Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Resumen

Proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia del ratón fetal ha mejorado la resolución de imagen y puede proporcionar la precisa caracterización no invasiva de desarrollo cardíaco y defectos estructurales. El protocolo descrito en este documento está diseñado para realizar la ecocardiografía ratones fetales en tiempo real en vivo.

Resumen

Defectos congénitos del corazón (CHDs) son la causa más común de morbilidad de la niñez y la mortalidad temprana. Detección prenatal de los mecanismos moleculares subyacentes de CHDs es crucial para inventar nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. Modelos de ratón mutante son poderosas herramientas para descubrir nuevos mecanismos y modificadores de tensión ambiental que impulsan el desarrollo cardíaco y su posible alteración en el CHDs. Sin embargo, esfuerzos para establecer la causalidad de estos supuestos colaboradores han sido limitado a estudios histológicos y moleculares en experimentos con animales no supervivencia, en la que la vigilancia de los parámetros hemodinámicos y fisiológicos clave es a menudo ausente. En tecnología de imagen se ha convertido en una herramienta esencial para establecer la etiología del CHDs. En particular, la proyección de imagen de ultrasonido se puede utilizar prenatally sin exponer quirúrgicamente a los fetos, lo que permite mantener su fisiología de línea de base y monitoreo del impacto del estrés ambiental en los aspectos hemodinámicos y estructurales de la cámara cardiaca desarrollo. Aquí, utilizamos el sistema de ultrasonido de alta frecuencia (30/45) para examinar el sistema cardiovascular en ratones fetales en E18.5 en el útero en la línea de base y en respuesta a la hipoxia prenatal exposición. Demostrar la viabilidad del sistema para medir el tamaño de la cámara cardiaca, morfología, función ventricular, la frecuencia cardíaca fetal e índices de flujo de arteria umbilical y sus alteraciones en ratones fetales expuestos a hipoxia crónica sistémica en el útero en real tiempo.

Introducción

Malformaciones congénitas del corazón son los defectos estructurales heterogéneos que se producen durante el desarrollo cardiaco temprano. Avances técnicos de los procedimientos operativos han llevado a mejoras significativas en las tasas de supervivencia de los recién nacidos con el CHDs^1,2. Sin embargo, calidad de vida es a menudo comprometido secundario a la hospitalización prolongada y las necesidades de reparación quirúrgica procedimientos^1,2,3,4,5en escena. Detección prenatal de los mecanismos moleculares subyacentes de CHDs es crucial para planificar intervenciones tempranas, para llevar a cabo nuevas estrategias de prevención y para mejorar los resultados de toda la vida^6,7.

Aunque múltiples factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogenesia del CHDs, establecer la causalidad sigue siendo una necesidad para mejorar el diagnóstico, terapéutica y estrategias preventivas^{1,8,9 ,10,11,12}. Por otra parte, examinar el papel de factores de estrés en el útero y modificadores epigenéticos abre nuevos espacios para futuras investigaciones^11,12. La última década ha sido testigo de hecho de rápidos avances en secuencia de la tecnología de última generación incluyendo un solo nucleótido polimorfismo (SNP) microarrays, secuenciación del exoma completo y estudios de metilación del genoma, su utilización en el estudio de la genética causas de enfermedades humanas complejas, incluyendo CHDs^1,8,9,10,11 allanando el camino para identificar mutaciones y variantes genéticas que aún no han sido la prueba de su patogenicidad en modelos animales adecuados.

Entre los sistemas del modelo de enfermedad diferentes, el ratón es el modelo animal de la opción, no sólo para investigar mecanismos de CHDs durante cardiogenesis precoz^13,14,15,16, sino también para aclarar su impacto en la maduración de la cámara cardíaca y función en la gestación tardía en factores de estrés prenatal y perinatal. Por lo tanto, realizar en vivo caracterización fenotípica de un corazón de ratón mutante fetal, durante etapas tempranas y tardías del desarrollo, es fundamental entender el papel de estas variaciones genéticas y factores ambientales en el desarrollo cardiaco, y el futuro impacto potencial en los procesos de maduración específica de cámara en ratones.

