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要約

高周波超音波胎児マウスの解像度の画像が上がったし、心臓発生と構造欠陥の正確な非侵襲的評価を提供することができます。本プロトコルを実行するリアルタイムの胎児マウス エコー生体内で設計されています。

要約

先天性心疾患 (CHDs) は、子供の罹患率と早期死亡の最も一般的な原因です。出生前診断 CHDs の分子機構の解明は、新しい予防と治療戦略を発明にとって重要です。変異マウスのモデルは、新しいメカニズムおよび CHDs に心臓の開発とその潜在的な変質をドライブ環境ストレス修飾子を発見するための強力なツールです。これらの推定貢献者の因果関係を確立する努力がされている非生存動物実験組織学的・分子学限られた主要な生理学的および血行動態的パラメーターを監視するには、しばしば欠席。ライブ イメージング技術 CHDs の病因を確立する重要なツールとなっています。特に、超音波画像診断は外科的に胎児をさらすことがなく出生前使用できる商工会議所心臓の血行動態と構造面の環境ストレスの影響を監視しながら自分のベースラインの生理機能を維持することができます開発。ここで、我々 は心血管システム胎児マウス E18.5子宮内のベースラインに、出生前の低酸素暴露に応答を調べる高周波超音波 (30/45) システムを使用します。我々 は心臓チャンバー サイズ、形態、心機能、胎児の心拍数と臍動脈流インデックス、および全身の慢性的な低酸素症子宮内で実にさらされている胎児マウスで彼らの変化を測定するシステムの可能性を実証します。時間。

概要

心臓の先天異常が早期の心臓の開発中に発生する異種の構造上の欠陥です。運用手順の現在の技術の進歩は、CHDs1,2児の生存率の大幅な改善につながっています。しかし、生活の質はしばしば長期入院やニーズに侵害された二次手術手順1,2,3,4,5を上演します。出生前診断 CHDs の分子機構の解明は、新たな予防戦略を遂行し、生涯の成果6,7を改善する早期介入を計画するために重要です。

CHDs 病態では、複数の遺伝子と環境要因が関与しているが診断、治療、改善するために満たされていない必要性と予防戦略1,8,9 のまま因果関係を確立します。 ,,1011,12。さらに、子宮内でのストレス要因とエピジェネティックな修飾子の役割を調べて将来調査11,12の新しい会場を開きます。最後の十年は確かに次世代シーケンス技術単一ヌクレオチド多型 (SNP) マイクロ アレイ、全エキソーム配列、ゲノム広いメチル化研究など遺伝の勉強に利用の急速な進歩を目撃しています。CHDs1,8,9,10,11を新規変異とされていない遺伝的変異を識別するために道を舗装を含む複雑な人間の病気の原因します。適切な動物モデルにおける病原性のテスト。

別の病気モデル システム間でマウスは13,の心臓初期14,15,16時でも解明する CHDs のメカニズムを調査するだけでなく、好みの動物モデル心臓チャンバー成熟と出生前および周産期のストレス要因の胎生後期に機能への影響。したがって、生体内で表現型特徴づけを行う変異マウス胎児心臓の開発の初期段階および後期段階ではこれらの遺伝的変異と心臓の開発の環境要因の役割を理解することが重要とマウスにおける商工会議所特定の成熟プロセスの潜在的な将来の影響。

早期発見と開発の間に心臓障害の正確な診断は、介入計画17,18にとって重要です。セーフ、シンプル、ポータブルで反復可能であること、胎児超音波画像クリニックで心臓の評価のための技術標準となっている確かに。超音波ドプラを用いた胎児循環評価が広く使用されて臨床心臓欠陥の検出のためだけでなくも血管異常、胎盤機能不全や子宮内胎児発育制限を検出し、評価するには胎児の福利子宮内低酸素血症、母体の病気、薬物毒性17,18などの侮辱への応答。人間の欠陥と疾患の評価に値に並行して、超音波検査胎児マウスの実験設定19,20,21,22、増加ユーティリティを得ています 23。特に、胎児心臓超音波 (心エコー) は、心臓の開発の連続した生体内で可視化できます。多くの実験的研究は、トランスジェニック マウス胎児の胎児心血管を観察するのに超音波イメージング技術を使用しています。ドップラー超音波は、生理学的課題や病気の条件10,19の下で胎児循環のフロー パターンや、病態生理学的パラメーターを明らかにする特に役立っています。人間と動物の両方で胎児への異常な血液の流れや酸素供給に起因することができます子宮内胎児環境破壊および胎盤軸、胎盤異常を含む母体低酸素症に影響を与えるさまざまな条件妊娠糖尿病と薬学的誘導血管狭窄15,22.したがって、胎児マウスのドップラー超音波を実行するための標準化された方法の確立途方もなく権限を与える CHDs の将来の研究中に心血管回路のキーの血行動態指標と監視フロー パターンを促進することで遺伝的マウスモデル.の心臓の開発のさまざまな段階

