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Resumo

O objetivo do presente protocolo é demonstrar que o cultivo de pigmento retinal (RPE) as células epiteliais na membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch. Este método é adequado para estudar o comportamento de células RPE em uma matriz extracelular comprometido.

Resumo

Além de vitaminas e antioxidantes recomendados no estudo de doenças de olho Age-Related, não há nenhuma terapia eficaz para "seca", ou atrófica relacionadas com a idade degeneração macular (DMRI) que representa 90% dos casos. Terapias são necessários para diminuir ou retardar o desenvolvimento de atrofia geográfica (GA), e compreender a patologia de membrana de Bruch é parte deste processo. Alterações na membrana de Bruch humano precedem a progressão da AMD, contribuindo para o dano do pigmento da retina epitelial (RPE) células. Dada a falta de modelos animais suficientes para estudar AMD, modelos ex vivo da membrana de Bruch humano envelhecido servem como uma ferramenta útil para estudar o comportamento de células RPE de imortalizado e linhas de célula primária, bem como as linhas RPE derivado de tronco pluripotentes induzidas células (iPSCs). Aqui, apresentamos um método detalhado que permite determinar os efeitos do comportamento de células RPE semeado em explantes de membrana de Bruch humano colhidos de doadores humanos, incluindo o anexo, apoptose e proliferação, capacidade de phagocytize fotorreceptoras exterior segmentos, estabelecimento de polaridade e expressão gênica. Este ensaio fornece um modelo ex vivo da membrana de Bruch envelhecido para avaliar as características funcionais das células RPE quando semeado na matriz extracelular envelhecido/comprometida.

Introdução

Mudanças estruturais relacionadas com a idade, a membrana de Bruch humano, que é causado por muitos fatores, incluindo nitrosative e estresse oxidativo, exerce vários efeitos deletérios sobre a função do pigmento retinal (RPE) epitelial células e contribui para o patologia de degeneration macular age-related (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Ao considerar a terapia de reposição celular para avançados AMD atrófica ou atrofia geográfica, o tratamento provavelmente exigirá o transplante de células em uma cama de atrofia de células RPE. Alterações relacionadas com a idade, dentro da membrana de Bruch humano podem afetar adversamente o sucesso dos enxertos de células RPE transplantados, dado o dano para a matriz extracelular6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. investigação humano biologia membrana de Bruch e como as mudanças estruturais dentro da matriz de contribuir para a progressão de AMD é vital para a compreensão de patologia da doença. Assim, há uma necessidade crítica para os investigadores no campo olhos relacionada à idade para desenvolver protocolos que descrevem a colheita ex vivo da membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch.

Historicamente, tem sido difícil para doenças relacionadas à idade, modelo como atrofia geográfica e membrana de Bruch humano um envelhecido em animais23. Essa dificuldade decorre de múltiplos fatores, incluindo a longevidade dos seres humanos em comparação com roedores e outras espécies frequentemente usados para doença de modelagem, bem como a falta de uma mácula na maioria dos vertebrados,24. A vantagem do método descrito neste documento é que as células podem ser testadas diretamente na membrana de Bruch, extraída do post mortem olhos de indivíduos de idade e/ou doentes. O objetivo geral deste artigo é fornecer uma metodologia detalhada para um modelo ex vivo da membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch, incluindo o isolamento de Bruch humano membrana explants de doadores humanos e a semeadura de RPE células para experimentos a jusante. Este modelo pode servir como um modelo relevante para investigar a contribuição dos danos da matriz extracelular na RPE celular função e patologia20,25,26,,27,28.

Protocolo

O seguinte protocolo é realizado em conformidade com os princípios da declaração de Helsinque e as orientações a Comissão de ética de pesquisa humana Yale University.

