Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Resumo

Imagem de ultra-som de alta frequência do mouse fetal melhorou a resolução de imagem e pode fornecer precisa caracterização não-invasivo do desenvolvimento cardíaco e defeitos estruturais. O protocolo descrito neste documento é projetado para executar em tempo real de ratos fetal ecocardiografia na vivo.

Resumo

Defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são a causa mais comum da infância morbi -mortalidade precoce. A detecção pré-natal dos mecanismos moleculares subjacentes do CHDs é crucial para inventar novas estratégias preventivas e terapêuticas. Modelos de rato mutante são ferramentas poderosas para descobrir novos mecanismos e modificadores de estresse ambiental que impulsionam o desenvolvimento cardíaco e sua potencial alteração no CHDs. No entanto, os esforços para estabelecer a causalidade destes putativos contribuintes foram limitado a estudos histológicos e moleculares em experiências com animais não-sobrevivência, no qual monitoramento de parâmetros fisiológicos e hemodinâmicos chaves é frequentemente ausente. Tecnologia de imagem ao vivo tornou-se uma ferramenta essencial para estabelecer a etiologia do CHDs. Em particular, ultra-sonografia pode ser usada de pré-Natal sem expor cirurgicamente os fetos, permitindo a manutenção de sua fisiologia de base enquanto monitora o impacto do estresse ambiental sobre os aspectos estruturais e hemodinâmicos da câmara cardíaca desenvolvimento. Aqui, usamos o sistema de ultra-som de alta frequência (30/45) para examinar o sistema cardiovascular em ratos fetais no E18.5 no utero na linha de base e em resposta à exposição de hipóxia pré-natal. Podemos demonstrar a viabilidade do sistema para medir o tamanho da câmara cardíaca, morfologia, função ventricular, ritmo cardíaco fetal e índices de fluxo da artéria umbilical e suas alterações em fetais camundongos expostos a hipóxia crônica sistêmica no utero no real está na hora.

Introdução

Malformações congênitas do coração são heterogêneos defeitos estruturais que ocorrem durante o desenvolvimento cardíaco precoce. Os avanços técnicos atuais dos procedimentos operacionais levaram a melhorias significativas nas taxas de sobrevivência de crianças com CHDs^1,2. No entanto, qualidade de vida é muitas vezes comprometida secundária à hospitalização prolongada e necessidades dos encenado reparo cirúrgico procedimentos^1,2,3,4,5. A detecção pré-natal dos mecanismos moleculares subjacentes do CHDs é crucial para planificar intervenções precoces, de realizar novas estratégias de prevenção e para melhorar os resultados ao longo da vida^6,7.

Embora vários fatores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogênese do CHDs, que institui o nexo de causalidade continua a ser uma necessidade insatisfeita para melhorar o diagnóstico, terapêuticos e estratégias preventivas^{1,8,9 ,10,11,12}. Além disso, examinar o papel de fatores de estresse no utero e modificadores epigenéticas abre novos espaços para futuras investigações^11,12. Na última década testemunhou realmente rápidos avanços no sequenciamento tecnologia de última geração incluindo microarray de nucleotídeo único (SNP) de polimorfismo, toda exome sequenciamento e estudos de metilação de todo o genoma, sua utilização no estudo da genética causas de doenças humanas complexas, incluindo CHDs^1,8,9,10,11 pavimentando o caminho para identificar novas mutações e variantes genéticas que ainda não foram testado para sua patogenicidade em modelos animais apropriados.

Entre os sistemas de modelo de doença diferente, o rato é o modelo animal de escolha, não apenas para investigar os mecanismos do CHDs durante cedo cardiogenesis^13,14,15,16, mas também para elucidar seu impacto na maturação de câmara cardíaca e função em final de gestação nos fatores de estresse pré-natal e perinatal. Portanto, realizando na vivo fenotípica caracterização de um coração de rato mutante de fetal, durante os estágios iniciais e finais de desenvolvimento, é crucial para compreender o papel destas variações genéticas e fatores ambientais no desenvolvimento cardíaco, e o futuro potencial impacto sobre os processos de maturação específico de câmara em camundongos.

