세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

요약

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

초록

비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, "건조" 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.

서문

나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)^{1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리} . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질^6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. ^{, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.

역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물²³세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추²⁴에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리^{20,25,26,,2728}에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 헬싱키의 선언 및 예일 대학 인간 연구 윤리 위원회 지침의 신조를 준수에서 수행 됩니다.

1. 인간 기증자 눈 소싱

1. 국가 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, 펜 실바 니 아)에서 인간 기증자 글로브를 얻습니다. 프로젝트에 따라 각 실험 그룹 기증자 눈의 이상 3 쌍을 준비 합니다.
2. 10 h 이내 기증자 눈 및 48 h 사후내 배 enucleate. 그런 다음 눈 살 균 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 문화 매체 얼음에 있는 실험실을 전송 합니다. 이전 보고 연구 기증자 눈 수확 및 생물 학적 기능 및 Bruch의 막^25,,2629의 활동이 패션 보존에 이송 증명 하고있다.

2. 인간의 Bruch 막의 수확 Explants

1. 1.5 x 1.5 인치 거 즈에 각 눈 적셔 100mm 문화 접시에 후부는 limbus sclera 3mm 통해 절 개를 만들기 위해 사용 잘 블레이드가 위 이산화탄소 독립적인 DMEM 미디어와 원주 어느 방향으로 확장 하는 장소.
2. 확인 또는 참나무에 전체 두께 원주 절 개 (유리를 관통) 1mm 후부. 제거 하 고 이전 세그먼트 (각 막, 렌즈, 및 홍 채), 유리 체 및 망막을 삭제.
3. 미세 수술가 위 공 막 엔, 맥락 막, 사이 4 개의 방사형 절 개를 사용 하 여 하 고을 피하기 위해 복잡 한 맥락 막/Bruch 막 끊어지고 돌보는 동안 시 신경에 주변에서 공 막 엔 껍질.
4. 다음, ora 참나무 따라 suprachoroidal 공간을 통해 완곡 한 절 개를 확인 하 고는 sclera에서 뒤로 RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한 껍질.
5. 0.02 M Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 DPBS (그림 1)에서 3 시간을 세척 하 여 다음 실 온에서 20 분 페 트리 접시에에서 수산화 암모늄을 explant 목욕 여 네이티브 RPE 세포를 제거 합니다.
6. Unlaminated, 소수 성 65 µ m 두께 소계 막 막 직면 각 explant의 기저 lamina 레이어와 0.2 µ m 숨 구멍을 통해 이산화 탄소 자유로운 매체에 Bruch의 막 복잡 한 explant 부동.
7. 유리 microanalysis 진공 필터 홀더 시스템에 Bruch의 막 explant와 소계 막을 유리 fritted 지원에 놓습니다.
8. 미세 집게를 Bruch의 막 기저 laminin 측면을 건드리지 않도록 돌보는 테플론으로 코팅을 안 쪽에서 컬된 가장자리를 평평.
9. Agarose DPBS (4%)의 15 mL를 열 및 다음 37 ° c 냉각 그럼는 explant 평면 유지 됩니다 보장 하기 위해 부드러운 흡입을 적용 하는 동안 안 쪽에서 Bruch의 막-맥락 막의 복잡 한에 liquidized 젤의 15 mL를 붓는 다. 2-3 분 하는 agarose를 공고히 하 고 다음 소계 막 떨어져 껍질 4 ° C에서 조직 유지.
10. Bruch의 막 explant (응고 agarose 젤에서 직경에 있는 1.5 인치) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 셀 문화 접시에 (Bruch의 막 위로 향하도록)으로 늘어서 되었습니다 따뜻한 액체 agarose Bruch의 멤브레인을 해결 하기 위해 접시의 하단에 있는 장소 향하도록 explant 기저 laminin 레이어와 explant 우물의 바닥에.
11. agarose Bruch의 막 explants 문화 접시에 안정화를 위해 상 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. Bruch의 막 문화에서 explants 커버 DPBS와 접시와 미래 사용을 위한 4 ° C에서 접시를 저장 합니다. 그림 2A 격리 Bruch 막 explants는 60 x 15 m m 문화 접시에 보여 줍니다.
12. 96 잘 접시에 원하는 문화 시스템 있으면 최대 Bruch의 막 explant (1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤) laminin 사이드와 평면 테 플 론 시트에 놓습니다.
13. 5 또는 6, 인하는 판형을 사용 하 여 복잡 한 Bruch의 막에서 6 mm 원형 버튼 explant 고 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 각각 4 %agarose 장소. agarose 각 우물의 바닥에 Bruch의 막 explants (버튼)를 해결 하기 위해 실 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다.
    참고: 그림 2B 는 96 잘 접시 trephined Bruch 막 단추를 보여 줍니다. 일반적으로 9-11 단추 또는 explants 각 눈에서 수확 될 수 있습니다.

3. 인간의 Bruch 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 배양 Explants

1. 기증자 눈을 접수 한 후, 청소와 DPBS extraocular 조직. 완곡 한 절 개를 아이리스 sclera 아래 5mm subretinal 공간에 포인트 (동위 플) 터치를 확인 합니다. 이전 세그먼트, 유리 체 및 망막을 삭제 합니다.
2. Bruch의 막과 차가운 DPBS RPE 시트 포함 아이피 워시. 각 눈 샘플 10 분 보다는 더 이상에 대 한 0.25 %trypsin 5 mL와 RPE 세포 분열 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 50 mL 튜브에 37 ° C에서 예 열 된 DMEM 완전 한 매체의 25 mL로 trypsin 반응을 끄다.
3. 24 ° C에서 10 분 동안 200 × g에서 세포를 원심과 DMEM 완전 한 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (15 %FBS).
4. 셀을 계산 하 고 각 다양 한 세 Bruch 막 explants (버튼) 혈 청 무료 최소 필수 미디어 (MEM)의 200 µ L에서 96 잘 접시에 항생제를 포함의 기저 lamina 에 15000 가능한 RPE 세포 씨앗 (100 IU/mL 페니실린 G, 100 mg / mL 스, 5 mg/mL gentamicin, 그리고 2.5 mg/mL 암포 B). 가정 셀 직경 20 µ m,이 밀도에서 도금의 도금 면적의 약 15%를 커버 하는 RPE 세포 수 있습니다.
5. 그것에 의하여 셀 밀도 수 있습니다 다음까지 증가 시킬 stepwise 셀 동작에 각 매개 변수의 영향에 따라 100% 합류 하는 버튼에 셀 접시
6. 37 ° c.에 95% air/5% CO₂ 의 습도 분위기에서 24 h explant 연결할 셀 허용 부드럽게 따뜻한 완벽 한 DMEM과 매체를 변경 합니다.

결과

이 프로토콜 제대로 수행 되 면 하나 극성 및 외부 혈액 망막 방 벽의 설립, 성장 인자, cytokines의 편광된 분 비에 의해 RPE 세포 기능에 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 확인할 수 있습니다. 그리고 포토 리셉터 막대 외부 세그먼트의 식 균 작용입니다.

우리 세 인간의 Bruch 막에 질병 표현 형을 설명 하는 데이터를 생성 했습니다. 예를 들어 인간의 Bruch 막 explants 감소 RPE 세포 뚝 (그림 3) 세에 RPE 세포 배양. 세 인간의 Bruch 막에 경작 하는 RPE 세포 감소 수 이러한 세포의 phagocytize 막대 외부 세그먼트 (선생님), RPE는 중요 한 기능 (그림 4). 또한, apoptotic 세포 확인 하 고 이전 작업²⁶에 설명 된 대로 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 얼룩을 사용 하 여 이러한 버튼 explants에 비교 될 수 있습니다. RPE 세포 유전자 표현 프로 파일에는 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 microarray 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 젊은 개인 (그림 5)²⁷explants에 비해 더 오래 된 개인에서 인간의 Bruch 막에 경작 하는 경우 RPE 세포 유전자 발현 변경 설명 했다. 통계 분석을 위해 적어도 3-5 인간 기증자에서 explants는 그룹 당 사용 됩니다.

그림 1입니다. 기증자 눈에서 인간의 Bruch 막의 절연의 도식 대표. 인간의 Bruch 막 sclera, 앞쪽 세그먼트, 망막, 유리 체, 제거 하 여 수확 하 고 네이티브 망막 안료 상피 (RPE) 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 인간의 Bruch 막 (BM) 문화 접시에 절연. (A) 인간의 Bruch 막 explants (각 1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤)의 회로도에 배치 60 × 15 mm 폴리스 티 렌 셀 문화 접시 (BM 보여지는) 접시의 하단에 따뜻한 액체 agarose로 가득. 몇 가지 6mm 원형 단추 (explants)에 trephined은 (B)는 인간의 Bruch 막 explant 각 유량을 다음에 배치 되었다 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 4 %agarose. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 젊고 더 오래 된 인간의 Bruch 막 (BM)에 뚝 속도. 기본 RPE 세포 인간 Bruch의 막 영에서 explants에 시드 했다 (< 50 세, n = 3) 이상 (> 70 세, n = 5) 3 주 동안 기증자 눈. 세포 부착 속도 MTT 세포 생존 능력 분석 실험에 의해 측정 되었다. 더 오래 된 인간의 Bruch 막 RPE 세포 부착 속도 24% 감소 (젊은 BM 100 8.54 + 1.44 + 이전 BM 76.65 대 남동 남동). p < 0.05, 남동 표준 오류 =.

그림 4입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 먹어서 인간의 Bruch 막 (BM)의 나이 의해 영향을 받습니다. 기본 RPE 세포 이전 인간 Bruch의 막 explants에 경작 했다 감소 수 막대 외부 세그먼트 (선생님) phagocytize (9.3 + 젊은 BM 873 남동, n = 25.4 + 이전 BM 608 대 5 남동, n = 5). p < 0.01, 남동 표준 오류 =.

그림 5입니다. 수가 망막 안료 상피 (RPE) 셀 유전자 영에 경작 하는 각 샘플에 표현 또는 이전 인간의 Bruch 막 explants. 거기에 시드 기본 RPE 세포에 표현 된 유전자의 수에 더 많은 피해를 했다 젊은 인간의 Bruch 막 대 이전 (6201 ± 388 6439 ± 80, 대 각각); 5 explants는 각 연령 그룹에 대 한 테스트 되었습니다. Cai의 모든 작가의 전체 권한 함께 제시 H 외. ²⁷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.

앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 예의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.

눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.

가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.

또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 즉의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.

요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식²⁵ 셀 동작 ^{, 27}. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human donor globes	National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995-065
Carbon-dioxide independent media	Thermo Fisher Scientific	18045-088
60-mm polystyrene petri dish	Corning Inc.	351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores	Merck Millipore	JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system	Thermo Fisher Scientific	09-753-102
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576-5G
35 × 10mm culture dish	VWR International	25373-041
Trephine	Accutome	AM0570 60
96 well plate	Corning Inc.	3595
Minimum essential media (MEM)	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032-1MU
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1914
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	1336-21-6