La detección temprana y diagnóstico preciso de defectos cardiacos durante el desarrollo es fundamental para intervención planificación^17,18. Ser seguro, simple, portable y repetible, sonografía fetal se ha convertido de hecho en la norma técnica para la evaluación cardiaca en la clínica de la proyección de imagen. Evaluación de la circulación fetal mediante ecografía Doppler ha sido ampliamente utilizado en la práctica clínica no sólo para la detección de defectos cardiacos, sino también para detectar anormalidades vasculares, insuficiencia placentaria y restricción del crecimiento intrauterino y para evaluar el bienestar fetal en respuesta a en el útero insultos incluyendo hipoxemia, enfermedad materna y drogas toxicidad^17,18. En paralelo a su valor en la evaluación de enfermedades y defectos humanos, evaluación de ultrasonido de ratones fetales ha ganado cada vez mayor utilidad en la configuración experimental^{19,20,21,22, 23}. En particular, el ultrasonido fetal del corazón (ecocardiografía) permite visualización secuencial en vivo del corazón en desarrollo. Muchos estudios experimentales han utilizado la tecnología de imágenes por ultrasonido para observar el desarrollo cardiovascular fetal en ratones transgénicos fetales. Ecografía Doppler ha sido particularmente útil para aclarar los parámetros fisiopatológicos, tales como los patrones de flujo en la circulación fetal en problemas fisiológicos o enfermedad condiciones^10,19. En los seres humanos y animales, anormal flujo o el oxígeno sanguíneo en el feto puede resultar de diversas afecciones que pueden perturbar entorno fetal en el útero y afectar el eje fetoplacentarias, incluyendo anormalidades placentarias, hipoxia materna, diabetes gestacional y constricción vascular farmacéuticamente inducida^15,22. Por lo tanto, establecer métodos estandarizados para realizar ultrasonidos Doppler en ratones fetales tremendamente empoderará a los estudios futuros de CHDs, facilitando patrones de flujo de control y principales índices hemodinámicos de los circuitos cardiovasculares durante diferentes etapas del desarrollo cardíaco en modelos de ratón genético.

Ultrasonido de alta frecuencia ha surgido como una poderosa herramienta para medir los parámetros fisiológicos y de desarrollo del sistema cardiovascular en modelos de ratón y enfermedades humanas¹⁸. Esta tecnología ha sido perfeccionada en los últimos años. Nosotros y otros investigadores hemos demostrado la viabilidad de este sistema para la realización de estudios de ultrasonido de alta frecuencia el ratón fetal corazón^{15,19,20,21,22 ,23}. El sistema está equipado con transductores de matriz lineal que generan imágenes bidimensionales, dinámicas a velocidades de fotogramas de alta frecuencia (30 a 50 MHz) y mapeo de flujo Doppler color. Estas ventajas, en comparación con sistemas de ultrasonido de baja frecuencia y de la generación anterior de alta frecuencia ultrasonido^21,22, proporcionan la sensibilidad necesaria y la resolución para la evaluación en profundidad de la fetal circulatorio sistema, incluyendo la caracterización completa de las estructuras del corazón, función de cámara e índices de flujo de ratones fetales en configuraciones experimentales. En este documento, describiremos los métodos para realizar una evaluación rápida de la circulación cardiopulmonar y circulación feto-placentaria en el día embrionario E18.5 en vivo mediante un sistema de alta frecuencia. Elegimos un transductor de 30/45 MHz que proporciona una resolución axial de aproximadamente 60 μm y una resolución lateral de 150 μm. Sin embargo, un transductor de frecuencia más alta (40/50 MHz) puede ser elegido para analizar etapas anteriores de desarrollo siguiendo una metodología similar. El seleccionado M-modo permite la visualización de los tejidos en movimiento en la niveles de alta resolución temporal (1.000 fotogramas/s). Finalmente, demostramos la factibilidad de ultrasonido de alta detallada caracterización fenotípica completa de estado hemodinámico cardiovascular fetal y función en ratones en condiciones basales y en respuesta a la hipoxia prenatal.

