extracelular edad/comprometido.

Introducción

Relacionadas con la edad cambios estructurales en la membrana de Bruch humana, que es causada por muchos factores, incluyendo nitrosativo y oxidativo, ejerce múltiples efectos deletéreos sobre la función del pigmento retiniano epitelial (RPE) de las células y contribuye a la patología de la degeneración macular senil (DMS)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Cuando se considera la terapia de reemplazo celular para avanzadas DMAE atrófica o atrofia geográfica, tratamiento requerirán el trasplante de células en una cama de la atrofia de células RPE. Cambios relacionados con la edad dentro de la membrana de Bruch humano pueden afectar negativamente el éxito de trasplantado injertos de células RPE, dado el daño a la matriz extracelular6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. humanos investigando biología de membrana de Bruch y cómo los cambios estructurales en la matriz de contribuyan a la progresión de AMD es vital para entender la patología de la enfermedad. Así, hay una necesidad crítica de los investigadores en el campo del ojo relacionada con la edad para desarrollar protocolos que describen la cosecha ex vivo de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido.

Históricamente, ha sido difícil a modelo edad-trastornos relacionados con la atrofia geográfica como membrana de un anciano humano Bruch en animales23. Esta dificultad surge de múltiples factores incluyendo la longevidad de los seres humanos en comparación con roedores y otras especies utilizadas para el modelado de la enfermedad, así como la falta de una mácula en la mayoría vertebrados24. La ventaja del método descrito aquí es que las células se pueden probar directamente en la membrana de Bruch extraída de post mortem ojos de las personas mayores o enfermas. El objetivo general de este artículo es proporcionar una metodología detallada para un modelo ex vivo de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido, incluyendo el aislamiento de humano Bruch membrana explantes de donantes humanos y el sembrador de RPE células para experimentos posteriores. Este modelo puede servir como un modelo relevante para investigar la contribución de daño de matriz extracelular en RPE células función y patología20,25,26,27,28.

Protocolo

El siguiente protocolo se realiza en adhesión a los principios de la declaración de Helsinki y las pautas de Yale Universidad Comité de ética de investigación humana.

1. abastecimiento de donante humano de ojos

  1. Obtener globos de donante humano del nacional la enfermedad investigación intercambio (NDRI, Philadelphia, PA). Según el proyecto, preparar no menos de tres pares de ojos de donantes para cada grupo experimental.
  2. Enuclear ojos donantes dentro de las 10 h y dentro de 48 h postmortem. Luego el transporte los ojos al laboratorio modificado Eagle medio (DMEM) medio estéril de Dulbecco de cultivo en el hielo. Previamente reportados estudios han demostrado que ojos donantes cosechan y transportaron en esta manera de preservar las características biológicas y las actividades de la membrana de25,26,29 de Bruch.