Deteção adiantada e diagnóstico preciso de defeitos cardíacos durante o desenvolvimento é fundamental para intervencionista planejamento^17,18. Sendo seguro, simples, portáteis e repetível, ecografia fetal tornou-se efectivamente a norma técnica para avaliação cardíaca na clínica de imagem. Avaliação de circulação fetal usando ultra-som Doppler foi amplamente utilizada na prática clínica não só para a detecção de defeitos cardíacos, mas também para detectar anormalidades vasculares, insuficiência da placenta e restrição de crescimento intra-uterino e avaliar o fetal bem-estar em resposta a insultos no utero incluindo hipoxemia, doença materna e toxicidade de drogas^17,18. Em paralelo ao seu valor na avaliação de doenças e defeitos humanos, avaliação de ultrassom dos ratos fetais tem ganhado crescente utilidade em configurações experimentais^{19,20,21,22, 23}. Em particular, ultrassom do coração fetal (ecocardiografia) permite visualização sequencial na vivo do coração em desenvolvimento. Muitos estudos experimentais utilizaram tecnologia de geração de imagens de ultra-som para observar o desenvolvimento cardiovascular fetal em ratos transgénicos fetais. Ultrassom Doppler tem sido particularmente útil para elucidar os parâmetros fisiopatológicos, como os padrões de fluxo na circulação fetal sob desafios fisiológicos ou doença condições^10,19. Em seres humanos e animais, vascularização anormal da fluxo ou oxigênio para o feto pode resultar de diversas condições que podem perturbar o ambiente do feto no útero e afetam o eixo fetoplacental, incluindo anormalidades da placenta, hipóxia materna, diabetes gestacional e constrição vascular farmaceuticamente induzido^15,22. Portanto, estabelecer métodos padronizados para a realização de ultra-som Doppler fetal ratos irá tremendamente capacitar futuros estudos do CHDs, facilitando o monitoramento de padrões de fluxo e principais índices hemodinâmicos dos circuitos cardiovasculares durante diferentes estágios de desenvolvimento cardíaco em modelos genéticos de rato.

Ultra-som de alta frequência tem emergido como uma poderosa ferramenta para medir os parâmetros fisiológicos e do desenvolvimento do sistema cardiovascular em modelos do rato e doenças humanas¹⁸. Esta tecnologia tem sido aperfeiçoada nos últimos anos. Nós e outros pesquisadores têm demonstrado a viabilidade desse sistema para a realização de estudos de ultra-som ultra alta frequência sobre o rato fetal coração^{15,19,20,21,22 ,23}. O sistema é equipado com mapeamento de fluxo Doppler cor e Transdutores de matriz linear que geram imagens bidimensionais, dinâmicas em taxas de quadro de alta frequência (30 a 50 MHz). Estas vantagens, em comparação com sistemas de ultra-som de baixa frequência e a geração anterior de alta frequência ultra-som^21,22, fornecem a necessária sensibilidade e resolução para avaliação aprofundada de fetal circulatória sistema, incluindo a caracterização abrangente das estruturas do coração, função de câmara e índices de fluxo dos ratos fetais em configurações experimentais. Neste documento, descrevem métodos para executar uma avaliação rápida da circulação cardiopulmonar e circulação feto-placentária no dia embrionário E18.5 na vivo por meio de um sistema de alta frequência. Optamos por um transdutor de 30/45 MHz que proporciona uma resolução axial de cerca de 60 µm e uma resolução lateral de 150 µm. No entanto, um transdutor de frequência mais elevado (40/50 MHz) pode ser escolhido para analisar os estádios de desenvolvimento mais cedo, seguindo uma abordagem metodológica semelhante. O M-modo selecionado permite a visualização de tecidos em movimento em níveis de alta resolução temporal (1.000 quadros/s). Finalmente, podemos demonstrar a viabilidade de ultra-som de alta para detalhada Caracterização fenotípica abrangente do estado hemodinâmico cardiovascular fetal e função em ratos na linha de base e em resposta ao estresse da hipoxia pré-natal.