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Protocolo

La Universidad de California, Los Ángeles, cuidado Animal y uso Comité ha aprobado todos los procedimientos se muestran en el presente Protocolo. Los experimentos se llevaron a cabo como parte de un estudio en curso bajo protocolos animal activados aprobado por la institucional Animal Care y uso Comité de la Universidad de California, Los Ángeles, California, Estados Unidos. Cuidado y manejo de animales siguieron las normas de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. preparación de la alta frecuencia del ultrasonido sistema de imagen

1. Encienda el sistema de proyección de imagen de ultrasonido y la unidad de vigilancia de Fisiología.
2. Conectar el transductor de 30/45 MHz.
3. Coloque el cabezal de exploración correspondiente a su titular cerca de la plataforma de proyección de imagen.
4. Seleccione la opción Programa de medición cardíaca .
5. Lugar el ultrasonido gel boca abajo en el envase previo calentamiento a 37 ° C.
6. Sistema de tubería adecuada para la anestesia de confirmar y verificar los niveles de oxígeno y el isoflurane.
7. Desinfecte la plataforma de proyección de imagen y el área de trabajo.
8. Establecer el nivel de la plataforma de proyección de imagen para mantener la temperatura corporal constante y ritmo de las presas.

2. embarazadas ratón preparación

1. Colocar la presa embarazada ratón (C57/BL6) en la cámara de inducción de la anestesia.
2. Inducen anestesia utilizando continuamente entregado por inhalación isoflurano (isoflurano 2% - 3%) mezclado con oxígeno al 100% (100% O₂) con un caudal de 200 mL/min en la cámara de inducción.
3. Transferir el animal sedado en la plataforma de proyección de imagen en una posición supina.
4. Proporcionan sedación estado estacionario mediante el uso de una mascarilla conectada a anestesia tubería sistema entrega isoflurano (1.0-1.5%) mezclado con 100% O₂ a 200 mL/min.
   PRECAUCIÓN: Controlar la fuga de gas anestésico mediante un sistema de ventilación equipado con un filtro de carbón conteniendo frasco.
5. Cinta los miembros suavemente a los electrodos electrocardiográficos incorporados después de la aplicación del gel del electrodo para lograr una supervisión constante de las tasas cardiacas y respiratorias materna.
6. Ajustar el nivel de isoflurano para mantener un ritmo cardíaco medio de (450 +-50 latidos/minuto (bpm)).
7. Mantener la temperatura del cuerpo dentro de un rango de 37,0 ° C +/-0.5 ° C. Controlar la temperatura corporal y ritmo cardíaco se muestra en la unidad de control de la fisiología.
8. Documentar los signos vitales del ratón sedado cada 15 minutos durante todo el procedimiento por imágenes.
9. Evaluar el nivel de la anestesia mediante la evaluación de postura, frecuencia cardíaca y respuesta a pellizcos del ratón.
10. Aplicar bálsamo oftálmico (1 gota en cada ojo) para evitar la sequedad del ojo y daño corneal.
11. Quitar la piel desde el nivel de medio pecho para las extremidades inferiores mediante una crema depilatoria para minimizar la atenuación del ultrasonido. Retire la crema 1-1.5 min después toallitas de uso alternando una gasa húmeda y seca para evitar daños en la piel.

3. embrión identificación

1. Palpar la pared abdominal suavemente para localizar los fetos y extiéndalas.
2. Anotar cada embrión en el abdomen de la presa y definir sus orientaciones antero-posterior y dorsal-ventral mediante un marcador.
3. Utilice el cuello del útero de la presa sedada como un hito. Los fetos en los cuernos uterinos derecho e izquierdos de la etiqueta como L1, L2, L 3, etc. (lado izquierdo) y R1, R2, R3, etc. (lado derecho), respectivamente (figura 1A).
   PRECAUCIÓN: Evitar la propagación de los fetos con fuerza. 1-2 fetos en cada camada pueden superponerse con los otros, haciendo que su posicionamiento y proyección de imagen no fiable. Excluir estos fetos a partir del análisis.

