Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)

Резюме

ВЧ-УЗИ плода мыши улучшилась разрешающей и может предоставить точные неинвазивные характеристика сердца развития и структурных дефектов. Протокола, изложенные в настоящем документе предназначен для выполнения в реальном времени плода мышей эхокардиография в естественных условиях.

Аннотация

Врожденных пороков сердца (ХПК) являются наиболее распространенной причиной детской заболеваемости и смертности, рано. Дородовой выявление основных молекулярных механизмов ХПК имеет решающее значение для изобретать новые профилактические и терапевтические стратегии. Мутант мыши модели являются мощными инструментами для себя новые механизмы и экологического стресса модификаторы, которые управляют сердца развития и их потенциальные изменения в ХПК. Однако усилия для установления причинно-следственных связей этих предполагаемых участников были ограничивается гистологические и молекулярных исследований в не выживание экспериментов на животных, в котором мониторинг ключевых физиологические и гемодинамических параметров часто отсутствует. Живой Тепловизионная технология стала важным инструментом для установления этиологии ХПК. В частности, УЗИ может использоваться пренатально без хирургическим путем разоблачения плодов, позволяя поддержание их базовых физиологии при мониторинге воздействия экологического стресса на гемодинамики и структурных аспектов сердечной камеры развития. Здесь мы используем систему высокочастотный ультразвук (30/45) для изучения сердечно-сосудистой системы плода мышей на E18.5 в утробе матери на базовой линии и в ответ на экспозиции дородовой гипоксии. Мы продемонстрируем возможности системы для измерения размер камеры сердца, морфология, функции желудочка, ЧСС плода и пуповинной артерии потока индексов и их изменения плода мышей в системных хронической гипоксии в утробе матери в реальном время.

Введение

Врожденные пороки сердца – разнородных структурных дефектов, возникших в процессе раннего развития сердечной. Современные технические достижения оперативных процедур привели к значительным улучшениям в выживаемости новорожденных с ХПК^1,2. Однако качество жизни часто является ослабленной средней длительной госпитализации и потребностям для устроили хирургического процедуры^1,2,3,,45. Дородовой выявление основных молекулярных механизмов ХПК имеет решающее значение для того, чтобы план раннего вмешательства, осуществлять новые стратегии предупреждения и для улучшения жизни результаты^6,7.

Хотя несколько генетических и экологических факторов были вовлечены в патогенез ХПК, установление причинно-следственная связь остается неудовлетворенный улучшить диагностические, терапевтические и превентивные стратегии^{1,8,9 ,10,,1112}. Кроме того изучение роли в утробе матери факторов стресса и эпигеномные модификаторы открывает новые центры для будущих расследований^11,12. В последнее десятилетие действительно стали свидетелями стремительного прогресса в технологии следующего поколения последовательности включая microarray Однонуклеотидный полиморфизм единичных нуклеотидных, весь exome последовательности и исследования генома общесистемной метилирования дна, их использование в изучении генетического причины сложных заболеваний человека, включая ХПК^1,8,9,10,11 почву для выявления новых мутаций и генетические варианты, которые еще не были проверены на их патогенности в подходящих животных моделях.

Среди различных заболеваний модели систем мышь является животных модель выбора, не только для изучения механизмов ХПК во время ранних cardiogenesis^13,14,,1516, но и для выяснения их влияние на сердечной камеры созревания и функции в конце беременности в дородовой период и перинатальных факторов стресса. Следовательно, выполнение в vivo фенотипические характеристики мутант плода мыши сердца, ранних и поздних стадиях развития, важно понять роль этих генетических вариаций и экологических факторов на развитие сердечной, и потенциального будущего воздействия на камеры созревания и конкретных процессов в мышей.