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Protocolo

A Universidade da Califórnia, Los Angeles, cuidado Animal e uso comitê aprovou todos os procedimentos mostrados neste protocolo. Os experimentos foram realizados como parte de um estudo em curso sob ativos animais protocolos aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comitê da Universidade da Califórnia, Los Angeles, Califórnia, EUA. Cuidados e tratamento de animais seguiram as normas do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.

1. preparar o ultra-som de alta frequência, sistema de imagem

1. Ligue o sistema de imagens de ultra-som e a unidade de monitorização de fisiologia.
2. Conecte o transdutor de 30/45 MHz.
3. Coloque a cabeça de varredura correspondente no suporte perto da plataforma de imagem.
4. Selecione a opção do Programa de medição cardíaca .
5. Lugar do ultra-som gel de cabeça para baixo em seu contêiner de pré-aquecimento conjunto para 37 ° C.
6. Confirmar o sistema de mangueiras apropriadas para anestesia e verificar os níveis de oxigênio e isoflurano.
7. Desinfecte a plataforma de imagem e a área de trabalho.
8. Defina o nível de calor da plataforma de imagem para manter a temperatura corporal constante e frequência cardíaca das barragens.

2. preparação do rato grávida

1. Coloca a barragem de rato grávida (C57/BL6) na câmara de indução de anestesia.
2. Induzi anestesia usando continuamente entregues isoflurano inalatório (isoflurano 2-3%) misturado com oxigênio a 100% (100% O₂) com um caudal de 200 mL/min na câmara de indução.
3. Transferi o animal sedado para a plataforma de imagem em uma posição supina.
4. Fornece o estado estacionário sedação usando uma máscara, conectada ao anestesia tubulação, fornecendo sistema isoflurano (1,0% - 1,5%) misturado com 100% O₂ a 200 mL/min.
   Atenção: Controle o vazamento de gás anestésico, usando um sistema de ventilação equipado com um filtro de carvão que contém o conjunto do cilindro.
5. Fita Membros suavemente para os eletrodos de eletrocardiograma incorporados após a aplicação do gel eletrodo para alcançar o monitoramento constante da maternas taxas cardíacas e respiratórias.
6. Ajuste o nível de isoflurano para manter uma média da frequência cardíaca (450 + /-50 batimentos/minuto (bpm)).
7. Manter a temperatura corporal dentro de um intervalo de 37,0 ° C + /-0,5 ° C. Monitore a temperatura corporal e frequência cardíaca, sendo exibido na unidade de controlador de fisiologia.
8. Documente os sinais vitais do mouse sedado cada 15 minutos durante todo o procedimento da imagem latente.
9. Avalie o nível de anestesia, avaliando a postura do rato, frequência cardíaca e resposta aos pés pitadas.
10. Aplica o bálsamo oftálmico (1 gota em cada olho) para evitar ressecamento do olho e danos da córnea.
11. Remova a pele do nível do meio do peito para os membros inferiores, usando um creme depilatório para minimizar a atenuação do ultra-som. Remova o creme 1-1,5 min após aplicação pela alternância de gaze úmida e seca limpa para evitar danos à pele.

3. embrião identificação

1. Palpe a parede abdominal suavemente para localizar os fetos e espalhe-as.
2. Anotar cada embrião no abdômen da barragem e definir suas orientações ântero-posterior e dorso-ventral usando um marcador.
3. Use o colo do útero da barragem sedado como um marco. Rotular os fetos nos chifres esquerdos e direito uterinos como L1, L2, L 3, etc. (lado esquerdo) e R1, R2, R3, etc. (lado direito), respectivamente (figura 1A).
   Atenção: Evite espalhar os fetos com força. 1-2 fetos em cada ninhada podem sobrepor-se com os outros, tornando o seu posicionamento e da imagem latente não confiável. Exclua estes fetos a partir da análise.

