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Resumen

Este método describe la colocación de injertos de interposición de la vena en conejos, la transducción de los injertos y el logro de la expresión del transgen resistente. Esto permite la investigación de funciones fisiológicas y patológicas de los transgenes y sus productos proteicos en las venas injertadas y pruebas de terapias genéticas para la enfermedad de injerto de vena.

Resumen

Cirugía de bypass de vena del injerto es un tratamiento común para la enfermedad arterial oclusiva; sin embargo, el éxito a largo plazo está limitada por la falta del injerto por trombosis, hiperplasia intimal y aterosclerosis. El objetivo de este artículo es demostrar un método para colocar injertos de interposición venosa bilateral en un conejo, luego transducing los injertos con un vector de transferencia génica que alcanza expresión transgen resistente. El método permite la investigación de las funciones biológicas de los genes y sus productos de proteína en la homeostasis de injerto de vena normal. También permite la prueba de transgenes para las actividades que podrían evitar el fracaso del injerto de vena, por ejemplo., si la expresión de un transgen previene el crecimiento neointimal, reduce la inflamación vascular y reduce la aterosclerosis en conejos alimentados con una dieta alta en grasas. Durante una cirugía inicial de supervivencia, los segmentos de la vena yugular externa izquierda y derecha son suprimidos y colocados bilateralmente como invertida fin-a-lado de la arteria carótida común interposición injertos. Durante una segunda cirugía de supervivencia, realizada 28 días después, cada uno de los injertos es aislado de la circulación con clips vasculares y los lúmenes están llenos (a través de una arteriotomía) con una solución que contiene un vector adenoviral de (HDAd) dependiente de la ayuda. Después de una incubación de 20 min, se aspira la solución del vector, se repara la arteriotomía y se restaura el flujo. Las venas son cosechadas en momentos de protocolos experimentales individuales. El retraso de 28 días entre la colocación del injerto y la transducción de señales es necesario para asegurar la adaptación del injerto de la vena a la circulación arterial. Esta adaptación evita la rápida pérdida de transgene expresión que ocurre en injertos de vena transduced antes o inmediatamente después de injertar. El método es único en su capacidad para lograr la expresión del transgen durable, estable en las venas injertadas. En comparación con otros modelos de injerto de vena de animal grande, los conejos tienen ventajas de bajo costo y fácil manejo. En comparación con modelos de injerto de vena roedores, los conejos tienen vasos más grandes y más fácil de manipular que proporcionan abundante tejido para análisis.

Introducción

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica en la que acumulación del lípido y la inflamación en la pared de los vasos sanguíneos conducen a estrechamiento del lumen del vaso, ataques cardíacos, trazos y pérdida de extremidades1,2. Intervenciones percutáneas (por ej., angioplastia y stenting) y terapia médica (e.g., agentes estatinas y antiagregantes) son tratamientos útiles para la ateroesclerosis; sin embargo, a menudo son ineficaces en el tratamiento de enfermedad obstructiva severa tanto en las circulaciones coronarias y periféricas. Injertos de derivación, con segmentos de vena autógena, sigue siendo un procedimiento común para el tratamiento de pacientes con enfermedad vascular periférica y coronaria severa, difusa3,4. Sin embargo, la vena injertos colocados en ambos la coronaria y circulaciones periféricas tienen pobres tasas de permeabilidad a largo plazo. En la circulación coronaria, aproximadamente 10-20% de los injertos se ocluyen en 1 año y 50% de la vena se ocluyen por 10 años5,6. En la circulación periférica, las tasas de fracaso del injerto de la vena son 30-50% en 5 años7.

La terapia génica es un método atractivo para la prevención de fracaso del injerto de vena porque puede entregar un producto del gene terapéutico precisamente en el sitio de la enfermedad. En consecuencia, numerosos estudios preclínicos han probado la vena del injerto gene terapia8,9. Sin embargo, esencialmente todos estos estudios han examinado la eficacia en el temprano tiempo puntos (2-12 semanas)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. somos conscientes de ninguna evidencia de que intervenciones de terapia del gene pueden proporcionar una duradera protección (años) contra el último fracaso del injerto de vena que típicamente resulta de neointimal hiperplasia y aterosclerosis4. Hemos desarrollado un método que permite la expresión del transgen durable en las venas injertadas y así permite la prueba de las intervenciones de terapia génica en momentos finales y principios. Para lograr la expresión del transgen durable, el método incorpora HDAd vectores y una estrategia de transducción retrasada. Vectores de HDAd proporcionan expresión transgénica prolongada porque carecen de genes virales, evitar el reconocimiento y rechazo de células transduced por el sistema inmune18,19,20, 21. transducción retrasado (realizadas 28 días después de la colocación de un injerto) previene la pérdida de células transduced durante el proceso de arterialización que ocurre pronto después del injerto22.

Otros métodos que alcanzan expresión transgen terapéutico en la pared de la vena del injerto se basan en la transducción del injerto de vena en el momento del injerto colocación10,11,12,15,16 ,17. Cuando se mide en serie, expresión del transgen mediante este enfoque declina rápidamente después de la transducción de la22,23. Por consiguiente, desde este enfoque los estudios no han examinado la eficacia más allá de 12 semanas tras el injerto de vena, con más no evaluaban eficacia más allá de 4 semanas. En cambio, nuestro método logra injerto vena transgene expresión que persiste estable durante al menos 24 semanas y basados en estudios similares realizados en arterias probablemente continúa mucho más de22,24. Somos conscientes de ninguna otra vena injerto gene terapia intervención que alcanza expresión del transgén estable de esta duración.

Hemos utilizado un modelo de conejo para desarrollar nuestro método. Otros han utilizado roedores, conejos o animales más grandes para poner a prueba la vena del injerto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. En comparación con modelos de roedores, los conejos son más caros y están sujetos a requisitos regulatorios más estrictos. Sin embargo, en comparación con los animales más grandes (por ej., cerdos y perros), los conejos son mucho menos caros de comprar y de la casa y mucho más fácil de manejar. Por otra parte, buques de conejo se asemejan a los vasos humanos fisiológicamente27, son lo suficientemente grandes que pueden ser utilizados para las pruebas de intervencionismo percutáneo28,29, y proporcionan suficiente tejido que múltiples criterios de valoración (e.g., histología, RNA de la proteína) puede ser examinado usando un solo vaso sanguíneo muestra22,30. Además, cuando los conejos con injertos venosos son alimentados con una dieta alta en grasas, se convierten de la vena del injerto aterosclerosis31,32, que es una causa común de la arteria coronaria bypass vena del injerto fracaso4,5 . Estos injertos de vena de conejo aterosclerótica pueden servir como sustrato para las intervenciones de terapia génica con este método de prueba. El protocolo siempre puede ayudar a los investigadores a dominar las habilidades técnicas necesarias para lograr la expresión del transgen durable en injertos de vena de conejo.

Protocolo

Todos los protocolos de animales y los estudios fueron aprobados por la Universidad de Washington oficina de bienestar de los animales.

1. antes de la operación (para todas las cirugías)

  1. Anestesiar al conejo con 30 mg/kg ketamina y 1,5 mg/kg xilacina por inyección intramuscular (IM) en los músculos paraspinous.
    Nota: Los alimentos y el agua no se limitan antes de la cirugía.
  2. Espera de suficiente profundidad de la anestesia, configurar las tablas de la sala de preparación y la sala de operaciones (OR).
    1. Preparar la sala de preparación para afeitar el cuello del conejo y la colocación del puerto vía intravenosa (IV) en el oído (sólo cirugía de supervivencia). Coloque el ungüento oftálmico, parche de fentanilo (cirugía de supervivencia), cortapelos, almohadilla de preparación alcohol, 24 G x ¾" catéter, Puerto de inyección y cinta quirúrgica sobre la mesa de preparación.
    2. En la o, el equipo de monitoreo y asociados sondas (electrocardiograma (ECG), oximetría de pulso (SpO2) y la temperatura). Preparación de la bomba IV con una bolsa de IV salina de 100 mL con una aguja de 18 G o 19 G y fijar el caudal como 10 mL/h/kg (sólo cirugía de supervivencia). Configurar el equipo de oxígeno e isoflurano con una ojiva (vena cirugías de injerto o de la cosecha).
      1. Para ayudar a asegurar la nariz a los conejos, enrolle una tira de gasa alrededor del tubo que suministra gas a la nariz. Este bucle debe rodear el tubo donde se conecta a la nariz. Los extremos libres de la franja de Gasa ambos deben ser aproximadamente 45 cm de largo. Poner la nariz (con una gasa atada) en la cabecera de la mesa.
    3. Encienda el agua circulante o manta sobre la mesa OR de calentamiento de aire forzado. En la cobija, coloque una toalla enrollada como un soporte de cuello y coloque la placa de electrodo dispersivo de electrocauterización.
    4. Como un analgésico local, combinar en una jeringa de 1 mL de lidocaína HCl al 2% y 1 mL de bupivacaína 0.5% HCl. diluir el virus a la concentración deseada (aquí, utilice 2 x 1011 partículas virales/mL para la HDAd) en DMEM estéril y mantener en hielo (sólo cirugía de transferencia de genes).
    5. Después de alcanza una adecuada profundidad anestésica, preparar el conejo para la cirugía.
      Nota: Para probar la falta de un reflejo pedal retirada para asegurar la adecuada profundidad anestésica. Seguir controlar el reflejo pedal a lo largo de la cirugía.
      1. Aplicar ungüento oftálmico en ojos de conejo.
      2. Para permitir la colocación de una sonda de temperatura rectal, presione con los dedos enguantados justo encima del recto y mover los dedos hacia el ano para eliminar deposiciones recto del conejo.
      3. Afeitarse el conejo de la fosa esternal hasta el borde de la mandíbula. Afeitarse un oído para la colocación de la IV y la oreja opuesta para administración de parches de fentanilo (sólo cirugía de supervivencia). Afeitarse los dedos mediados traseros izquierdos para la colocación de la sonda de SpO2 .
    6. Cirugía de infusión vector intubar el conejo. Uso un 4 mm O.D./3 mm tubo endotraqueal sin manguito de diámetro interior, roscado en un artroscopio. Coloque el conejo en recumbency esternal e hiper extender el cuello. Mantenga la boca del conejo abierto y utiliza el artroscopio para visualizar los pliegues de la glotis y laringe. Durante la inspiración, inserte suavemente el tubo endotraqueal a través de la laringe y la tráquea.
    7. Para las cirugías de sobrevivencia, lugar y asegurar un catéter IV de 24 G en vena de oreja izquierda del conejo y la tapa con un puerto de inyección. Aplicar un parche de 25 μg/h fentanilo al oído derecho del conejo.
      Nota: El protocolo es para un cirujano colocado lado derecho del conejo. Si el cirujano va a ser en el lado izquierdo del conejo, invertir los lados en este paso para guardar los cables y IV enfrente del cirujano. Cambie los lados en los futuros pasos según sea necesario.
    8. Para las cirugías de injertos y cosecha de vena, administrar anestesia general con una ojiva; para la cirugía de infusión de vector, administrar anestesia general a través de un tubo endotraqueal.
      Nota: La intubación puede utilizarse para todas las cirugías.  En nuestra experiencia, sin embargo, los riesgos de complicaciones de trauma traqueal y laríngeo durante la intubación pueden superan los beneficios de la intubación.  La cirugía que incluye transferencia de genes a un injerto (especialmente en conejos alimentados con colesterol) es la única cirugía que la intubación parece proporcionar un beneficio neto.
    9. Llevar el conejo en el OR. Coloque el conejo en una posición supina en la mesa de operaciones con la toalla de apoyo cuello colocada justo debajo de la cabeza del conejo. Extender suavemente cuello de conejo hasta que quede aproximadamente horizontal y recta.
    10. Colocar la nariz a los conejos (cirugías de injerto y cosecha de la vena) o conectar el tubo endotraqueal (vector cirugía de infusión) O2 a 1 L/min y empezar el isoflurano. Si utiliza una ojiva, asegure envolviendo los extremos de las tiras de Gasa atado alrededor de la toalla de soporte de cuello del conejo. Ajustar la concentración de isoflurano como sea necesario (normalmente 1-2%) para mantener un nivel quirúrgico de anestesia.
    11. Centro de la placa del electrodo dispersivo de electrocauterización bajo parte posterior del conejo. Inserte la sonda de temperatura rectal y aplique la SpO2 sonda y plomos EKG a los conejos.
    12. Conecte la línea IV salina al puerto del catéter en la oreja izquierda del conejo y arranque la bomba de infusión IV a 10 mL/h/kg. Después de 1 h, reducir la tasa de infusión salina a 5 mL/h/kg.
    13. Libremente, ate las patas delanteras del conejo a la mesa de operaciones como una restricción.
      Nota: Opcionalmente, una pequeña mesa de plástico puede ser colocada sobre el conejo para evitar que al cirujano de presionando el pecho, abdomen del conejo y puede provocar aspiración y reflujo gastroesofágico.
    14. Inyectar la lidocaína/bupivacaína (2 mL, mezcla 50/50, paso 1.2.4) por vía subcutánea (SQ) en el cuello a lo largo de la línea de la incisión prevista, para la anestesia local.
    15. Tener el asistente desinfectar el quirúrgico del sitio con 3 alternando peelings de gluconato de clorhexidina y isopropanol, luego rocíe el sitio con povidona-yodo. Con el scrub de cirujano, vestido y guantes, siguiendo principios asépticos.
      1. Realizar cirugías de supervivencia bajo condiciones asépticas. Tener el asistente manejar cualquier elemento no estéril, pasar asépticamente material estéril al cirujano y asépticamente los coloca en la tabla del instrumento cubierto.
      2. Tener las toallas estériles del uso cirujano aséptico manipular equipos no estériles tales como el microscopio. Tienen el cirujano use 2 x lupas quirúrgicas durante la primera mitad de la cirugía.

2. vena del injerto cirugía (supervivencia)