Раннее обнаружение и точная диагностика пороков сердца во время разработки имеет решающее значение для интервенционных планирования^17,18. Будучи безопасной, простой, портативные и повторяемости, УЗИ плода действительно стал стандартом изображений техника для сердца оценки в клинике. Плода циркуляции оценки с использованием ультразвуковой допплерографии широко используется в клинической практике не только для обнаружения пороков сердца, но и для выявления сосудистых патологий, недостаточности плаценты и Внутриутробное ограничение роста и для оценки плода благополучия в ответ на оскорбления в утробе матери включая гипоксемия, материнской заболеваемости и наркотиков токсичности^17,18. Параллельно с его значение в оценке человека дефектов и болезней оценки УЗИ плода мышей получила повышение полезности в экспериментальной параметры^{19,20,21,22, 23}. В частности УЗИ сердца плода (эхокардиография) позволяет последовательно в vivo визуализации развивающихся сердца. Многие экспериментальные исследования использовали УЗИ технологии для наблюдения за развитие плода сердечно-сосудистой системы у трансгенных мышей плода. Ультразвуковая допплерография оказалась особенно полезной для выяснения патофизиологические параметры, такие как шаблоны потока в плода циркуляции при физиологических проблем или болезней условия^10,19. В организме человека и животных ненормальное потока или кислорода кровоснабжение плода может быть результатом различных условий, которые могут нарушить среды плода в утробе матери и влияют на оси фетоплацентарной, включая плацентарных аномалии, материнской гипоксии, гестационный диабет и фармацевтически индуцированных сужение сосудов^15,22. Таким образом создание стандартизированных методов для выполнения Допплер УЗИ плода мышей будет чрезвычайно возможностей будущих исследований ХПК путем облегчения мониторинга потока моделей и ключевых гемодинамических показателей сердечно цепей во время различных этапах сердечной развития в генетических мыши модели.

Высокая частота ультразвуковых стала мощным инструментом для измерения развития и физиологических параметров сердечно-сосудистой системы в модели мыши и заболеваний человека¹⁸. Эта технология были уточнены в последние годы. Мы и другие исследователи продемонстрировали возможности этой системы для проведения ультравысокой частоты ультразвуковых исследований плода мыши сердце^{15,19,20,21,22 ,23}. Система оснащена Doppler цвет потока картирования и линейного массива преобразователей, которые генерируют двумерных, динамических изображений с частотой кадров, высокой частоты (30-50 МГц). Эти преимущества, по сравнению с низкой частоты ультразвуковых систем и предыдущего поколения высокой частоты ультразвука^21,22, обеспечивают необходимую чувствительность и разрешение для углубленной оценки плода кровообращения системы, включая всеобъемлющее характеристика сердце структур, функции камеры и индексов поток плода мышей в экспериментальных условиях. Здесь мы наметим методы для выполнения быстрой оценки кардиопульмональной циркуляции и Фето плацентарного кровообращения в эмбриональных день E18.5 в естественных условиях , используя систему высокой частоты. Мы выбрали 30/45 МГц датчик, который обеспечивает осевой разрешение примерно 60 мкм и латеральное разрешение 150 мкм. Однако высокий частотный преобразователь (40/50 МГц) могут быть выбраны для анализа ранее этапах своего развития, следуя аналогичный методологический подход. M-режим позволяет визуализацию тканей в движении на уровнях высокого временного разрешения (1000 кадров в секунду). Наконец мы продемонстрировать возможности высокой УЗИ для подробного всеобъемлющего фенотипические характеристики плода сердечно гемодинамических статус и функции в мышей на базовом и в ответ на стресс дородовой гипоксии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, животное уход и использование Комитет одобрил все процедуры, показаны в этом протоколе. Эксперименты были проведены в рамках продолжающегося исследования под активных животных протоколов, одобренных институциональных животное уход и использование комитета университета Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния, США. Животных обработки и ухода за стандартов руководства для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка высокой частоты ультразвуковых изображений системы

1. Включите ультразвуковой системы визуализации и мониторинга блок физиологии.
2. Подключение датчика 30/45 МГц.
3. Поместите головку соответствующего сканирования на держателе рядом платформа отображения информации.
4. Выберите параметр Сердца программы измерения .
5. Место, УЗИ гель вниз головой в его предварительно потепления контейнера, равным 37 ° C.
6. Проверьте соответствующие трубы системы для анестезии и уровень кислорода и изофлюрановая.
7. Продезинфицируйте платформа отображения информации и рабочей области.
8. Установите уровень жары изображений платформы для поддержания температуры тела на постоянной и сердечного ритма плотин.