4. o batimento cardíaco visualização e anotação

1. Aplicar o gel de ultra-som pré-aquecido no abdômen e espalhá-lo com cuidado para evitar a formação de bolhas. Adicione uma quantidade adicional de gel sobre a área de digitalização de imagem.
2. Coloque a sonda de ultra-som no suporte mecânico e mobilizá-la gradualmente em direção a pele ao contato com a camada de gel espesso enquanto olha para o coração batendo, usando o B-modo de digitalização (Figura 1).
3. Clique no botão B modo de digitalização para obter imagens 2-D. Use a bexiga como um marco para identificar o primeiro feto posicionado no direito ou o corno uterino esquerdo e marcá-lo como R1 ou L1, respectivamente.
4. Confirme a orientação direita e esquerda do feto individual em tempo real, movendo a plataforma de imagem no plano horizontal. Varredura da cabeça à cauda para anotar o focinho, membros e coluna vertebral como Marcos (figura 1B, vídeo 1).
5. Visualize o coração pulsante e anotar o ventrículo esquerdo (LV) e o ventrículo direito (RV). Modo de uso cor Doppler para otimizar a visualização do coração (Figura 1 C-G, vídeos 1 - 2).
6. Clique no botão B modo de digitalização para obter um curto eixo-esternal, ter o LV e RV exibido em seu diâmetro máximo no centro do quadro de aquisição de dados. Começa a imagem ao vivo (figura 1B-C).
7. Altere a orientação do mouse com relação a digitalização aviões para obter uma visão de quatro câmaras longitudinal (Figura 1). Em primeiro lugar, identifica as estruturas restantes do coração como os átrios, septo interventricular e os tratos de saída esquerda e direita. Em seguida, temos as câmaras ventriculares e atrial, exibidas no seu diâmetro máximo. Então comece a aquisição de imagens.
8. Exclua as imagens não ideal, oblíquas da análise final. Clique no botão de Cini para obter a gravação contínua 'Cineloops' para um mínimo de 10 s, em seguida, salvar as imagens gravadas.

5. avaliação da frequência cardíaca Fetal e função Ventricular

1. Clique no botão M-modo de digitalização para obter imagens cardíacas de quatro aviões de câmara (vídeo 3).
2. Ver a lista de gravações para análise uma vez que as imagens de todos os embriões forem concluídas.
3. Exclua as imagens não ideal, oblíquas da análise final.
4. Clique no botão de análise de espessura de parede medida e o diâmetro interno ventricular esquerda/direita na diástole (LVID, d; RVID, d) e a sístole (LVID, s; RVID, s), conforme mostrado na Figura 2.
5. Determine a taxa média de coração fetal, jogando cada um gravou M-modo de rastreamento e calcular a medida do fluxo de um ciclo para o seguinte fluxo de ciclo (o espaçamento entre picos adjacentes).
6. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter a média da frequência cardíaca (Figura 2).
7. Medir as mudanças temporais entre esquerda ventricular diastólica de diâmetro interno (LVID, d) e de diâmetro interno ventricular esquerdo na sístole final (LVID, s) em todo o ciclo cardíaco. Então calcular o percentual de encurtamento fracionário (% de FS) como segue: % de FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
8. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter os valores médios de % FS.