1. abastecimento de doador humano de olhos

  1. Obter globos de doador humano desde a pesquisa de doença a nacional Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Dependendo do projeto, prepare nada menos que três pares de olhos de doadores para cada grupo experimental.
  2. Enucleate olhos de doador dentro 10 h e nave dentro de 48 h post-mortem. Em seguida transporte os olhos para o laboratório modificado águia médio (DMEM) meio de estéril Dulbecco de cultura no gelo. Anteriormente relatados estudos têm demonstrado que olhos doador colhidos e transportaram nesta moda de preservar os recursos biológicos e atividades de2926,25,do membrana de Bruch.

2. a colheita da membrana de Bruch humano Explants

  1. Lugar de cada olho em uma gaze de 1.5 x 1.5 polegadas embebido em mídia DMEM independente de dióxido de carbono em um prato de cultura de 100 mm e uso tesoura de lâmina fina para fazer uma incisão através da esclera 3 mm posterior ao limbo e circunferencialmente estendendo-se em qualquer direção.
  2. Fazer uma incisão circunferencial de espessura total (penetrante para vítreo) 1 mm posterior a ora serrata. Remova e descarte o segmento anterior (íris, lente e córnea), retina e vítreo.
  3. Use tesoura cirúrgica fina para fazer quatro incisões radiais entre a esclera e coroide e em seguida, descasque a esclera longe da periferia para o nervo óptico, enquanto tendo o cuidado de evitar rasgar a membrana de Bruch coroide/complexo.
  4. Em seguida, faça uma incisão circunferencial através do espaço de suprachoroidal ao longo da ora serrata e descascar complexo de coroide-membrana de Bruch-RPE posteriormente da esclera.
  5. Remova as células RPE nativas banhando o explante com 0,02 M de hidróxido de amónio em fosfato salino de Dulbecco (DPBS) em um poliestireno 60 x 15 mm placa de Petri por 20 min em temperatura ambiente, seguida de lavá-lo três vezes em DPBS (Figura 1).
  6. Flutue explante complexo de Bruch membrana na mídia livre de dióxido de carbono sobre uma plastificadae membrana hidrofóbica 65 µm de espessura de politetrafluoroetileno com poros de 0,2 µm, com a camada de lâmina basal de cada explante virada para a membrana.
  7. Coloca uma membrana de politetrafluoroetileno com explante de membrana de Bruch num suporte de vidro fritado em um sistema de vácuo do porta-filtro de microanálise de vidro.
  8. Achate as bordas onduladas do lado da coroide com pinça fina revestida com Teflon, tomando cuidado para não tocar no lado de laminina basal da membrana de Bruch.
  9. 15 mL de agarose (4% em DPBS) de calor e depois resfriá-lo a 37 ° C. Em seguida, despeje 15 mL de gel liquefeito para complexo de coroide-membrana de Bruch do lado da coroide-aplicando sucção suave para garantir que o explante permanecerá plana. Mantenha o tecido a 4 ° C, durante 2-3 min solidificar o agarose e depois descasque fora a membrana de politetrafluoretileno.
  10. Coloque o explante de membrana de Bruch (1,5 polegadas de diâmetro, dentro do gel do agarose solidificado) um 60 x 15 mm poliestireno celular placa de cultura (com membrana de Bruch voltada para cima) que tem sido repleta de agarose líquido quente no fundo do prato para corrigir a membrana de Bruch explantes no fundo do poço com a camada de laminina basal de explant virada para cima.
  11. A agarose solidify dentro de 2-3 min à temperatura ambiente para estabilizar explantes de membrana de Bruch a placa de cultura. Cobertura de membrana de Bruch explants na cultura do prato com DPBS e armazenar o prato em 4 ° C para uso futuro. Figura 2A demonstra a que membrana de Bruch isolado o explants em um prato de cultura 60 x 15 mm.
  12. Se o sistema de cultura desejada em uma placa de 96 poços, lugar explante de membrana de Bruch (1,5 polegadas de diâmetro, com gel de agarose solidificado) sobre uma folha de Teflon plana com o lado da laminina.
  13. Usando um trépano, cortar cinco ou seis, 6 mm-circular botões de membrana de Bruch complexa explantes e colocar cada um no agarose de 4% a 37 ° C em um poliestireno não tratados bem de uma placa de 96 poços. A agarose solidify dentro de 2-3 min à temperatura ambiente para corrigir explantes de membrana de Bruch (botões) na parte inferior de cada poço.
    Nota: Figura 2B demonstra botões de membrana de Bruch trephined em uma placa de 96 poços. Normalmente, explantes ou botões de 9-11 podem ser colhidas de cada olho.