2. Беременные мыши подготовка

1. Место беременной мышь (C57/BL6) плотины в камере индукции анестезии.
2. Вызвать обезболивание с помощью непрерывно доставки ингаляционных изофлюрановая (изофлюрановая 2% - 3%), смешанного с 100% кислорода (100% O₂) со скоростью потока 200 мл/мин в зале индукции.
3. Передача седативных животных на платформу обработки изображений в лежачем положении.
4. Обеспечивают установившегося седативный эффект, используя маску подключен к изофлюрановая системы доставки трубки анестезии (1,0-1,5%) смешивается с 100% O₂ 200 мл/мин.
   Предупреждение: Контроль утечки анестезирующий газ с помощью системы вентиляции с угольный фильтр, содержащий набор канистру.
5. Лента конечностей мягко для встраиваемых электрокардиографические электродов после нанесения геля электрода для достижения постоянного мониторинга материнской сердечной и дыхательной ставок.
6. Отрегулируйте уровень изофлюрановая поддерживать средний сердечный ритм (450 + /-50 ударов в минуту (bpm)).
7. Поддерживать температуру тела в диапазоне 37.0 ° C +/-0.5 ° C. Контролировать температуру тела и частоты сердечных сокращений, отображаемого на блок контроллера физиологии.
8. Документ жизненно важные признаки седативных мыши каждые 15 мин на протяжении всей процедуры обработки изображений.
9. Оцените уровень анестезии, оценивая мыши осанки, сердечного ритма и ответ на носок щепотки.
10. Применить офтальмологический бальзам (по 1 капле в каждый глаз) чтобы предотвратить сухость глаз и повреждение роговицы.
11. Удаление мех от середины груди уровня для нижних конечностей с помощью депиляционный крем для сведения к минимуму затухания ультразвука. После приложения путем чередования мокрой и сухой марлевой салфетки для предотвращения повреждения кожи, удалите крем 1-1,5 мин.

3. эмбриона идентификации

1. Ощупывайте брюшной стенки осторожно, чтобы найти плод и разложил их.
2. Аннотации каждого эмбриона на животе плотины и определить их передней задней и спинной вентральный ориентации с помощью маркера.
3. Используйте шейки матки седативных плотины как ориентир. Ярлык плодов на левой и правой маточные рожки L1, L2, L 3, и т.д. (слева) и R1, R2, R3, и т.д. (справа), соответственно (рис. 1A).
   Предупреждение: Во избежание распространения плодов насильственно. 1-2 плодов в каждом помете могут перекрываться с другими, делая их позиционирования и изображений ненадежными. Исключите из анализа этих плодов.

4. плода сердце визуализации и аннотации

1. Нанесите гель подогретым УЗИ на животе и распространение его тщательно, чтобы избежать формирования пузыря. Добавьте дополнительное количество геля на области сканирования изображений.
2. Место ультразвуковой зонд на держателе механических и мобилизовать его постепенно к коже, чтобы связаться с слоем густой гель глядя на биение сердца с помощью B-режим сканирования (рис. 1).
3. Нажмите кнопку B режим сканирования для получения изображения 2-D. Используйте мочевого пузыря как ориентир для определения первого плода, дислоцированные в правом или левом рога матки и пометить его как R1 или L1, соответственно.
4. Подтвердите правой и левой ориентации отдельных плода в реальном времени, движущихся изображений платформы в горизонтальной плоскости. Сканирования от головы до хвоста для аннотирования морду, конечностей и позвоночника как ориентиры (рис. 1B, 1 видео).
5. Визуализировать бьющееся сердце и аннотировать левого желудочка (LV) и правого желудочка (RV). Использование цветовой Допплер режим оптимизировать визуализацию сердца (рис. 1 C-G, видео 1 - 2).
6. Нажмите кнопку B режим сканирования для получения парастернальной короткой оси представление, LV и RV, отображаемые в их максимальный диаметр в центре кадра приобретение данных. Начните жить изображения (рис. 1B-C).
7. Измените ориентацию мыши относительно проверки плоскости для получения продольной четырехкамерные вид (рис. 1 d). Во-первых Определите оставшиеся структур сердца как предсердия, межжелудочковой перегородки и левый и правый отток участки. Далее имеют предсердий и желудочков камер, отображаемые в их максимальный диаметр. Затем начните получение изображения.
8. Исключите неоптимальным, наклонный изображения из окончательного анализа. Нажмите кнопку Чини для получения непрерывной записи «Cineloops» для минимум 10 сек, затем сохранить записанные изображения.

5. Оценка сердечных сокращений плода и функции желудочка

1. Нажмите кнопку M-режим сканирования для получения сердечной изображения из четырех плоскостей камеры (3 видео).
2. Просмотр списка записей для анализа после завершения изображения всех эмбрионов.
3. Исключите неоптимальным, наклонный изображения из окончательного анализа.
4. Нажмите кнопку анализ для измерения толщины стенок и левого/правого желудочка внутренний диаметр на диастола (LVID, d; RVID, d) и Систола (LVID, s; RVID, s), как показано на рисунке 2.
5. Определите, что средняя ЧСС плода, играя друг записан M-режим трассировки и расчета измерения одного потока цикла в следующем поток цикла (расстояние между соседними пиками).
6. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения средней частоты сердечных сокращений (рис. 2).
7. Измерьте временных изменений между левого желудочка внутренний диаметр диастолического (LVID, d) и левого желудочка внутренний диаметр в конце систолы (LVID, s) на протяжении всего сердечного цикла. Затем рассчитать дробных шортинга процент (FS %) следующим образом: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
8. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения среднего значения % FS.

6. Оценка параметров сердечно-легочными потока

1. Отрегулируйте сектора на угол приобретения менее 60^o. Нажмите кнопку Доплера для выполнения импульсной волны доплеровского измерения от плоскости 2-D четыре камеры изображений с помощью преобразователя 45-МГц.
   1. Во-первых Визуализируйте бифуркации легочной артерии определить правильный отток тракта. Затем нажмите кнопку импульсного волна Doppler чтобы получить шаблон потока через легочной и аортального клапанов (рис. 3A, видео 4).
2. Получения легких расходометрии от импульсной волны Doppler трассировки, включая пиковой систолической скорости (ПКВ), ускорение времени (AT) и выброса время (ET).
3. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения среднего измерения, как показано на рисунке 3A (справа).
4. Рассчитать AT / ET коэффициент для каждого утечка клапан как показатель проходимости участки отток и приток крови.
5. Перейти к получить шаблоны митрального и аортального потока от апикального четыре камеры 2-D представлений с помощью импульсной волны Doppler. Во-первых определите левого предсердий и левого желудочков камер. Далее поместите объем Doppler образца импульсной волны для записи шаблонов митрального приток Doppler и измерения ранней диастолической скорости (E) и скорость сокращения предсердий () (рис. 3B)^24,25.
6. Регулировка громкости Доплера образец, чтобы получить шаблон аорты Doppler струи. Использовать аорты Doppler jet трассировки для измерения ускорения (AT) и выброса время (ET), как показано на рисунке 3B (справа) (5 видео)

7. Оценка фето плацентарной оси

1. Используйте цвет доплеровского сканирования для визуализации маточной артерии и фето плацентарной сосудистой дерево с помощью преобразователя 45 МГц (рис. 4A).
2. Идентифицировать пупочных сосудов (две артерии и один вен) в сегменте интраамниальной пуповины, только после того, как шнур выходит из брюшной полости плода.
3. Место импульсной волны объем Doppler образца для получения картина течения пуповинной артерии (рис. 4A).
4. Измерения параметров потока сосудистой пик, включая ускорение времени (время), выброса (ET), и пиковой скорости потока в конце систолы (ПКВ, s) с помощью импульсной волны доплеровского сканирования запись (рис. 4В).
5. Получите 5 последовательных сигналов на каждом судне, в отсутствие движений плода и матери дыхательных движений, чтобы измерить скорость средняя пик для каждого судна.
6. Перейти к следующему эмбриона.

8. После обработки изображений животных мониторинг

1. Выключите изофлюрановая контейнера после завершения процесса визуализации.
2. Продолжить мониторинг температуры тела, частоты дыхания и пульса на этапе восстановления.
3. Удалите маску и подключенных труб системы после того, как плотина начинает спонтанных движений.
4. Возвращение плотины в надлежащее жилье и продолжить наблюдение согласно стандартных институциональных протоколов после процедуры.
5. Документ время полное возобновление нормальной деятельности.

9. эксплуатационные требования и технические соображения

1. Ограничьте время обработки ~ 8 плодов до примерно 1 ч. чтобы избежать неблагоприятных последствий длительной анестезии на жизненно важные признаки и физиологических параметров.
2. Полное обучение с 8-10 беременных мышей для оптимизации методов для изображения моделей приобретения и потока трассировки в короткие сроки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Статистический анализ сердечной и гемодинамических показателей были выполняемых в автономном режиме. Средства 5 последовательных измерений в 3 оптимального изображения были рассчитаны. Данные были высказаны как означает ± SEM. студент t-тест был использован для в?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Сердечно-сосудистые пороки развития и заболевания существенно влиянием генетических факторов и элементов окружающей среды¹⁹. Ранее мы продемонстрировали значительное влияние матери ограничение калорий, начато во втором триместре, фето плацентарного кровообращения пото...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada	N/A	High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Inbread wild type mouse strain