2. cosecha de la membrana de Bruch humano de explantes

  1. Lugar cada ojo en una gasa de 1.5 x 1.5 pulgadas empapado con medios DMEM de dióxido de carbono-independiente en una placa de cultivo de 100 mm y uso tijeras de hoja fina para hacer una incisión a través de la esclera 3 mm posterior al limbus y circunferencial que se extiende en cualquier dirección.
  2. Hacer una incisión circunferencial de espesor total (penetrar a vítreo) 1 mm posterior a la ora serrata. Retire y deseche el segmento anterior (córnea, lente y diafragma), el vítreo y la retina.
  3. Utilice tijeras quirúrgicas finas para hacer cuatro incisiones radiales entre la esclerótica y la coroides y luego pelar la esclerótica de la periferia del nervio óptico, mientras que teniendo cuidado para evitar rasgar la membrana de la coroides/Bruch complejo.
  4. A continuación, haga una incisión circunferencial a través del espacio Supracoroideo a lo largo de la ora serrata y pelar complejo de coroides membrana de Bruch de la RPE posterior de la esclera.
  5. Eliminar las células RPE nativas bañándose el explante con hidróxido de amonio de 0.02 M en tamponada con fosfato solución salina de Dulbecco (DPBS) en un poliestireno de 60 x 15 mm placa de Petri por 20 min a temperatura ambiente, seguido de lavado tres veces en DPBS (figura 1).
  6. Flotador de explante complejo de membrana de Bruch en medios libres de dióxido de carbono sobre una membrana de 65 μm de espesor politetrafluoetileno artificia, hidrofóbico con 0,2 μm los poros, con la capa de lámina basal de cada explante hacia la membrana.
  7. Colocar una membrana de politetrafluoroetileno con explante de la membrana de Bruch en un soporte de vidrio sinterizado en un sistema de soporte de filtro de vacío de vidrio microanálisis.
  8. Aplane los bordes rizados desde la coroides con fórceps fino recubierto con Teflon, teniendo cuidado de no para tocar el lado de basal laminina la membrana de Bruch.
  9. Calentar 15 mL de agarosa (4% en DPBS) y luego enfriarlo a 37 ° C. Entonces verter 15 mL de gel liquidized en complejo de coroides membrana de Bruch de la coroides a lado mientras se aplica una succión suave para garantizar que el explante se mantendrá plana. Mantener el tejido en 4 ° C durante 2-3 min solidificar la agarosa y luego pelar a la membrana de politetrafluoretileno.
  10. Coloque el explante de la membrana de Bruch (1.5 pulgadas de diámetro, en gel de agarosa solidificada) en una placa de cultivo de células de poliestireno 60 x 15 mm (con la membrana de Bruch hacia arriba) que ha sido alineada con agarosa líquida caliente en la parte inferior de la placa para fijar la membrana de Bruch explante en el fondo del pozo con la capa basal laminina de explante hacia arriba.
  11. La agarosa se solidifique dentro de 2-3 minutos a temperatura ambiente para estabilizar explantes de la membrana de Bruch en la placa de cultivo. Cubierta de la membrana de Bruch de explantes en la cultura plato con DPBS y guardar la placa a 4 ° C para su uso futuro. Figura 2A muestra que la membrana de Bruch aislado de explantes en una placa de cultivo de 60 x 15 mm.
  12. Si el sistema de cultivo deseado está en una placa de 96 pocillos, coloque el explante de la membrana de Bruch (1.5 pulgadas de diámetro, con gel de agarosa solidificada) en una hoja de teflón plana con el lado de laminina arriba.
  13. Utilizando un trépano, corte cinco o seis, 6 mm-circular botones de membrana de Bruch complejo explantación y coloque cada uno en agarosa al 4% a 37 ° C en un poliestireno no trata de una placa de 96 pocillos. La agarosa se solidifique dentro de 2-3 minutos a temperatura ambiente para fijar explantes de la membrana de Bruch (botones) en la parte inferior de cada pocillo.
    Nota: La figura 2B muestra botones de membrana de Bruch allograft en una placa de 96 pocillos. Por lo general, 9-11 botones o explantes se pueden cosechar desde cada ojo.

3. cultivo de células de pigmento retiniano epitelial (RPE) en la membrana de Bruch humano explantes

  1. Tras la recepción de los ojos del donante, limpiar el tejido extraocular con DPBS. Haga una incisión circunferencial 5 mm por debajo de la esclerótica iris toque punto (pars plana) en el espacio subretinal. Descartar el segmento anterior, el humor vítreo y la retina.
  2. Lave el ocular, que contiene la membrana de Bruch y la hoja de RPE, con DPBS frío. Disociar las células RPE con 5 mL de tripsina 0.25% durante no más de 10 minutos para cada muestra de ojo. Calmar la reacción de la tripsina con 25 mL de medio completo DMEM con 15% suero bovino fetal (FBS) calentado a 37 ° C en un tubo de 50 mL.
  3. Centrifugar las células a 200 x g durante 10 minutos a 24 ° C y resuspender el precipitado en 5 mL de medio completo DMEM (con 15% FBS).
  4. Contar las células y 15.000 células RPE viables sobre la lámina basal de membrana explantes de cada varios años Bruch (botones) en una placa de 96 pocillos en 200 μL de medios libre de suero mínimos esenciales (MEM) que contengan antibióticos de la semilla (100 UI/mL de penicilina G, 100 mg / estreptomicina de mL gentamicina 5 mg/mL y 2.5 mg/mL de anfotericina B). Asumiendo un diámetro celular de 20 μm, chapado en esta densidad permitirá a las células RPE cubrir aproximadamente el 15% de la superficie de galjanoplastia.
  5. Placa las células hasta el botón, por el que la densidad celular se puede entonces aumentar paso a paso para arriba a confluencia 100% dependiendo del efecto de cada parámetro en el comportamiento de la célula.
  6. Permitir a las células a explante durante 24 h en una atmósfera humidificada de 95% air/5% CO2 a 37 ° C. Suavemente cambiar medio DMEM completo caliente.

Resultados

Cuando este protocolo se realiza correctamente, uno puede determinar los efectos de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido en función de las células RPE por el establecimiento de la polaridad y la barrera retiniana exterior sangre, polarizado la secreción de factores de crecimiento y citoquinas, y la fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor rod.