高周波超音波は、マウス モデルおよびひと疾患18で心臓血管系の発達的および生理学的パラメーターを測定するための強力なツールとして浮上しています。この技術は、ここ数年でさらに洗練されてきた。我々 と他の研究者は、胎児マウス中心15,19,20,21,22 の超高周波超音波研究のためこのシステムの有効性を実証しています。 ,23。色ドップラー フロー マッピング、リニアアレイ探触子高周波 (30 ~ 50 MHz) のフレーム レートで二次元でダイナミックな画像を生成するシステムが備わります。これらの利点は、低周波超音波診断装置と高周波超音波21,22, 前の世代に比べて循環、胎児の詳細な評価のため必要な感度と分解能を提供します。システムは、実験の設定で心構造、商工会議所の関数、および胎児マウスのフロー指標の包括的な評価を含みます。ここで、我々 は高周波装置を使用して心肺循環と萌芽期日 E18.5体内で胎児胎盤循環の迅速な評価を実行する方法を概説します。約 60 μ m の軸解像度および 150 μ m の空間分解能を提供する 30/45 MHz の探触子を選びました。ただし、次のような方法論的アプローチによって以前の発達段階を分析する高周波数探触子 (40/50 MHz) を選択できます。選択した M モードでは、高時間分解能のレベル (1,000 フレーム/秒) での運動の組織の描出が可能します。最後に、我々 は胎児心臓血管の血行動態と機能およびベースラインでマウス出生前の低酸素ストレス応答の詳細な包括的な表現型特性の高い超音波の可能性を実証します。

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プロトコル

このプロトコルに示すようにすべてのプロシージャを承認したは、カリフォルニア大学、ロサンゼルス、動物のケアおよび使用委員会。[アクティブな動物プロトコル制度動物ケアおよび使用委員会のカリフォルニア大学、ロスアンジェルス、カリフォルニア、米国によって承認された進行中の研究の一環として実験を行った。動物の処理とケアは、ケアと実験動物の使用のためガイドの基準を続いた。

1. 高周波超音波撮像システムの準備

  1. 超音波イメージング システムと生理学の監視ユニットを入れます。
  2. 30/45 MHz の探触子を接続します。
  3. イメージング プラットフォーム近くそのホルダーに対応するスキャン ヘッドを配置します。
  4. 心臓の測定プログラムオプションを選択します。
  5. 超音波ゲル逆さまの 37 ° C に設定済み温暖化コンテナー内の場所
  6. 麻酔の適切なチューブ システムを確認し、酸素とイソフルランのレベルを確認します。
  7. イメージング プラットフォームと作業領域を消毒します。
  8. 一定の体温を維持するために画像処理プラットフォームの熱レベルとダムの心拍数を設定します。

2. 妊娠マウスの作製

  1. 麻酔誘導室で妊娠マウス (C57/BL6) ダムの場所。
  2. 継続的に 100% 酸素 (100% O2) 誘導室 200 mL/min の流量で混合吸入イソフルラン (イソフルラン 2%-3%) を配信を使用して麻酔を誘導します。
  3. 仰臥位でイメージング プラットフォームに鎮静の動物を転送します。
  4. 定常状態の鎮静麻酔チューブ システム提供イソフルラン (1.0%-1.5%) に接続されているフェイス マスクを使用して混合 100 %200 mL/分で O2を提供します。
    注意: は、キャニスター セットを含む木炭フィルター搭載換気システムを用いた麻酔ガスの漏洩を制御します。
  5. 母体の心臓と呼吸率の常時監視を達成するために電極のゲルの塗布後埋め込み心電図電極に優しく手足をテープします。
  6. (450 ± 50 拍/分 (bpm)) の平均心拍数を維持するためにイソフルランのレベルを調整します。
  7. ± 0.5 ° C 37.0 ° C の範囲内で体温を維持します。体温と生理コント ローラー ユニットに表示される心拍数を監視します。
  8. 鎮静マウス イメージング プロシージャ全体で 15 分毎のバイタル サインを文書化します。
  9. マウスの姿勢、心拍数、つまみをつま先への応答を評価することによって麻酔のレベルを評価します。
  10. 目の乾燥や角膜の損傷を防ぐために眼クリーム (それぞれの目に 1 滴) を適用します。
  11. 超音波減衰を最小限に抑えるために脱毛クリームを使用して下肢に半ば胸のレベルからの毛皮を削除します。ウェットとドライのガーゼを交互にアプリケーションが皮膚に損傷を防ぐためワイプ後クリーム 1 〜 1.5 分間を削除します。