6. avaliação de parâmetros de fluxo cardiopulmonar

1. Ajuste o setor em um ângulo de aquisição inferior a 60^o. Clique no botão Doppler para realizar medições Doppler pulsado onda do avião 2-D quatro imagens de câmara usando um transdutor de 45 MHz.
   1. Em primeiro lugar, visualize a bifurcação da artéria pulmonar para identificar o tracto de saída direita do. Em seguida, clique em botão de onda pulsada Doppler para obter o padrão de fluxo através do pulmonar e as válvulas aórtica (Figura 3A, Video 4).
2. Obter medições de fluxo pulmonar de onda pulsada Doppler rastreamento, incluindo velocidade sistólica de pico (PkV), tempo de aceleração (AT) e tempo de ejeção (ET).
3. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter medições médias como mostrado na Figura 3A (à direita).
4. Calcular o AT / ET ratio para cada válvula de saída como um indicador da patência de folhetos a saída e o fluxo de sangue.
5. Proceda para obter os padrões de fluxo mitral e aórtica de 2-D apical câmara quatro modos de exibição usando a onda pulsada Doppler. Em primeiro lugar, identifica as câmaras de ventriculares esquerdas e atrial esquerdas. Em seguida, coloque o volume de amostra Doppler pulsado onda para gravação de padrões Doppler mitral afluência e medição de velocidade diastólica precoce (E) e velocidade de contração atrial (A) (Figura 3B)^24,25.
6. Ajuste o volume de amostra Doppler para obter o padrão de jato Doppler da aorta. Use o jato Doppler da aorta rastreamento para medir aceleração tempo (AT) e o tempo de ejeção (ET), conforme mostrado na Figura 3B (à direita) (Video 5)

7. avaliar o eixo Feto-placentária

1. Use o scan Doppler cor para visualizar a artéria uterina e feto-placentária árvore vascular usando o transdutor de 45 MHz (Figura 4A).
2. Identifica os vasos umbilicais (duas artérias e uma veia) no segmento intra-amniótica do cordão umbilical, apenas após o cabo sai do abdome fetal.
3. Onda pulsada de lugar volume de amostra Doppler para obter o padrão de fluxo da artéria umbilical (Figura 4A).
4. Medir parâmetros de fluxo de pico vasculares incluindo tempo de aceleração (em), tempo de ejeção (ET) e o pico de velocidade de fluxo na sístole final (PkV, s) usando a onda pulsada Doppler registro varredura (Figura 4B).
5. Obter 5 formas de onda consecutivas em cada navio, na ausência de movimentos fetais e maternos movimentos respiratórios, para medir a velocidade média de pico para cada navio.
6. Prossiga para o próxima embrião.

8. pós-imagem Animal monitoramento

1. Desligue o recipiente de isoflurano após a conclusão do processo de geração de imagens.
2. Continue a acompanhar a frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura corporal durante a fase de recuperação.
3. Remova a máscara e o sistema de mangueiras ligadas, uma vez que a represa começa movimentos espontâneos.
4. Retornar a barragem à habitação adequada e continuar a observação de acordo com protocolos de após o procedimento padrão institucionais.
5. O tempo para reinício completo da atividade normal de documento.

9. requisitos e considerações técnicas

1. Limite o tempo de processamento para ~ 8 fetos de cerca de 1 h, para evitar os efeitos adversos da anestesia prolongada sobre os sinais vitais e parâmetros fisiológicos.
2. Complete a formação com 8-10 ratos grávidas para otimizar técnicas para padrões de fluxo e aquisição de imagem de rastreamento em um curto espaço de tempo.

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Resultados

Análises estatísticas de índices cardíacas e hemodinâmicas foram realizadas off-line. Calcularam-se os meios de 5 medições consecutivas em 3 imagens ideais. Os dados foram expressos como média ± SEM. Student t-teste foi usado para inferir comparações intergrupais. Um valor de P de ≤0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Seguindo o protocolo acima, temos caracterizado o impacto da expo...

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Discussão

Doenças e malformações cardiovasculares são substancialmente influenciadas por fatores genéticos e ambientais elementos¹⁹. Nós demonstramos anteriormente um impacto significativo de restrição calórica materna, iniciada durante o segundo trimestre, no feto-placentária fluxo circulatório e a função cardíaca fetal⁹.

Hipoxia pré-natal é outro factor comum de stress durante o desenvolvimento fetal que pode afetar enormemente a fisiolog...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain