Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Resumen

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Resumen

El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal mediante la generación de respuestas tolerantes a antígenos dietéticos y bacterias comensales mientras que montar una respuesta inmune efectiva a enteropatógeno microbios. Además, ha quedado claro que la inmunidad local intestinal tiene un profundo impacto en la inmunidad sistémica y distante. Por lo tanto, es importante estudiar cómo se induce una respuesta inmune intestinal y lo que es los resultados inmunológicos de la respuesta. Aquí, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos del intestino inductivo como de Peyer tejido linfoide asociado a intestino y ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y efectoras como la lámina propia y la epitelio intestinal. Esta técnica asegura el aislamiento de un gran número de linfocitos de los tejidos intestinales pequeñas con óptima pureza, viabilidad y mínima contaminación compartimentación dentro de las limitaciones de tiempo aceptable. La capacidad técnica para aislar los linfocitos y otras células inmunes de los tejidos intestinales permite la comprensión de la respuesta inmune a infecciones gastrointestinales, cánceres y enfermedades inflamatorias.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) tiene muchos pliegues y protuberancias que representa la interfaz más grande separando el cuerpo interno y el ambiente externo. El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal. Está constantemente expuesto a antígenos dietéticos, las bacterias comensales y microbios patógenos. Como tal, debe seguir siendo tolerante a antígenos alimentarios y bacterias comensales conservando la capacidad de generar rápidamente una respuesta inmune efectiva a microbios enteropatógeno¹. El sistema inmune intestinal puede dividirse anatómicamente en inductivo, donde los linfocitos se activan por el antígeno que presenta las células con antígenos de la mucosa intestinal, y efectoras, donde ejercen determinados linfocitos activados de las funciones efectoras². Los sitios inductivos constituyen la estructura linfoide organizada de placas de Peyer (PP) que examina la luz intestinal directamente a través de la acción de las células M especializadas y nodos de linfa mesentéricos drenantes regionales (MLN). Los sitios efectores consisten en la lámina propia (LP), que es el tejido conectivo debajo de la membrana basal y el epitelio intestinal, una capa de célula situado por encima de la membrana del sótano que contiene linfocitos intraepiteliales (IEL). Los linfocitos son los principales actores de la inmunidad adaptativa que median protección contra infecciones y cánceres y pueden también contribuir a la Inmunopatología de las enfermedades inflamatorias. Es importante y muy relevante para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos anatómicos mucosa para mejor entienden sus funciones inducción y efectoras.

Un protocolo relativamente simple y unificado para el aislamiento de los linfocitos de estos compartimentos se necesita que el número de investigadores explorar eventos inmunes que ocurren en el intestino está acelerando. Varios grupos de investigación han publicado protocolos que comparten varios procesos similares para aislar las células inmunes del ratón pequeños compartimentos intestinal^3,4,5,6,7 . Sin embargo, hay varias diferencias técnicas entre ellos según el enfoque del protocolo individual. Por ejemplo, con el foco en el aislamiento de las células inmunes del LP, un protocolo analiza el impacto de varias digestiones enzimáticas en la viabilidad celular, expresión de marcadores de superficie celular y la composición de las células inmunes aislados⁵. Otro protocolo destaca un método rápido y reproducible para el aislamiento de linfocitos sin densidad centrifugación⁶. Por último, también existen protocolos específicos con el fin de aislar a los fagocitos mononucleares de capas diferentes de tejido del intestino delgado⁷. Aquí, se presenta un protocolo altamente reproducible que permite aislamiento secuencial de poblaciones linfocitarias del MLN, PP, LP y IEL compartimiento del intestino delgado.

Nos centramos en aislar poblaciones altamente purificadas de los compartimientos del LP y IEL, que son en gran parte libres de contaminantes de otros compartimentos intestinales. Esto ampliamente utilizado protocolo produce un alto rendimiento de linfocitos máximo puros y viables en tiempo aceptable restricciones^{4,8,9,10,11,12}. Este protocolo también asegura el aislamiento de los linfocitos del compartimiento de LP y IEL con mínima contaminación compartimentación, lo que permite una oportunidad buena fe para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos. Los linfocitos aislados pueden ser sometidos a manipulaciones más como análisis cytometric del flujo o análisis funcional. Este protocolo se ha aplicado con éxito para el aislamiento de linfocitos de ratón intestino delgado y colon durante infecciones por bacterias como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis infecciones y afecciones inflamatorias como la colitis inducida por químicos y patógenos. Este protocolo también puede utilizarse para aislar las células inmunes innatas como las células dendríticas, macrófagos, neutrófilos y monocitos de ratón intestino delgado y colon.

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Protocolo

Todos los experimentos en animales eran realizados de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de salud y aprobados por el pedregoso del arroyo Universidad institucional Animal cuidado y uso.

Nota: Asegúrese de que todas las aprobaciones se conceden antes de realizar procedimientos.

1. preparación de la solución

1. HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y gentamicina), 100 ×
   1. Mezclar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g de L-glutamina 200 mM (final), 1 × 10⁶ U penicilina (2.000 U/mL final), la estreptomicina 1 g (2 mg/mL final) y gentamicina 2.5 mg (5 μg/mL final). Añadir RPMI 1640 a 500 mL. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH (antes del ajuste, el búfer es amarillo y naranja con un pH alrededor de 6.0). Filtro de esterilización usando un filtro de 0.45 μm. Alícuota y conservar a-20 ° C hasta por 1 año o a 4 ° C durante 1 mes.
2. De tampón HEPES-bicarbonato, 10 x
   1. 23,8 g HEPES (100 mM final), de la mezcla 21 g NaHCO₃ (250 mM final) y añadir agua a 1000 mL. Ajustar pH a 7.2 con HCl. filtro esterilice usando un filtro de 0.45 μm. Almacenar a temperatura ambiente. El pH cambia con el tiempo. Volver a ajustar periódicamente el pH.
3. Cosecha media (~ ratones botella 1/2)
   1. A 500 mL de RPMI 1640, añadir 25 mL inactivadas por calor suero bovino fetal (5% final) y 5 mL 100 × HGPG. Almacenar hasta 6 meses a 4 ° C.
4. Solución de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeña del intestino)
   1. Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca₂⁺- y Mg₂⁺-gratis, 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer y 50 mL inactivadas por calor suero fetal bovino (10% final). Añadir 350 mL H₂O y 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.
5. Solución de ácido (EDTA) etilendiaminotetraacético (50 mL/pequeña del intestino)
   1. Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca₂⁺- y Mg₂⁺-libre con 5 mL 100 × HGPG. Añadir 445 mL H₂O. Añadir 260 μl EDTA de 0,5 M/100 mL (1,3 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.
6. Solución de colagenasa (30 mL/LP)
   1. A 500 mL RPMI, añadir 50 mL de SFB (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M de MgCl₂ (final de 1 mM) y 1 mL 0.5 M CaCl₂ (final de 1 mM). Añadir colagenasa, tipo I (100 U/mL final). Preparar esta fresca antes de su uso.
7. Soluciones de (DG) gradiente de densidad
   1. Prepare 1 × DG solución mezclando solución 90 mL DG (consulte la Tabla de materiales) con 10 mL de PBS de 10 x. Mantener estéril a 4 º C.
   2. Preparar solución DG 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP) mediante la mezcla de 44 mL de solución madre 1 × DG y 56 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.
   3. Preparar solución DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP) mezclando 67 mL de solución stock de 1 × DG y 33 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.

2. aislamiento de los ganglios linfáticos mesentéricos, los intestinos y placas de Peyer parches

1. Eutanasia el ratón con narcosis por dióxido de carbono y la dislocación cervical secundaria. Coloque el ratón en su parte posterior y rociar con etanol al 70%. Utilice tijeras para hacer una incisión del midline y abrir la piel y pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal.
2. Ubicar el ciego y utilizar pinzas para bajar suavemente el intestino ciego. Utilice pinzas para mover cuidadosamente el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo toda la cadena MLN, que está alineada con los dos puntos.
   Nota: Un mapa de los nodos de linfa mesentéricos cadena y linfático drenaje intestinal era anteriormente representó¹³.
3. Identificar el nodo de la parte inferior de la cadena, situado más cercano al ciego. Utilizar un sistema de pinzas para sujetar el mesenterio o grasa alrededor y sacar suavemente la cadena MLN del fondo a la cima por la grasa de alrededor del nodo de linfa con otro juego de pinzas de tweezing.
4. Coloque la cadena MLN sobre una toalla de papel humedecida con media cosecha. Quitar grasa mesenterio la cadena en la torre de papel y sacar la grasa con dos juegos de pinzas. Lugar el MLN en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento.
   Nota: se desaconseja la manipulación (i) directa de los nodos. Sujete el mesenterio o grasa alrededor de ellos. (ii) es fundamental para eliminar tanta grasa mesenterio como sea posible para mejorar la viabilidad de las células.
5. Corte de intestino delgado por debajo de la esfinge pilórica y arriba el ciego con unas tijeras. Sacar el intestino poco a poco del íleon al duodeno mediante un sistema de pinzas mientras se retira el mesenterio o grasa adjuntado con otro conjunto de pinzas.
6. Colocar el intestino en una toalla de papel humedecida con media cosecha y burlan cualquier restante mesentery o grasa apagado con dos juegos de pinzas.
   Nota: () Asegúrese de quitar tanta grasa mesenterio como sea posible para el rendimiento óptimo de la célula y viabilidad. (ii) mantener el intestino humedecido a lo largo de este y los siguientes pasos aplicando medios de cosecha periódicamente.
7. Recoger de Peyer quitándolos del intestino con tijeras curvas. Use una disección alcance o lupa si es necesario (principiantes); mayoría de Peyer debe ser visibles para el ojo entrenado. Recoger 5-11 (típico) placas de Peyer del intestino. Parches lugar placas de Peyer en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento.
   Nota: Placas de Peyer están pequeñas, principalmente redondas protuberancias en la pared intestinal externa frente a la línea de fijación del mesenterio.
8. Utilice el lado plano de la pinza y suavemente Deslice desde el duodeno hacia el íleon para expulsar moco y contenido fecal. Repetición una vez para eliminar la mayor parte del moco.
   Nota: Retiro incompleto del moco puede disminuir la viabilidad celular y rendimiento. Sin embargo, asegúrese de deslizar el intestino suavemente para evitar la extracción de vellosidades o dañar la membrana del sótano.
9. Utilice tijeras finas con un extremo romo de un punto, introduzca el extremo embotado en el intestino y el intestino abierto longitudinalmente desde el duodeno al ileon. Corte lateralmente el intestino abierto en trozos de 2 cm. Colocar los intestinales en un tubo cónico de 50 mL con medios de cosecha fría de 25 mL para pasos posteriores de aislamiento.
   Nota: Mantener las tijeras humedecidas con los medios de comunicación les ayudará deslice sin esfuerzo a través del intestino.

3. aislamiento de linfocitos a los sitios inductivos

1. Aislar los linfocitos del MLN saldándose suavemente a través de un tamiz de celular 70 μm utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL. Lave el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.
2. Pelotilla MLN-células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.
   Nota: tampón de lisis de glóbulos rojos puede utilizarse para extraer células de sangre rojas si el sangrado se produjo durante la extracción.
3. Aislar los linfocitos de las placas de Peyer por incubación de placas de Peyer en un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL precalentado colagenasa solución a 37 ° C y 220 rpm por 30 min.
4. Vortex por 15 s en posición de máxima potencia y filtro digiere tejido y sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente se disocian las restantes piezas de tejido con el émbolo de una jeringa de 3 mL y lavar el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.
5. Las células de parches de Peyer de pellets por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.
   Nota: Aislamiento de parches de Peyer pueden tener algunos contaminantes los linfocitos de la lámina propia y linfocitos intraepiteliales.

4. aislamiento de los linfocitos intraepiteliales del intestino

1. Lave los trozos de intestino tres veces con 25 mL de medio de cosecha fría por inversión del tubo 10 veces, dejando las piezas intestinales resolver y verter fuera el sobrenadante.
   Nota: Piezas de tejido deben instalarse fácilmente a la parte inferior del tubo. Si no lo hace, es un indicio de que demasiada grasa mesenterio queda sujeta o se asocian con una burbuja de aire.
2. Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y transferir a un matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL.
3. Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL nuevo a través de un tamiz de celular 70 μm teniendo cuidado de mantener las piezas de tejido en el tubo original. Desechar el sobrenadante; el sobrenadante contiene linfocitos intraepiteliales. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 10 mL y almacenar en hielo.
4. Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y la transferencia hacia el matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL.
   Nota: DTE es un agente reductor que enriquece los linfocitos intraepiteliales.
5. Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante a través de un tamiz celular de 70 μm al tubo anterior que contiene células partir del sobrenadante del primer tratamiento del DTE (desde el paso 4.3).
   Nota: Las restantes piezas intestinales se utilizan para aislar los linfocitos de la lámina propia. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que las células epiteliales están presentes y la membrana basal está intacta.
6. Pellet de células por centrifugación el sobrenadante a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG 44% a temperatura ambiente (RT).
7. Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min a temperatura ambiente sin utilizar el freno.
   Nota: Los tubos pueden ser pretratados con suero bovino para evitar que las células se adhieran a las paredes del tubo.
8. Tenga en cuenta que células viables forman una banda (buffy coat) en la interfaz de 44% a 67%, las células muertas y algunas células epiteliales están en una película mucoide en la parte superior del gradiente, y son los glóbulos rojos en el sedimento. Quitar la capa superior del degradado dentro de ~ 2 cm de la interfaz por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en la interfaz y transferirlos a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.
9. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.

5. aislamiento de linfocitos de la lámina propia del intestino

1. Quitar las células epiteliales de piezas de tejido intestinal añadiendo 25 mL de solución EDTA precalentado al matraz que contiene las restantes piezas intestinales. Frasco de agitación a 37 º C y 220 rpm en un agitador magnético durante 30 minutos utilizar un imán grande en el exterior del matraz de sostener la barra de agitación y descartar cuidadosamente el sobrenadante manteniendo piezas intestinales dentro de la cubeta.
   Nota: (i) el EDTA es un quelante del calcio que apunta a las ensambladuras dependiente de calcio y promueve el desprendimiento de células epiteliales intestinales. (ii) el sobrenadante debe ser nublado y puede utilizarse para aislar IEC desearlo su colección.
2. Repita el paso 5.1.
   Nota: El sobrenadante debe ser menos nublado después de la incubación. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que se han eliminado las células epiteliales intestinales y la membrana basal está intacta. Una muestra del sobrenadante también puede evaluarse mediante citometría de flujo para confirmar que los leucocitos (CD45⁺ células) están ausentes.
3. Añadir 50 mL de medio de cosecha RT en el matraz. Mezclar brevemente con un imán. Que piezas intestinales resolver y eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
   Nota: Este paso garantiza la eliminación de EDTA antes de la digestión de la colagenasa como EDTA desactiva colagenasa por quelantes del calcio que es esencial para la función de la colagenasa.
4. Añadir 30 mL de solución de colagenasa precalentado al matraz y agite intestinales piezas a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 45 minutos.
5. Transferencia de tejido digerido y el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL por filtración a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente disociar restantes piezas de tejido mediante el émbolo de una jeringa de 3 mL el puré a través del filtro. Lavar el filtro con 10 mL de medio de cosecha fría.
6. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG de 44% de temperatura ambiente.
7. Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de temperatura ambiente 67% DG. Centrifugue los gradientes en temperatura y 1600 × g por 20 min sin freno.
8. Retire la capa de grasa en la parte superior por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en el interfaz y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.
9. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.

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Resultados

Se muestra una representación esquemática del Protocolo (figura 1). Los linfocitos de la mucosa intestinal inductiva y sitios efectores se organizan claramente. Peyer de parches (PP) y nodos de linfa mesentéricos (MLN) contienen linfocitos en áreas bien organizadas de células T y folículos de células B, mientras que el epitelio intestinal contiene linfocitos que se distribuyen más difusamente. La lámina propia (LP) contiene linfocitos difusamente dis...

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Discusión

Se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos desde el intestinal mucosa inductivo (MLN y PP) y efectores (compartimiento de LP y IEL). El protocolo ha sido desarrollado para equilibrar la entrada (tiempo) y salida (viabilidad y rendimiento) para maximizar la productividad y resultados. El protocolo también asegura la mínima contaminación compartimentación entre LP y IEL compartimientos.

Varios protocolos para el aislamiento de las células inmunes del intestino ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148