3. 胚識別

  1. 胎児を検索しそれらを広げて優しく腹壁を触診します。
  2. ダムの腹部にそれぞれの胚に注釈を付けるし、マーカーを使用して、その前後と背腹軸方向を定義します。
  3. ランドマークとして鎮静のダムの子宮頸部を使用します。L1, L2, L 3 として左と右子宮角に胎児をラベル等(左側) と R1、R2、R3、等(右側にある)、それぞれ (図 1 a)。
    注意: は、胎児を強制的に感染を避けるため。各くずの 1-2 胎児は、他の信頼性の低い自分のポジショニングとイメージングを作ると重なる可能性があります。これらの胎児を分析から除外します。

4. 胎児心臓の可視化と注釈

  1. 腹部に予め温めておいた超音波ゲルを適用し、気泡を避けるために注意深くそれを広めます。スキャン画像の領域に追加のジェルの量を追加します。
  2. その機械のホルダーに超音波プローブを配置し、スキャン B モード (図 1) を使用して心臓の鼓動を探しながら厚いゲル層と接触する皮膚に向かって徐々 にそれを動員します。
  3. 2 D イメージを取得するスキャンB モードボタンをクリックします。ランドマークとして、膀胱を使用して右または左子宮角に配置最初胎児を識別し、それぞれ R1 か L1 としてそれをマークします。
  4. リアルタイムで個々 の胎児の左右の向きを確認するには、水平面内イメージング プラットフォームを移動します。(図 1 bビデオ 1) のランドマークとしての鼻、手足と背骨に注釈を付けるための尾に頭からスキャンします。
  5. 心臓の鼓動を視覚化し、左心室 (LV)、右心室 (RV) に注釈を付けます。心の可視化を最適化するために使用色ドップラー モード (図 1 C Gビデオ 1-2)。
  6. 旁短い軸のビューを取得するスキャンB モードボタンをクリックして LV と RV データ集録フレームの中央に、最大径表示があります。ライブ イメージング (図 1 b・ C) を開始します。
  7. 縦 4 部屋ビュー (図 1) を取得する平面をスキャンに関して、マウスの方向を変更します。まず、心房、心室中隔、左と右の流出管など心の残りの構造を識別します。次に、その最大径表示心室と心房のチャンバーを持っています。画像取得を開始します。
  8. 最終的な分析から最適ではない、斜めの画像を除外します。最低 10 の連続記録 'Cineloops' を取得するチーニボタンをクリックして s、記録された画像を保存します。

5. 胎児の心拍数と心機能の評価

  1. 4 室内機 (動画 3) から心臓の画像を取得するスキャンM モードボタンをクリックします。
  2. すべての胚の画像が完了したら、解析のための録音の一覧を表示します。
  3. 最終的な分析から最適ではない、斜めの画像を除外します。
  4. 壁厚を測定し、拡張期 (LVID、d 項の権限で右/左心室内径分析ボタンをクリックします。RVID、d) と収縮 (LVID、s;RVID、s)、図 2に示すように。
  5. それぞれを再生することにより平均胎児心拍数記録 M モード トレース、次のフローを 1 つのフロー サイクルの測定の計算サイクル (隣接したピーク間の間隔) を決定します。
  6. 平均心拍数 (図 2) を取得する複数の測定値 (少なくともトレースあたり 5) を実行します。
  7. 左心室内部拡張期径 (LVID、d) と心臓サイクル時間 (LVID, s) で左心室内径の変化を測定します。小数短縮率 (FS %) を次のように計算: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID、d] x100。
  8. FS % の平均値を取得する複数の測定値 (少なくともトレースあたり 5) を実行します。