Hemos generado datos que muestran un fenotipo de la enfermedad en membrana de Bruch humano envejecido. Por ejemplo, cultivo de células RPE en edad membrana explantes disminuye RPE células el reacoplamiento de humana Bruch (figura 3). Las células RPE cultivadas sobre membrana de Bruch humano edad disminuye la capacidad de estas células fagocitan segmentos de barras externo (ROS), una función crítica de la RPE (figura 4). Por otra parte, las células apoptotic pueden identificar y comparadas en estos explantes de botón mediante una terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick etiquetado final (TUNEL) Mancha como se describe en el anterior trabajo26. Los efectos de un anciano o enfermo humano de membrana de Bruch en el perfil de expresión de gene de celular RPE pueden ser determinados mediante la tecnología de microarrays. Hemos demostrado que genes de células RPE se alteración cuando se cultivan en la membrana de Bruch humana de individuos de edad avanzada en comparación con explantes de jóvenes individuos (figura 5)27. Para el análisis estadístico, se utilizan explantes de donantes humanos de al menos 3-5 por grupo.

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Figura 1. Representación esquemática del aislamiento de la membrana de Bruch humano de ojos donantes. Las membranas humanas de Bruch se cosechan mediante la eliminación de la esclera, segmento anterior, retina, vítreo, y células epiteliales (RPE) del pigmento retiniano nativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Aislado de la membrana de Bruch humano (BM) en un plato de cultura. (A) esquema de los explantes de la membrana de Bruch humana (cada 1,5 pulgadas de diámetro, con gel de agarosa solidificada) colocado en un 60 × 15 mm poliestireno celular placa de cultivo (BM boca arriba) con agarosa líquida caliente en el fondo del plato. (B) explante de membrana de un humano Bruch que ha sido allograft en unos botones circulares de 6 mm (explantes), cada ow que entonces colocaron en agarosa al 4% a 37 ° C en un poliestireno no trata de una placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Tarifa de reconexión en la membrana de Bruch humano joven y mayores (BM) de la célula del pigmento retiniano epitelial (RPE). Las células RPE primarias fueron sembradas en la membrana de Bruch de explantes de jóvenes humanos (< 50 años de edad, n = 3) o más (> 70 años de edad, n = 5) ojos de donantes durante tres semanas. Tipo de accesorio de celular fue medida por análisis de viabilidad de la célula MTT. Membranas de Bruch humano mayores redujeron la tasa de accesorio de celular RPE en un 24% (jóvenes BM 100 +-8.54 S.E. vs mayores 76.65 BM +-1,44 S.E.). p < 0.05, S.E. = error estándar.

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Figura 4. La fagocitosis de epiteliales de pigmento retiniano (RPE) de la célula se ve afectada por la edad de la membrana de Bruch humano (BM). Las células RPE primarias cultivadas mayores humanos explantes de la membrana de Bruch tenían una capacidad reducida a fagocitan segmentos de barras externo (ROS) (873 jóvenes de BM +-9.3 S.E., n = 5 vs mayores BM 608 +-25.4 S.E., n = 5). p < 0.01, S.E. = error estándar.

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Figura 5. Número de retiniano del pigmento epitelial (RPE) celular los genes expresados en cada muestra que se cultiva en los jóvenes o explantes de la membrana de Bruch humano mayores. Había más dispersión en el número de genes expresados en las células RPE primarias sembradas a mayor frente a la membrana de Bruch humano más joven (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, respectivamente); cinco explantes fueron probados para cada grupo de edad. Presentado con el permiso completo de todos los autores de Cai, H et al. 27. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Membrana de Bruch humano envejecido (matriz extracelular) contribuye a la progresión de la enfermedad de AMD y por lo tanto es necesario entender cómo esta matriz alterada contribuye a la disfunción de las células RPE. Debido a la falta de suficientes modelos animales para estudiar los cambios relacionados con la edad en AMD, ex vivo sistemas modelo que imitan los efectos de la enfermedad pueden servir como una herramienta valiosa para entender la patofisiología. La metodología descrita en este manuscrito puede utilizarse para aislar sistemáticamente humano explantes de la membrana de Bruch y cultura RPE células, incluyendo líneas de células RPE primarias, inmortalizadas o derivados de células madre.

Como se mencionó anteriormente, explantes de la membrana de Bruch humana provienen de la NDRI. Se establece un protocolo con NDRI que especifica los criterios para que los ojos del donante aceptable. Por ejemplo, los donantes no deben tener ninguna enfermedades de la retina conocidas, globos de ojos se recuperan dentro de las 10 h después de la muerte y globos llegan en el laboratorio dentro de las 48 h después de la muerte (vía entrega de paquete durante la noche en el hielo). Especificar el rango de edad apropiado y el número de ojos es necesario para el análisis estadístico del estudio, por ejemplo., cinco pares de globos de donantes entre las edades de 20 a 49 años y cinco pares de globo de donantes entre las edades de 50-89 años.

La disponibilidad de los globos del ojo varía, generalmente con un promedio de diez pares de globos disponibles cada mes. El paquete de ojos llega con información básica, anónima donante: edad, raza, tiempo de la muerte, causa de la muerte y breves antecedentes médicos (listado de enfermedades o comorbilidades).

Lo más importante, cosecha de explantes de la membrana de Bruch humana requiere la remoción del segmento anterior del ojo y del vítreo, lo que permite el aislamiento del complejo de coroides membrana de Bruch de la RPE. Una vez aislada la membrana de Bruch, células RPE pueden ser sembradas en los explantes acelulares en concentraciones variables y cultivadas para experimentos posteriores. La preparación y el manejo del procedimiento como se describe en este documento es crítica, prestando atención a la orientación de la membrana de Bruch aislado para asegurarse de que la superficie laminal es hacia arriba mientras no toquen la superficie mecánicamente para evitar daños en el estructura superficial de la matriz extracelular.

También cabe señalar que al utilizar sistemas de explante de la membrana de Bruch, hay algunas variables que podrían afectar los resultados de experimentos posteriores como fondo genómico de donantes individuales, edad de la membrana de Bruch o tiempo post mortem de la Bruch membrana y la localización de la membrana de Bruch, es decir., central o periférica parte de explantes de la membrana de Bruch. Como con cualquier otro estudio de tejidos humanos, uno debe reclutar el número de muestra del ojo donante apropiado para tener la potencia estadística necesaria y coincide con edad de ojo donante si es apropiado. El establecimiento de criterios para la aceptación de ojos a partir de bancos de ojos es un parámetro crítico. Sólo se aceptan ojos que son anucleadas post mortem menos de 10 h y preparación de la membrana de Bruch se puede cosechar dentro de las 24-48 h después de la muerte. El sitio del nervio óptico puede ser utilizado como un marcador para la orientación y utilizar los mismos lugares de experimental y control de grupos de estudio. Al tomar estas medidas, uno puede minimizar la variabilidad experimental.

En Resumen, comprensión de la RPE-Bruch complejo membrana coroides y cómo es afectado por la edad y la enfermedad es fundamental para entender su contribución a la fisiopatología de la DMAE. Modelo de los sistemas que emplean técnicas ex vivo es una herramienta valiosa para investigar estos efectos utilizando tejido humano. Adjunto, describimos a una metodología que emplea explantes de donante humano como modelo de membrana de Bruch de relevantes ex vivo . Esta técnica permite utilizar membrana de Bruch humano enfermo o envejecido como herramienta de investigación para investigar cómo los cambios estructurales dentro de la matriz puede afectar superponer RPE comportamiento celular como accesorio, la proliferación y la gene expresión25 , 27. desarrollo exitoso de ex vivo modelo sistemas similares será mejorar nuestra comprensión de la DMAE y facilitar el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.

Divulgaciones

Ninguno de los autores tienen ninguna divulgación comercial a declarar.

Agradecimientos

Esta investigación es apoyada por la investigación para prevenir la ceguera, Nueva York, www.rpbusa.org y el mayor centro de Nueva York para retina degenerativa enfermedad Fundación lucha contra la ceguera, www.blindness.org. Los autores desean agradecer a Luanna Bartholomew, pH.d., por su revisión crítica de este manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Human donor globesNational Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995-065
Carbon-dioxide independent mediaThermo Fisher Scientific18045-088
60-mm polystyrene petri dishCorning Inc.351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBSThermo Fisher Scientific14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm poresMerck MilliporeJGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system Thermo Fisher Scientific09-753-102
AgaroseSigma-AldrichA2576-5G
35 × 10mm culture dishVWR International25373-041
TrephineAccutomeAM0570 60
96 well plateCorning Inc.3595
Minimum essential media (MEM) Thermo Fisher Scientific11095-080 
Penicillin GSigma-AldrichP3032-1MU
StreptomycinSigma-AldrichS6501
GentamicinSigma-AldrichG1914
Amphotericin BSigma-Aldrich1397-89-3
Ammonium hydroxide solutionSigma-Aldrich1336-21-6
 

Referencias

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