4. fetal corazón visualización y anotación

1. Aplicar ultrasonido con gel en el abdomen y pásalo con cuidado para evitar formación de burbujas. Añadir más cantidad de gel en el área de exploración de la proyección de imagen.
2. Coloque la sonda de ultrasonido en su soporte mecánico y movilizar gradualmente hacia la piel en contacto con la capa de gel espeso mientras mira por el corazón mediante el análisis-modo B (figura 1).
3. Haga clic en el botón exploración de modo B para obtener imágenes 2-D. Usar la vejiga como un punto de referencia para identificar el primer feto colocado en el derecho o el cuerno uterino izquierdo y marcarlo como R1 o L1, respectivamente.
4. Confirman la orientación derecha e izquierda del feto individual en tiempo real mediante el movimiento de la plataforma de proyección de imagen en el plano horizontal. Exploración de la cabeza a la cola para anotar el hocico, las extremidades y la columna vertebral como puntos de referencia (figura 1B, vídeo 1).
5. Visualizar el corazón y anotar el ventrículo izquierdo (LV) y el ventrículo derecho (VD). Modo Doppler color de uso para optimizar la visualización del corazón (figura 1 C-G, Videos 1 - 2).
6. Haga clic en el botón exploración de modo B para obtener un eje corto paraesternal-vista, tienen las LV y RV en su diámetro máximo en el centro del marco de adquisición de datos. Iniciar la proyección de imagen viva (figura 1B-C).
7. Cambiar la orientación del ratón con respecto a la digitalización de planos para obtener una vista de cuatro cámaras longitudinal (figura 1). En primer lugar, identificar las restantes estructuras del corazón como las aurículas, tabique interventricular y los tractos de salida derecho e izquierdo. Luego, haga que las cámaras ventriculares y atriales en su diámetro máximo. Luego iniciar la adquisición de la imagen.
8. Excluir las imágenes no óptima, oblicuas del análisis final. Pulse el botón de Cini para obtener grabación continua 'Cineloops' para un mínimo de 10 s, entonces guardar las imágenes grabadas.

5. evaluación de la frecuencia cardíaca Fetal y función Ventricular

1. Pulse el botón M-modo escaneo para obtener imágenes cardiacas de cuatro planos de la cámara (vídeo 3).
2. Ver la lista de las grabaciones para el análisis una vez las imágenes de todos los embriones.
3. Excluir las imágenes no óptima, oblicuas del análisis final.
4. Haga clic en el botón de análisis para medir espesor de la pared y el diámetro interior izquierda ventricular en diástole (LVID, d; RVID, d) y sístole (LVID, s; RVID, s), como se muestra en la figura 2.
5. Determinar la frecuencia cardíaca fetal promedio jugando cada uno registrado M-modo trazado y cálculo de la medición de flujo de un ciclo al siguiente flujo ciclo (el espaciamiento entre picos adyacentes).
6. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener la frecuencia cardíaca promedio (figura 2).
7. Medir los cambios temporales entre diámetro diastólico interno ventricular izquierdo (LVID, d) y diámetro interno ventricular izquierdo en sístole final (LVID, s) a través del ciclo cardiaco. Luego calcular el porcentaje de acortamiento fraccional (% FS) como sigue: % FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
8. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener los valores promedio de % de FS.