6. 心肺フロー パラメーターの評価

  1. 60 未満o買収の角度でセクターを調整します。ドップラーボタンで 45 MHz の探触子を使用して、2 D 4 商工会議所イメージング平面からパルス波ドップラー測定を実行するをクリックします。
    1. まず、右の流出路を識別するために肺動脈の分岐を視覚化します。次に、パルス波ドップラーボタン (図 3 aビデオ 4) 大動脈弁、肺およびを介してフロー パターンを取得するをクリックします。
  2. パルス波ドップラー トレース、収縮期波 (PkV)、(AT) の加速時間駆出時間 (ET) などからの肺血流測定を取得します。
  3. (右)図 3 aに示すように平均測定値を取得する複数の測定値 (少なくともトレースあたり 5) を実行します。
  4. AT を計算/各エ比流出管開存性の指標としてバルブを流出し、血流。
  5. パルス波ドップラーを使用して 2 D 頂 4 室ビューから僧帽弁と大動脈弁の流れパターンの取得に進んでください。まず、左心房と左心室のチャンバーを識別します。次に、(A) (図 3 b)24,25僧帽弁流入ドプラ パターンと測定拡張早期波 (E) と心房収縮速度の記録するためパルス波ドップラー サンプル ボリュームを配置します。
  6. 大動脈のドップラー ジェット パターンを取得するドップラー サンプル ボリュームを調整します。大動脈ドップラー jet (右)図 3 bに示すように、(で) 時間と駆出時間 (ET) の加速度を測定するため (動画 5) を使用します。

7. 胎盤の軸の評価

  1. 45 MHz 探触子 (図 4 a) を使用して、子宮動脈および胎児胎盤血管ツリーを視覚化色ドップラー スキャンを使用します。
  2. 胎児の腹部からコードが終了する直後に臍帯、羊水内のセグメントの膀帯血管 (2 つの動脈と静脈の 1 つ) を識別します。
  3. 場所パルス波ドップラー サンプル ボリューム臍動脈の流れパターン (図 4 a) を取得します。
  4. (AT)、駆出時間 (ET)、加速時間を含む血管ピーク フロー パラメーターを測定し、ピークの時間 (PkV, s) の流速パルス波ドップラー スキャン レコード (図 4 b) を使用します。
  5. 胎動や母体の呼吸運動、各容器の平均ピーク速度を測定するの不在で、各船で 5 連続波形を取得します。
  6. 次の胚に進みます。

8. イメージ作成後動物の監視

  1. イメージング プロセスの完了に続くイソフルラン コンテナーをオフにします。
  2. 回復期の体温、呼吸数、心拍数の監視を続けます。
  3. ダムが自発的な動きを始めたら、フェイス マスクと接続チューブ システムを削除します。
  4. 適切なハウジングにダムを戻り、標準機関ポスト プロシージャ プロトコルに従って観察を続けます。
  5. 通常の活動の完全復旧に時間を文書化します。

9. パフォーマンス要件および技術的な考慮事項

  1. バイタル サインの生理学的パラメーターの長時間の麻酔の副作用を避けるために約 1 h 〜 8 胎児の処理の時間を制限します。
  2. 画像集録およびフロー パターンの短いタイム フレームでトレースの技術を最適化するために 8-10 妊娠マウス トレーニングを完了します。

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結果

オフライン心・血行動態の指標の統計的解析を行った。3 つの最適な画像で 5 連続測定の手段を求めた。データは ± SEM. スチューデントのtの意味と表現された-テストは、集団間比較を推論に使用されました。0.05 のP値が統計的に有意と考えられました。

上記プロトコルに従って我々 はで C57/BL6 タイミング妊...

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ディスカッション

心血管系奇形や疾患は、遺伝的要因と環境要素19に影響されて大幅に。我々 は以前、胎児胎盤循環流と胎児心機能92 番目の妊娠中に開始、母体のカロリー制限の大きな影響を実証しました。

出生前の低酸素は、途方もなく胎盤の生理学、循環系に影響を与えるかもしれない胎児の発育中にもう一つ一般的なストレス要因です。出生前?...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

テクニカル サポートと Vevo 2100 超音波生体顕微鏡 (UBM) システムへのオープン アクセスを提供するため ucla 医学部動物生理学コアに感謝いたします。この研究に支えられた今日と明日こども基金は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校-子供のディスカバリー研究所 NIH/小児保健研究センター (5K12HD034610/K12) と m. 当麻にデイヴィッド ・ ゲフィン医学学校の研究イノベーション賞を受賞。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Vevo 2100VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaN/AHigh Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)Charles River LaboratoriesN/AInbread wild type mouse strain

参考文献

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