3. cultivo de células epiteliais (RPE) de pigmento da retina na membrana de Bruch humano Explants

  1. Após a recepção dos olhos doador, limpe o tecido extra-oculares com DPBS. Faça uma incisão circunferencial 5 mm abaixo da íris-esclera toque ponto (pars plana) para o espaço subretinal. Descarte o segmento anterior, humor vítreo e retina.
  2. Lave a ocular, que contém a folha RPE, com frio DPBS e membrana de Bruch. Dissocia as células RPE com 5 mL de tripsina 0,25% para não mais de 10 min para cada amostra de olho. Saciar a reação de tripsina com 25 mL de meio completo DMEM com 15% fetal de soro bovino (FBS) aquecido a 37 ° C, em um tubo de 50 mL.
  3. Centrifugar as células a 200 × g por 10 min a 24 ° C e resuspenda o pellet em 5 mL de meio completo DMEM (com 15% FBS).
  4. Contar as células e 15.000 células viáveis de RPE sobre a lâmina basal de membrana explantes cada vários envelhecido de Bruch (botões) em uma placa de 96 poços em 200 µ l de soro livre mínima essencial mídia (MEM) contendo antibióticos de sementes (100 UI/mL penicilina G, 100 mg / mL estreptomicina, gentamicina 5 mg/mL e 2,5 mg/mL de anfotericina B). Assumir um diâmetro de célula de 20 µm, chapeando a esta densidade permitirá que as células RPE cobrir aproximadamente 15% da área do chapeamento.
  5. Placa das células para o botão, no qual a densidade celular pode então ser aumentada stepwise a confluência de 100%, dependendo do efeito de cada parâmetro sobre o comportamento da célula.
  6. Permitir que as células anexar o explante por 24 h em um ambiente umidificado de 95% air/5% CO2 a 37 ° C. Mude suavemente meio com DMEM completa quente.

Resultados

Quando este protocolo é executado corretamente, um pode determinar os efeitos da membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch na função de células RPE pelo estabelecimento de polaridade e a barreira da retina exterior sangue, polarizada secreção de fatores de crescimento e citocinas, e fagocitose de segmentos exteriores de haste de fotorreceptoras.

Nós têm gerado dados que demonstram um fenótipo de doença na membrana de Bruch humano envelhecido. Por exemplo, cultivo de células RPE na idade recolocação (Figura 3) da célula do RPE diminui explantes de membrana de Bruch humano. As células RPE cultivadas na membrana de Bruch humano envelhecido diminui a capacidade destas células de phagocytize segmentos exteriores de haste (ROS), uma função crítica de RPE (Figura 4). Além disso, pilhas apoptotic podem ser identificadas e comparadas esses explantes de botão usando uma terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick extremidade-etiquetando (TUNEL) mancha como descrito em anterior trabalho26. Os efeitos da membrana de um envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch no perfil de expressão de gene de células RPE podem ser determinados usando tecnologia microarray. Temos demonstrado que a expressão de gene de células RPE é alterada quando cultivadas na membrana de Bruch humano de indivíduos mais velhos em comparação com explantes de jovens indivíduos (Figura 5)27. Para análise estatística, explantes de pelo menos 3-5 doadores humanos são usados por grupo.

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Figura 1. Representação esquemática da isolação da membrana de Bruch humano de olhos doador. Membrana de Bruch humano é colhida, removendo a esclera, segmento anterior, retina, vítreo, e nativo retinal pigment pilhas epithelial (RPE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Isolado da membrana de Bruch humano (BM) em um prato de cultura. (A) esquema de explantes de membrana de Bruch humano (cada 1,5 polegadas de diâmetro, com gel de agarose solidificado) colocado em um 60 × 15 mm poliestireno celular cultura prato (face para cima BM) repleto de agarose líquido quente no fundo do prato. Explante de membrana de um humano de Bruch (B) que tem sido trephined em alguns botões circular de 6 mm (explantes), cada ai que foi então colocado em agarose de 4% a 37 ° C em um poliestireno não tratados bem de uma placa de 96 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Taxa de religação na membrana jovens e mais velhos humana de Bruch (BM) de células da retina pigmento epitelial (RPE). Células RPE primárias foram semeadas em humanos, membrana de Bruch explants de young (< 50 anos de idade, n = 3) ou mais velhos (> 70 anos, n = 5) olhos doador por três semanas. Taxa de ligação de celular foi medida pelo ensaio de viabilidade celular MTT. Membrana de Bruch humano mais velho reduziu a taxa de fixação de célula RPE em 24% (jovem BM 100 + /-8,54 S.E. vs mais velhos 76.65 BM + 1,44 S.E.). p < 0.05, S.E. = erro padrão.

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Figura 4. Pigmento da retina epitelial (RPE) célula a fagocitose é afetada pela idade de membrana de Bruch humano o (BM). As células RPE primárias cultivadas em humanos mais velhos, membrana de Bruch explants tinham uma capacidade reduzida de phagocytize segmentos exteriores de haste (ROS) (jovem BM 873 + 9.3 S.E., n = 5 vs mais velhos 608 BM + /-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = erro padrão.

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Figura 5. Número de retinal pigment genes de célula epiteliais (RPE) expressos em cada amostra cultivada sobre jovens ou membrana de Bruch humano mais velho explants. Havia mais dispersão do número de genes expressado nas células RPE primárias semeadas no mais velho contra a membrana de Bruch humano mais jovem (± 6201 388 vs 6439 ± 80, respectivamente); cinco explantes foram testados para cada faixa etária. Apresentado com a permissão total de todos os autores de Cai, H et al. 27. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Membrana de Bruch humano envelhecido (matriz extracelular) contribui para a progressão da doença da AMD e, portanto, há uma necessidade de compreender como esta matriz alterada contribui para disfunção de célula RPE. Dada a falta de modelos animais suficientes para estudar as alterações relacionadas à idade na AMD, ex vivo modelo sistemas que imitam os efeitos da doença podem servir como uma ferramenta valiosa para entender a fisiopatologia. A metodologia descrita neste manuscrito pode ser usada para isolar consistentemente humano explants de membrana de Bruch e células de cultura RPE, incluindo linhas de célula primárias, imortalizadas ou células-tronco derivadas RPE.

Como mencionado anteriormente, explantes de membrana de Bruch humano são originados do NDRI. Um protocolo é estabelecido com NDRI que especifica os critérios definidos para os olhos do doador ser aceitável. Por exemplo, os doadores não devem ter nenhum conhecido Oftalmopatias retinal, olhos/globos são recuperados até 10 horas após a morte e globos chegam no laboratório dentro de 48h após a morte (através de entrega de pacotes durante a noite no gelo). Especificar a faixa etária adequada e o número de olhos necessários para a análise estatística do estudo, por exemplo., cinco pares de globos de doadores entre as idades de 20 a 49 anos e cinco pares de globo de doadores entre as idades de 50-89 anos.

A disponibilidade dos globos olho varia, geralmente em média dez pares de globos disponíveis a cada mês. O pacote de olho chega com informações básicas, eliminação identificado doador: idade, raça, hora da morte, causa da morte e breve histórico médico (listagem de doença ou comorbidades).

Mais importante ainda, colheita de explantes de membrana de Bruch humano requer a remoção do segmento anterior do olho e vítreo, permitindo o isolamento do complexo de coroide-membrana de Bruch-RPE. Uma vez que a membrana de Bruch é isolada, as células RPE podem ser propagadas para os explantes acelulares em diferentes concentrações e cultivadas para experimentos a jusante. A preparação e manipulação processual conforme descrito neste documento é crítico, prestando atenção à orientação da membrana de Bruch o isolado para se certificar da superfície laminais é voltado para-up enquanto não tocar a superfície mecanicamente, para evitar danificar o estrutura de superfície da matriz extracelular.

Também deve ser notado que, ao usar sistemas de explante de membrana de Bruch, existem algumas variáveis que poderiam afetar os resultados das experiências a jusante, tais como fundo de genômica de doadores individuais, idade da membrana de Bruch, ou tempo após a morte de Bruch membrana e a localização da membrana de Bruch, i. e., central ou periférica parte de explantes de membrana de Bruch. Como com qualquer outro estudo de tecido humano, deve-se recrutar o número de amostra de olho doador adequado para ter o necessário poder estatístico e coincidir com a idade de olho do doador se for o caso. Estabelecer critérios rigorosos para a aceitação de olhos de bancos de olhos é um parâmetro crítico. Só aceitam os olhos que são enucleado menos de 10h após a morte e que preparação de membrana de Bruch pode ser colhida dentro de 24-48 h após a morte. O site do nervo óptico pode ser usado como um marcador para orientação e usar os mesmos locais para experimental e controlar grupos de estudo. Ao tomar essas medidas, pode-se minimizar variabilidade experimental.

Em resumo, a compreensão do complexo coroide-membrana de Bruch RPE- e como é afetado pela idade e a doença é fundamental para compreender a sua contribuição para a fisiopatologia da AMD. Sistemas modelo que empregam técnicas de ex vivo são uma ferramenta valiosa para investigar esses efeitos usando o tecido humano. Aqui, descrevemos uma metodologia que emprega explantes de doador humano como modelo de membrana de Bruch envelhecido relevantes ex vivo . Esta técnica permite a utilização da membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch como uma ferramenta de pesquisa para investigar como as mudanças estruturais dentro da matriz pode afetar sobrepondo RPE comportamento celular, incluindo anexos, proliferação e gene expressão25 , 27. desenvolvimento bem sucedido de sistemas similares do ex vivo modelo favorecerá a nossa compreensão da AMD e facilitar o desenvolvimento de novas opções terapêuticas.

Divulgações

Nenhum dos autores tem quaisquer divulgações comerciais para declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa é suportada pela pesquisa para evitar cegueira, Nova York, www.rpbusa.org e o maior centro de Nova York para retiniana degenerativa doença Fundação combate cegueira, www.blindness.org. Os autores gostaria agradecer Luanna Bartholomew, pH.d., para sua revisão crítica deste manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Human donor globesNational Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995-065
Carbon-dioxide independent mediaThermo Fisher Scientific18045-088
60-mm polystyrene petri dishCorning Inc.351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBSThermo Fisher Scientific14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm poresMerck MilliporeJGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system Thermo Fisher Scientific09-753-102
AgaroseSigma-AldrichA2576-5G
35 × 10mm culture dishVWR International25373-041
TrephineAccutomeAM0570 60
96 well plateCorning Inc.3595
Minimum essential media (MEM) Thermo Fisher Scientific11095-080 
Penicillin GSigma-AldrichP3032-1MU
StreptomycinSigma-AldrichS6501
GentamicinSigma-AldrichG1914
Amphotericin BSigma-Aldrich1397-89-3
Ammonium hydroxide solutionSigma-Aldrich1336-21-6
 

Referências

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