  1. Preparar los instrumentos y un campo estéril.
    1. Con el Asistente de abrir los paquetes estériles (un paño de tabla, un paño de papel y 6 toallas) y transferir asépticamente el contenido al cirujano.
    2. Cubra la mesa de instrumentos. Coloque el paño de papel y toallas estériles en la mesa del instrumento cubierto. Con 4 toallas, cuelgue el conejo, dejando sólo el sitio quirúrgico en el cuello expuesto. Coloque el cobertor de papel sobre el conejo. Más tarde se usará una toalla, y el último es una copia de seguridad.
    3. Con el asistente abrir el paquete de instrumentos esterilizados y pasar asépticamente la bandeja del instrumento para el cirujano. Organizar los instrumentos en la mesa de instrumentos.
    4. Tienen el asistente abrir el siguiente equipo y asépticamente pasar al cirujano o colóquela en la mesa de instrumentos: una jeringa de 1 mL, una jeringa de 3 mL, una jeringa de 20 mL, una aguja de 21 G, sutura de ácido (PGA) de poliglicólico 3-0, sutura de PGA de 5-0 , sutura del polipropileno 7-0 y un catéter IV de 24 G.
    5. Fije el cable de electrocauterio para el paño que cubre al conejo, utilizando una pinza Kantrowitz 7,25". Soltar el extremo del enchufe del cable sobre el borde de la mesa de operaciones para ser conectado a la unidad de electrocirugía y el asistente.
    6. Llene una jeringa de 20 mL con solución salina estéril de una bolsa de solución salina o vial llevó a cabo por el asistente. Utilice esta solución salina según sea necesario para evitar la deshidratación de los tejidos expuestos durante la operación.
    7. Preparar 5 mL de solución salina fisiológica heparinizada mediante la adición de 0,1 mL de heparina de 5.000 UI/mL a 5 mL de solución salina, es decir., heparina 100 UI/mL, en un pequeño tazón quirúrgico. Utilice esta solución para eliminar el injerto de arteria y vena carótido regularmente durante el procedimiento de injerto.
    8. Corte un agujero en la cortina de papel sobre el sitio quirúrgico en el cuello del conejo. Utiliza la toalla abrazaderas para sujetar las esquinas del agujero en el lugar para las toallas subyacentes.
  2. Disección vascular
    Nota: Utilice 2 lupas quirúrgicas x para ayudar con esta parte de la cirugía.
    1. Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel del cuello del conejo a las toallas con las abrazaderas de la toalla. En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera con unas tijeras grandes. Corte a través de la capa fascial diseca a lo largo de la línea media con la electrocauterización.
    2. Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo sobrepuesto a la tráquea y el músculo sternocephalic en forma de V, para exponer la arteria carótida común.
    3. Disecar cuidadosamente un segmento de 4-5 cm de la arteria carótida común y sus ramas más grandes (típicamente 1-2 por lado) de los tejidos circundantes. La disección de la base del cuello proximal hasta el cruce del nervio faríngeo se extienden distalmente. Uso silicona quirúrgica lazos para ayudar en la retracción de la arteria carótida durante la disección. Ligar las grandes ramas de la arteria carótida común con suturas de seda 5-0 antes de cortar cada rama distal.
      Nota: Tenga cuidado de no molestar el nervio vago que es paralelo a la arteria carótida común, o los pequeños nervios que cruzan sobre la arteria.
    4. Repita la disección en el lado izquierdo (paso 2.2.3).
    5. Utilice pinzas de retención de tejido para cerrar temporalmente la capa de tejido subcutáneo. Disecar la fascia superficial de la piel en el lado derecho hasta que se expone la vena yugular externa. Diseccionar un segmento de 4-5 cm de la vena yugular externa y gratuita sus ramas desde el tejido circundante, la ligadura de ramas pequeñas con las suturas de seda 5-0 antes de cortar la rama.
    6. Repita la disección en el lado izquierdo (paso 2.2.5).
    7. Inyectar heparina (150 UI/kg) en el catéter IV y enjuague con 10 mL de solución salina.
    8. Medir un segmento de 3 cm de la vena yugular externa en el lado derecho y ligar el extremo caudal del tubo con sutura de seda 5-0. Permita que las venas se llenen de sangre y luego ligar el extremo craneal del segmento de la vena. Divide el extremo craneal del segmento de vena yugular externa, lavar cuidadosamente el recipiente con suero fisiológico heparinizado (100 U/mL) usando una jeringa de 3 mL conectada a un catéter IV de 24 G. Dividir el segmento venoso en su extremo caudal. Coloque el segmento venoso en una posición estandarizada, en la que los extremos craneales y caudales son inequívocamente identificables.
  3. Injerto de vena
    1. Deje que el asistente Retire las lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico (25 X) en posición.
      Nota: El cirujano debe colgar una toalla estéril el microscopio. Esto permite al cirujano manipular el microscopio manteniendo la esterilidad.
    2. Abrazadera de la arteria carótida común derecha en cada extremo del segmento aislado con mini-mordazas, colocar la pinza craneal primero para permitir el relleno, luego colocar la abrazadera del caudal de la arteria.
    3. Cortar un 1 × 2 cm de papel rígido (disponible en envases estériles para suturas) y colóquela debajo de la arteria carótida común, para mejorar la exposición.
    4. Realizar una arteriotomía justo craneal a la abrazadera de caudal (la arteriotomía caudal). La longitud de la arteriotomía debe ser igual al diámetro del extremo craneal del segmento de la vena. Inserte la jeringa con el catéter IV a través de la arteriotomía caudal y lave el lumen de la arteria carótida con suero salino heparinizado.
    5. Sutura el extremo craneal de la vena a la arteriotomía caudal, utilizando sutura de polipropileno 7-0 con puntadas individuales (figura 1).
      1. Coloque la primera puntada para suturar el extremo caudal de la arteriotomía caudal al extremo craneal del segmento de la vena. Coloque la segunda puntada 180° desde la primera puntada, suturar el extremo craneal de la arteriotomía caudal al extremo craneal del segmento de la vena.
      2. Lugar la tercera puntada en un punto equidistante de los dos primeros puntos, en el lado lateral de la anastomosis. Lugar la cuarta puntada en el lado medial de la anastomosis, equidistante de los dos primeros puntos y frente a la tercera puntada. Coloque 4 puntadas adicionales (puntos 5-8) entre cada uno de los puntos 1-4.
      3. Realizar la arteriotomía craneal en el lado caudal del clip craneal. La distancia entre el extremo craneal de la arteriotomía craneal y el extremo caudal de la arteriotomía caudal debe ser igual a la longitud del segmento de la vena. La longitud de la arteriotomía craneal es igual al diámetro del extremo caudal del segmento de la vena.
    6. Extender la vena cranially de la anastomosis, en tendido sobre la carótida, sin introducir torceduras. Irrigue la arteria carótida y la vena con solución salina heparinizada a través de la arteriotomía craneal normal. La solución salina fluirá a través de la arteria a la vena a través de la anastomosis caudal y saldrá desde el extremo libre y unsutured de la vena. Flushing la vena también le impide girar.
    7. Sutura el extremo caudal de la vena a la arteriotomía craneal (figura 1).
      1. Coloque una primera puntada para suturar el extremo caudal de la arteriotomía craneal al caudal extremo del segmento venoso. Coloque una segunda puntada para suturar el extremo craneal de la arteriotomía craneal al caudal extremo del segmento venoso. Completar la anastomosis como se describe en el paso 2.3.5.2. Justo antes de que el último nudo se ata en la anastomosis craneal, brevemente abierta la pinza en el extremo craneal del segmento disecado de arteria carótida común, para permitir el sangrado de espalda que elimina el aire en la arteria carótida y la vena injertada. Apriete el nudo pasado.
    8. Suelte la abrazadera craneal para permitir el relleno de injerto de vena con sangre y luego suelte la abrazadera del caudal. Puede considerarse pulsaciones enérgicas en el injerto de vena. Aplicar ligera presión con una gasa seca para detener cualquier sangrado en las anastomosis.
    9. Ligar ambos extremos del segmento de la arteria carótida común que conecta a las anastomosis con una sutura de seda 3-0 y divide la carótida a medio camino entre las ligaduras (figura 1). Aplique varias gotas de la papaverina (3,5 mg/mL) a la arteria carótida junto a cada anastomosis.
    10. Inyectar heparina (75 UI/kg) en el catéter de oído IV y enjuague con 10 mL de solución salina. En estos momentos, inyecte buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) para proporcionar analgesia postoperatoria hasta que el parche de fentanilo ha proporcionado niveles plasmáticos analgésicos de fentanilo.
      Nota: Una inyección adicional de buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) puede ser necesario 6 h después de la primera inyección para mantener la analgesia hasta que fentanilo plasma alcanza una concentración terapéutica.
    11. Repetir el injerto en la parte izquierda (pasos 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. Cerrar el tejido subcutáneo con sutura de PGA de 5-0 con un patrón continuo. Cierre la piel con la sutura de PGA de 3-0 usando un patrón de Intradérmico. Enterrar los nudos en ambos extremos.
  4. Cuidado, limpieza y recuperación postoperatoria
    Nota: Deje que el conejo a recuperar de la anestesia en un entorno tranquilo y silencioso. Seguimiento del conejo continuamente para adecuada oxigenación y la temperatura corporal hasta que haya recuperado completamente.
    1. Isoflurano y oxígeno y desconecte la máquina de anestesia del conejo. Desconecte el tubo de fluido IV del conejo, pero salir del puerto de IV en la vena de la oreja de acceso emergente.
    2. El conejo en una jaula de recuperación del transporte y coloque a su lado. Proporcionar apoyo térmico con agua tibia manta (o calentamiento de aire forzado). Dar O2 espiga hasta que la SpO2 es estable.
    3. Hasta que el conejo pueda sentarse y andar en su jaula, voltear el conejo a su otro lado cada 15 minutos. Luego retire la cánula IV de oído y regresar el conejo a su jaula. Devuelva el conejo a la compañía de otros animales sólo después de recuperado de la anestesia.
    4. Deseche cualquier residuos siguientes protocolos adecuados para eliminación de residuos biopeligrosos y sostenidos.
    5. Postoperatoriamente, compruebe el conejo salud y herida quirúrgica diariamente. Administrar la buprenorfina como necesario para el dolor no gestionado por el parche de fentanilo. Retire el parche de fentanilo en día postoperatorio 3.

3. ultrasonido transcutáneo

  1. Para evaluar la permeabilidad del injerto, realizar ecografía en conejos anestesiados no 5-7 días después de la cirugía de injerto de la vena y la cirugía de transferencia de genes.
    1. Envuelva firmemente el conejo no anestesiados en una manta y colocar el conejo supina en una V-a través de veterinaria con su cuello extendido. Afeite el cuello, o si es necesario, eliminar el vello con un agente depilatorio. Aplique el gel de ultrasonido al cuello y realizar una ecografía.
      Nota: Un examen de ultrasonido se realiza también en conejos anestesiados en el momento de la cirugía de transferencia de genes y la cirugía del injerto terminal de cosecha para examinar la permeabilidad del injerto y para medir diámetro de lumen del injerto. El examen se realiza justo antes de la limpieza del cuello y se realiza de manera similar en cuanto a los conejos no anestesiados.

4. Gene transferencia cirugía realizada ~ 28 días después de la colocación de un injerto (cirugía de supervivencia)

  1. Preparar los instrumentos y el campo estéril.
    1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.3. en la cirugía de injerto de vena.
    2. Que el ayudante Abra los siguientes equipos y cualquiera asépticamente pase al cirujano o colóquela en la mesa de instrumentos: seis jeringas de 1 mL (con aguja), una jeringa de 3 mL, una jeringa de 20 mL, una aguja de 21 G, una aguja de 19 G, sutura de PGA de 3-0 , Sutura de PGA de 5-0, sutura del polipropileno 7-0, dos catéteres IV de 24 G y una sonda de flujo de sangre estéril.
    3. Siga los pasos 2.1.5-2.1.6. en la cirugía de injerto de vena.
    4. Preparar una jeringa de 1 mL con 1 mL DMEM para el injerto de la arteria y la vena se lavan y preparan dos jeringas de 1 mL con solución de antivirus (~ 0.5-0.7 injerto de vena solución mL virus). Deje que el Asistente de descongelar el virus y diluirlo en DMEM. Preparar una jeringa de 3 mL con 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mezcla 50/50, paso 1.2.4).
    5. Siga el paso 2.1.8 en la cirugía de injerto de vena.
  2. Aislamiento de injertos de la vena y arterias carótidas adyacentes
    Nota: 2 x lupas quirúrgicas debe utilizarse para esta parte.
    1. Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel abierta con abrazaderas de toalla. Aplicar 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mezcla 50/50, paso 1.2.4) al tejido subcutáneo.
    2. En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera. Con electrocauterización, corte a través de la fascia diseca a lo largo de la línea media.
    3. Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo superponer la tráquea y el músculo sternocephalic en forma de V, para exponer el injerto de vena. Aislar cuidadosamente el injerto de la vena y 1.5-2.0 cm de la arteria carótida adyacente al injerto en el lado craneal y caudal.
    4. Repita la disección a la izquierda siguiente paso 4.2.3.
  3. Medir el flujo sanguíneo en los injertos de vena.
    1. Rellenar la cavidad de la herida quirúrgica en el lado derecho con solución salina normal para permitir la transmisión de las ondas sonoras. Introducir una sonda de flujo de 2 mm perivascular (conectada a un medidor de caudal) en la solución salina en la cavidad de la herida y fijar el caudal a cero.
    2. Coloque la sonda de flujo alrededor de la arteria carótida caudal o craneal al injerto de vena. Registrar datos de la sonda de flujo con un sistema de adquisición de datos electrónicos.
    3. Repita la medición de flujo en el lado izquierdo tras paso 4.3.2.
    4. Calcular la pulsatilidad basada en tasa de flujo sistólico máximo, flujo diastólico mínimo y tasa de flujo promedio. También calcular tensión de esquileo laminar, basado en la tasa de flujo y diámetro de lumen (medido con ultrasonido transcutáneo).
  4. Infundir solución de vector en los injertos de vena
    Nota: Se utiliza un microscopio quirúrgico (16 X) según sea necesario para la punción, infusión y reparación de la arteria carótida.
    1. Con el Asistente de quitar lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico en posición. Tienen el cirujano cubra el microscopio con una toalla estéril. La toalla estéril permite al cirujano manipular el microscopio manteniendo la esterilidad.
    2. El Asistente de inyectar heparina (150 UI/kg) en el catéter IV y enjuague con solución salina.
    3. Utilizar un controlador de aguja grande para doblar la aguja de 21 G a aprox. 80° por encima del bisel (no doble el bisel; Figura 2A).
    4. Abrazadera de la arteria carótida común en cada extremo del injerto de la vena con mini-mordazas, colocar la pinza craneal primero para permitir el relleno, luego colocar el clip de caudal de la arteria. Lugar el clip caudal aproximadamente 10 mm de caudal a la anastomosis, para dejar cierto margen para la arteriotomía.
    5. Poner dos lazos de seda alrededor de la arteria justo caudal al injerto y ate un nudo simple en cada uno - sin apretarlos.
    6. La carótida caudal al injerto de punción con la aguja de 21 G doblada justo craneal del clip vascular caudal. Tenga cuidado de no perforar las paredes posterior o laterales. Avanzar la aguja en el lumen y atrás dos veces para asegurarse de que la luz es clara y cuidadosamente retire la aguja.
      Notas: Punción de carótida común puede ser ayudada por tomando la adventicia arterial con pinzas finas y levantando suavemente la pared frontal al insertar la punta de la aguja justo caudal al punto de elevación (figura 2A). Esto reduce el riesgo de golpear la pared posterior con la aguja.
    7. Con varias gasas desdobladas, crear un nido para colocar la jeringa utilizada para infusiones. Lugar este nido de Gasa caudal al sitio quirúrgico.
    8. Poner catéter IV de 24 G en la jeringa con sólo DMEM y apriete el catéter de la jeringa lo suficiente como para evitar fugas (la jeringa se eliminarán después de esta cirugía) y doblar el catéter ~ 4 mm de la punta para que la curva tiene a unos 75° después se libera.
    9. Inserte el catéter IV en la arteriotomía carótida común hasta el punto de la curva y lavar el lumen del injerto de la vena dos veces con 0,5 mL de DMEM. Para cada repetición, llene el injerto de la vena con DMEM. Continuación, extraiga el DMEM injerto presionando ligeramente con un dedo enguantado en el extremo craneal de la prótesis. Cuidadosamente Deslice el dedo hacia el extremo caudal del injerto para eliminar el contenido luminal a través de la arteriotomía.
    10. Retire la jeringa DMEM el catéter, dejando el catéter en el vaso. Conectar la jeringa que contiene la solución antivirus, asegurándose de que no el aire entra en el catéter. Mueva que la seda flojamente anudada lazos abajo de la arteria hasta que estén alrededor de la punta del catéter, pero no los apriete.
    11. Infunda 0,03 mL de la solución antivirus para empujar el DMEM restantes por el catéter. Retire todo el líquido del lumen del injerto de vena con el dedo, presionar suavemente desde craneal a caudal.
    12. Apriete los dos lazos alrededor de la punta de la arteria y el catéter a la luz del sello. Infundir la solución de virus hasta que la vena se dilata. Suavemente Coloque la jeringa sobre el nido de Gasa.
      Nota: Es vital que el injerto de la vena se expande a su calibre de la transducción de señales y se mantiene inflado durante la infusión de virus. Si no es así, se reducirá significativamente la cantidad de transferencia de genes.
    13. Dejar la solución que contiene el virus en el lumen del injerto de vena por 20 min y vuelva a colocar la jeringa que contiene el virus unida al catéter con una jeringa vacía. Aspire suavemente la solución que contiene el virus del injerto hasta que el vaso se colapsa. Retire la jeringa, dejando el catéter en su lugar. Corte y desatar las suturas seda y retirar el catéter de la nave. Retire el catéter de la arteria carótida con cuidado para evitar dañar el endotelio.
    14. Con la ayuda del microscopio quirúrgico, cerrar la arteriotomía con sutura de polipropileno 7-0 usando un patrón de X (figura 2B).
      1. Sujete la sutura con un sostenedor de la aguja, introduzca el recipiente en la parte inferior derecha de la arteriotomía y salir de la nave en la parte inferior izquierda. Cruzar la apertura fuera de la nave y hacer el segundo paso de la parte superior derecha de arriba a la izquierda.
      2. Antes de apretar la sutura, brevemente suelte el clip vascular craneal para purgar el aire y virus residuales del injerto de la vena y arteria. Sangre fluirá de la arteriotomía cuando se suelta la pinza.
      3. Cerrar la arteriotomía tirando suavemente de la sutura termina y atar junto con 2 nudos cuadrados.
        Nota: Tirar de la sutura muy apretada hará que agrupar de los tejidos que perturban el flujo, aumentan riesgo de trombosis y potencialmente introducir variables incontroladas.
    15. Suelte el clip vascular craneal, después el clip de caudal. Detener el sangrado utilizando gasa para aplicar presión ligera.
    16. Alrededor de este tiempo, inyectar buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) para proporcionar analgesia postoperatoria hasta que el parche de fentanilo ha proporcionado analgesia fentanilo niveles plasmáticos.
      Nota: Una inyección adicional de buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) puede ser necesario 6 h después de la primera inyección para mantener la analgesia hasta que fentanilo plasma alcanza una concentración terapéutica.
    17. Repita el protocolo de infusión de virus en el lado izquierdo, siguientes pasos 4.4.5-4.4.15.
  5. Encierro de la herida
    1. Cerrar el tejido subcutáneo con sutura de PGA de 5-0, con un patrón continuo. Cierre la piel con la sutura de PGA de 3-0 usando un patrón de Intradérmico. Enterrar los nudos en ambos extremos.
  6. Cuidado, limpieza y recuperación postoperatoria
    1. Siga el paso 2.4.

5. cosecha cirugía (Terminal)

  1. Preparar los instrumentos y el sitio quirúrgico.
    1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.3 en la cirugía de injerto de vena.
    2. Deje que el asistente abierto y asépticamente coloque sobre la mesa del instrumento (o pasar al cirujano): una jeringa de 20 mL, una aguja de 21G, sutura de seda 3-0 y una punta de prueba de flujo de sangre estéril.
    3. Siga los pasos 2.1.5-2.1.6 y 2.1.8 cirugía del injerto de la vena.
  2. Aislamiento de injertos de vena y arterias carótidas comunes
    1. Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel del cuello del conejo a las toallas con las abrazaderas de la toalla.
    2. En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera. Cortar la fascia diseca a lo largo de la línea media con la electrocauterización.
    3. Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo sobrepuesto a la tráquea y los músculos en forma de V sternocephalic a exponer el injerto común carótida y la vena.
    4. Diseccionar el injerto de la vena derecha y arteria carótida común libre de los tejidos circundantes. Utilizar bucles de silicona quirúrgica de la retracción de la arteria y el injerto de la vena durante la disección.
    5. Repita la disección en el lado izquierdo siguiendo pasos 5.2.3-5.2.4.
  3. Realizar mediciones de flujo siguiendo pasos 4.3.1-4.3.3 en la cirugía de transferencia génica.
  4. Cosecha de los injertos de vena
    1. Con sutura de seda 3-0, ligar la arteria carótida común derecha craneal al injerto. Entonces ligar la carótida caudal al injerto.
    2. Suprimir el injerto de la vena derecha dividiendo la arteria carótida adyacente entre cada una de las trompas y la anastomosis adyacente. Retirar el injerto de la vena del conejo e Irrigue el lumen con la solución salina.
    3. Cortar la arteria carótida y la anastomosis de ambos extremos del injerto de la vena. Recortar tejido adventitial exceso lejos del injerto de vena y cortar el injerto en segmentos según sea necesario para el análisis de punto final diferente.
    4. La cosecha del injerto de la vena izquierda repitiendo los pasos 5.4.1-5.4.3.
  5. Inyecte 1 mL de fenitoína/pentobarbital IV de eutanasia el conejo.
  6. Deseche cualquier residuos siguientes protocolos adecuados para eliminación de residuos biopeligrosos y sostenidos.

Resultados

La competencia técnica de un nuevo operador debe ser validada antes de que el operador puede utilizar este método para generar datos experimentales. El primer hito que un nuevo operador debe lograr es la permeabilidad del injerto de vena consistente después de la cirugía de injerto de vena inicial y la posterior cirugía retrasada-transducción. 90% sobre la permeabilidad después de cada una de las cirugías es deseable y alcanzable. La permeabilidad puede ser evaluada de forma no in...

Discusión

Pasos críticos en este protocolo incluyen la administración de la anestesia, manipulación de anticoagulación, cirugía de la vena arteria/injertado y medidas hemodinámicas de la vena injertada. Adecuado manejo de la anestesia es fundamental en este modelo de cirugía supervivencia múltiple que incluye dos operaciones relativamente largo (típicamente 3-3.5 h para injerto bilateral de la vena y 1.5-2.5 h para la transducción de injerto bilateral). Hemos administrado anestesia mediante una ojiva y por intubación en...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposables
3mL syringe with 24G needleBecton Dickinson3095712x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needleBecton Dickinson3096232x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needleBecton Dickinson305187Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lockNipro Medical CorpJD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4”Terumo Medical ProductsSROX2419V
21G needleBecton Dickinson305165Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4”Dynarex3242~10-15 per surgery
3-0 silk sutureCovidien Ltd.S-244
5-0 silk sutureCovidien Ltd.S-182
7-0 polypropylene sutureCP Medical8703PVein graft surgery
7-0 polypropylene sutureCP Medical8648PGene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid sutureCP Medical421A
3-0 polyglycolic acid sutureCP Medical398A
Alcohol swabsCovidien Ltd.6818For the placement of I.V. line
Catheter plugVetoquinol411498
Ketamine HCl, 100 mg/mLVedco Inc.5098916106
Xylazine, 100 mg/mLAkorn Inc.4821
Lidocaine, 20 mg/mLPfizer409427702
Marcaine 0.5%Pfizer409161050
Beuthanasia D-SpecialIntervet Inc.NDC 00061047305Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mLPatterson Veterinary12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chlorideBaxter2B1309
Heparin  (5000 U/mL)APP PharmaceuticalsNDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml)American Reagent Inc.NDC 0517-4002-25Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/hApotex Corp.NDC 60505-7006-2
IsofluraneMultiple vendorsCatalog number not available
 Viral vectorGene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straightRobozRS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/bluntRobozRS-6828
Needle holder /w suture scissorsMiltex8-14-IMC
Castroviejo scissorsRobozRS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lockRobozRS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/bluntRobozRS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongsRobozRS-65142x
Backhaus towel clamp 3.5"Roboz4x
Micro clip setting forceps 4.75"RobozRS-6496
Micro vascular clips, 11 mmRoboz
Surg-I-LoopScanlan International1001-81M5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip widthRobozRS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mmRobozRS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tipRobozRS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tipsRobozRS-71102x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tipsRobozRS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tipsRobozRS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tipsRobozRS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip widthRobozRS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip widthFine Science Tools11092-122x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straightFine Science Tools11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrodeMACAN ManufacturingHPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pumpMultiple vendorsCatalog number not available
Bair hugger warming unit3MModel 505
IV infusion pumpHeskaVet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavengerMultiple vendorsCatalog number not available
Veterinary multi-parameter monitorSurgivetSurgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unitMACAN ManufacturingMV-9
Surgical microscopeD.F. VasconcellosM90025X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

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