6. evaluación de parámetros de flujo cardiopulmonar

1. Ajustar el sector en un ángulo de adquisición^ode menos de 60. Haga clic en el botón Doppler para realizar las mediciones Doppler de onda pulsada desde el plano de proyección de imagen de cámara cuatro de 2-D mediante un transductor de 45 MHz.
   1. En primer lugar, visualizar la bifurcación de la arteria pulmonar para identificar la zona derecha de la salida. A continuación, haga clic en botón de onda pulsada Doppler para obtener el patrón de flujo a través de la pulmonar y las válvulas aórticas (Figura 3A, Video 4).
2. Obtener mediciones del flujo pulmonar de onda pulsada Doppler seguimiento, incluyendo velocidad sistólica pico (PkV), tiempo de aceleración (AT) y el tiempo de eyección (ET).
3. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener las mediciones promedio como se muestra en la Figura 3A (derecha).
4. Calcular el cociente de ET para cada válvula de salida como un indicador de la permeabilidad del tracto de salida y flujo de la sangre.
5. Proceder para obtener los patrones de flujo mitral y aórtica de vistas 2D apical cuatro cámara usando la onda pulsada Doppler. En primer lugar, identificar las cámaras ventriculares izquierdas y aurículas izquierdas. A continuación, coloque el volumen de la muestra Doppler de onda pulsada para la grabación de patrones Doppler del flujo mitral y medición velocidad diastólica precoz (E) y velocidad de la contracción auricular (A) (figura 3B)^24,25.
6. Ajustar el volumen de la muestra Doppler para obtener el patrón de la jet Doppler aórtico. Utilizar el jet Doppler aórtico seguimiento para medir la aceleración (AT) y tiempo de eyección (ET) como se muestra en la figura 3B (derecha) (Video 5)

7. evaluar el eje Feto-placentaria

1. Utilice el análisis Doppler color para visualizar el árbol vascular feto-placentaria y la arteria uterina utilizando el transductor de 45 MHz (Figura 4A).
2. Identificar los vasos umbilicales (dos arterias y una vena) en el segmento intra amniótico del cordón umbilical, justo después de que el cable sale del abdomen fetal.
3. Onda pulsada lugar volumen muestra del Doppler para obtener el patrón de flujo de la arteria umbilical (Figura 4A).
4. Medir los parámetros de flujo pico vascular incluyendo tiempo de aceleración (AT), tiempo de eyección (ET), y pico de velocidad de flujo en sístole final (PkV, s) usando la onda pulsada registro exploración Doppler (Figura 4B).
5. Obtener 5 ondas consecutivas en cada vaso, en la ausencia de movimientos fetales y los movimientos respiratorios maternos, para medir la velocidad máxima promedio para cada recipiente.
6. Proceder al próximo embrión.

8. la proyección de imagen de Animal control

1. Apague el contenedor de isoflurano tras la conclusión del proceso de proyección de imagen.
2. Continuar la vigilancia de temperatura corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca durante la fase de recuperación.
3. Retirar la mascarilla y el sistema de tubería conectado una vez que la presa comienza movimientos espontáneos.
4. Volver a la presa a una vivienda adecuada y seguir observación según protocolos institucionales de después del procedimiento.
5. El tiempo para la completa reanudación de la actividad normal del documento.

9. prescripciones y consideraciones técnicas

1. Limitar el tiempo de procesamiento para fetos de 8 a aproximadamente 1 hora para evitar los efectos adversos de la anestesia prolongada de signos vitales y parámetros fisiológicos.
2. Completar la formación con 8-10 ratones embarazadas para optimizar técnicas de patrones de adquisición y flujo de imagen, seguimiento en corto tiempo.

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Resultados

Análisis estadístico de los índices cardíacos y hemodinámicos fueron realizados fuera de línea. Se calcularon los medios de 5 mediciones consecutivas en 3 imágenes óptimas. Los datos se expresaron como media ± SEM. estudiante t-prueba fue utilizada para inferir comparaciones intergrupos. Valor P ≤0. 05 se consideró estadísticamente significativo.

Siguiendo el protocolo anterior, nos caracteriza el ...

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Discusión

Enfermedades y malformaciones cardiovasculares están influenciadas sustancialmente por factores genéticos y ambientales elementos¹⁹. Previamente hemos demostrado un impacto significativo de la restricción calórica, iniciada durante el segundo trimestre, el feto-placentario flujo circulatorio y la función cardiaca fetal⁹.

La hipoxia prenatal es otro factor de estrés común durante el desarrollo fetal que puede afectar tremendamente la fisiol...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain