Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Résumé

Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction barrière de l’appareil gastro-intestinal en générant des réponses tolérants aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en montage efficace des réponses immunitaires aux entéropathogènes microbes. En outre, il est devenu clair que l’immunité intestinale locale a un impact profond sur l’immunité systémique et lointaine. Par conséquent, il est important d’étudier comment un système immunitaire intestinal est induite et quelle est l’issue immunologique de la réaction. Un protocole détaillé est décrit ici, pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin grêle des sites inductifs comme les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et le drainage des ganglions mésentériques et effectrices comme la lamina propria et de la épithélium intestinal. Cette technique assure l’isolement d’un grand nombre de lymphocytes de petits tissus intestinaux avec pureté optimale et de viabilité et de la contamination croisée compartimentale minime dans les contraintes de temps acceptable. La capacité technique d’isolation des lymphocytes et autres cellules immunitaires dans les tissus intestinaux permet la compréhension de la réponse immunitaire aux infections gastro-intestinales, les cancers et les maladies inflammatoires.

Introduction

Le système gastro-intestinal (GI) a beaucoup de plis et de protubérances qui représente l’interface plus importante qui sépare le corps interne et le milieu extérieur. Le système immunitaire intestinal joue un rôle essentiel dans le maintien de la fonction de barrière du tube digestif. Il est constamment exposé à des antigènes alimentaires, les bactéries commensales et microbes pathogènes. À ce titre, elle doit rester tolérant aux antigènes alimentaires et de bactéries commensales tout en préservant la capacité de générer rapidement une réponse immunitaire efficace de microbes entéropathogène¹. Le système immunitaire intestinal peut être anatomiquement divisé en sites inductives, où les lymphocytes naïfs sont activés par l’antigène présentant des cellules porteuses d’antigènes de la muqueuse intestinale, et effectrices, où exercent spécifique des lymphocytes activés ²les fonctions effectrices. Les sites inductives comprennent la structure lymphoïde organisée des plaques de Peyer (PP) que les enquêtes de la lumière intestinale directement par le biais de l’action des cellules spécialisées de M et les régionales drainantes ganglions mésentériques (MLN). Les sites d’effecteur se composent de la lamina propria (LP), qui est le tissu conjonctif sous la membrane basale et l’épithélium intestinal, une couche monocellulaire située au-dessus de la membrane basale qui contient des lymphocytes intra-épithéliaux (IEL). Les lymphocytes sont des acteurs majeurs de l’immunité adaptative qui véhiculent une protection contre les infections et les cancers et peuvent aussi contribuer à l’immunopathologie des maladies inflammatoires. Il est important et hautement pertinent d’étudier des lymphocytes dans ces différents compartiments anatomiques de muqueuses afin de mieux comprennent leurs fonctions induction et effectrices.

Un protocole relativement simple et unifié pour l’isolement des lymphocytes de ces compartiments est nécessaire car le nombre d’enquêteurs explorant les événements immunitaires survenant dans l’intestin s’accélèrent. Plusieurs groupes de recherche ont publié les protocoles qui partagent plusieurs procédés similaires pour isoler les cellules immunitaires de la souris petits compartiments intestinale^3,4,5,6,7 . Cependant, il y a plusieurs différences techniques entre eux selon la mise au point du protocole individuel. Par exemple, en mettant l’accent sur l’isolation de cellules immunitaires dans le LP, un seul protocole examine l’impact de diverses digestions enzymatiques sur la viabilité cellulaire, expression de marqueurs de surface de cellules et la composition des cellules immunitaires isolées⁵. Un autre protocole met en évidence une méthode rapide et reproductible pour l’isolement des lymphocytes sans densité centrifugation⁶. Enfin, les protocoles spécifiques existent également pour isoler des phagocytes mononuclées de couches de différents tissus de l' intestin grêle⁷. Ici, un protocole hautement reproductible qui permet d’isoler séquentielle de populations de lymphocytes du compartiment MLN, PP, LP et IEL de l’intestin grêle est présenté.

Nous nous concentrons sur l’isolement des populations hautement purifiées des compartiments LP et IEL, qui sont en grande partie exemptes de contaminants des autres compartiments intestinales. Cela couramment protocole produit un rendement élevé de lymphocytes au maximum pures et viables dans des temps acceptables contraintes^{4,8,9,10,11,12}. Ce protocole garantit aussi l’isolement des lymphocytes du LP et IEL compartiment avec un minimum de contamination croisée compartimentale, permettant une véritable occasion d’étudier des lymphocytes dans ces compartiments distincts. Les lymphocytes isolés peuvent être soumis à des manipulations supplémentaires comme la cytométrie ou analyse fonctionnelle. Ce protocole a été appliqué avec succès à l’isolement des lymphocytes de la souris intestin grêle et du côlon au cours des infections bactériennes comme la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumet Yersinia pseudotuberculosis les infections et les maladies inflammatoires comme la colite induite par agent pathogène et chimique. Ce protocole permet également d’isoler les cellules immunitaires innées telles que les cellules dendritiques, macrophages, polynucléaires neutrophiles et les monocytes de la souris intestin grêle et du côlon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux directives de l’Institut National de la santé et approuvés par le Comité de l’emploi et de Stony Brook University Institutional Animal Care.

Remarque : Assurez-vous que toutes les homologations sont accordées avant de procéder.

1. préparation de la solution

1. HGPG (HEPES, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et gentamicine), 100 ×
   1. Mélanger 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamine (final de 200 mM), 1 × 10⁶ U la pénicilline (2 000 U/mL final), streptomycine 1 g (2 mg/mL final) et gentamicine 2,5 mg (5 µg/mL final). Ajouter RPMI 1640 à 500 mL. Ajuster le pH à 7,5 à l’aide de NaOH (avant ajustement, le tampon est jaune/orange avec un pH autour de 6.0). Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Aliquote et entreposer à-20 ° C pendant 1 an à 4 ° C pendant environ 1 mois.
2. Un tampon HEPES-bicarbonate, x 10
   1. Mix 23,8 g HEPES (final de 100 mM), 21 g de NaHCO₃ (250 mM final) et ajouter de l’eau à 1 000 mL. Ajuster le pH à 7,2 avec HCl. filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,45 µm. Conserver à température ambiante. Le pH change au fil du temps. Ré-ajuster le pH régulièrement.
3. Récolter des médias (~ souris bouteille 1/2)
   1. À 500 mL RPMI 1640, ajouter 25 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal (finale de 5 %) et 5 mL 100 × HGPG. Stocker jusqu'à 6 mois à 4 ° C.
4. Solution de dithioérythritol (DTE) (40 mL/petit intestin)
   1. Mélanger 50 mL 10 × solution saline équilibrée de Hanks, Ca₂^{+ -}et Mg₂⁺-libre, 50 mL 10 × HEPES-bicarbonate de tampon et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal (final de 10 %). Ajouter 350 mL H₂O et 15,4 mg dithioérythritol/100 mL (finale de 1 mM). Préparer ce frais avant utilisation.
5. Solution de (EDTA) d’acide éthylènediaminetétraacétique (50 mL/petit intestin)
   1. Mélanger 50 mL 10 × solution saline équilibrée de Hanks, Ca₂^{+ -}et Mg₂⁺-libres avec 5 mL 100 × HGPG. Ajouter 445 mL H₂O. Ajouter 260 µL EDTA de 0,5 M/100 mL (1,3 mM final). Préparer ce frais avant utilisation.
6. Solution de collagènase (30 mL/LP)
   1. À 500 mL RPMI, ajouter 50 mL FBS (10 % FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl₂ (final de 1 mM) et 1 mL 0,5 M CaCl₂ (final de 1 mM). Ajouter la collagénase, de Type I (100 U/mL final). Préparer ce frais avant utilisation.
7. Solutions (DG) gradients de densité
   1. Préparer 1 solution × DG en mélangeant 90 mL DG de solution (voir la Table des matières) avec 10 mL de 10 × PBS. Garder stérile à 4 ° C.
   2. Préparer 44 % DG solution (8 mL/IEL, 8 mL/LP) en mélangeant 44 mL de solution mère de 1 × DG et 56 mL RPMI 1640. Préparer ce frais avant utilisation.
   3. Préparer solution DG de 67 % (5 mL/IEL, 5 mL/LP) en mélangeant 67 mL de solution mère de 1 × DG et 33 mL RPMI 1640. Préparer ce frais avant utilisation.

2. isolement des ganglions mésentériques, intestins et de Peyer Patches

1. Euthanasier la souris à l’aide de dioxyde de carbone narcose et dislocation cervicale secondaire. Placez la souris sur le dos et vaporiser avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux pour faire une incision médiane et ouvrir la peau et la paroi abdominale pour exposer la cavité péritonéale.
2. Rechercher caecum et utiliser des pinces pour abaisser doucement du caecum. Forceps permet de déplacer délicatement l’intestin grêle vers la droite, exposant ainsi toute la chaîne MLN, qui est alignée sur le côlon.
   Remarque : Une carte de : les ganglions lymphatiques mésentériques, drainage lymphatique et de la chaîne de l’intestin a été précédemment représenté¹³.
3. Identifier le nœud du bas de la chaîne, proche du caecum. Utilisez un jeu de pinces pour saisir le mésentère/graisse autour d’elle et retirez doucement la chaîne MLN du bas vers le haut par épilation la graisse d’autour du ganglion lymphatique avec un autre ensemble de pinces.
4. Poser la chaîne MLN sur un essuie-tout imbibé de media de moisson. Enlever mésentère/graisse en roulant la chaîne sur la tour de papier et arrachant la graisse avec deux jeux de pinces. Placez le MLN en milieu froid récolte pour les étapes ultérieures d’isolement.
   NOTE : (i) Direct manipulation des nœuds est déconseillée. Au lieu de cela, saisir le mésentère/graisse autour d’eux. (ii) il est essentiel de supprimer autant de mésentère/gras possible pour améliorer la viabilité des cellules.
5. Couper l’intestin grêle sous le sphincter pylorique et au-dessus du caecum à l’aide de ciseaux. Retirer l’intestin lentement de l’iléon au duodénum à l’aide d’un jeu de pinces tout en retirant le mésentère/gras attaché à l’aide d’un autre ensemble de pinces.
6. Placez l’intestin sur un essuie-tout imbibé de media de moisson et taquiner tout mésentère/gras restant au large avec deux jeux de pinces.
   NOTE : (i) Veillez à supprimer autant de mésentère/gras possible rendement cellulaire optimale et leur viabilité. (ii) maintenir l’intestin imbibé dans tout cela et les étapes suivantes en appliquant des médias récolte périodiquement.
7. Recueillir de Peyer en les retirant de l’intestin avec des ciseaux courbes. Utiliser une dissection étendue ou une loupe si nécessaire (débutants) ; la plupart de Peyer devrait être visible à le œil averti. Collecter 5-11 (standard) de Peyer dans l’intestin grêle. Patchs de place Peyer dans médias récolte froid pour les étapes ultérieures d’isolement.
   NOTE : De Peyer patchs sont de petite taille, principalement autour de bosses dans la paroi intestinale extérieure face à la ligne d’attache du mésentère.
8. Utiliser le côté plat de la pince et doucement glisser du duodénum vers l’iléon à expulser le mucus et contenu fécal. Répétez l’opération une fois pour enlever la plupart de la glaire.
   NOTE : Une expulsion incomplète du mucus peut diminuer la viabilité cellulaire et rendement. Néanmoins, n’oubliez pas de glisser l’intestin doucement afin d’éviter des villosités de décapage ou d’endommager la membrane basale.
9. Utilisez des ciseaux avec une extrémité franche sur un point, insérez l’extrémité arrondie de l’intestin et couper l’intestin ouvert longitudinalement entre le duodénum et l’iléon. Latéralement, couper l’intestin ouvert en morceaux d’environ 2 cm. Placer les morceaux intestinales dans un tube conique de 50 mL avec 25 mL de milieu de récolte froid pour les étapes ultérieures d’isolement.
   NOTE : Garder les ciseaux imbibés de médias aidera les glisser sans effort à travers l’intestin.

3. isolement des Lymphocytes provenant des Sites Inductive

1. Isoler les lymphocytes de MLN en dissociant délicatement à travers un tamis de cellule de 70 µm en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL. Lavez tamis cellulaire avec 5 mL de médias récolte froid.
2. Pellet MLN-cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.
   NOTE : tampon de lyse des globules rouges peut servir à supprimer des culots globulaires si le saignement est survenu au moment du retrait.
3. Isoler les lymphocytes de plaques de Peyer en incubant les plaques de Peyer dans un tube conique 15 mL contenant la solution de collagènase 5 mL préchauffé à 37 ° C et 220 tr/mn pendant 30 min.
4. Vortexer pendant 15 s à réglage maximal et filtre digéré le tissu et le surnageant dans un tube conique de 50 mL à travers un tamis de cellule de 70 µm. Doucement se dissocient les pièces restantes de tissus en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL et lavez le tamis cellulaire avec 5 mL de médias récolte froid.
5. Les cellules de patch de Peyer de granule par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.
   NOTE : Peyer de patchs isolement peuvent avoir certains contaminants lamina propria lymphocytes et lymphocytes intra-épithéliaux.

4. isolement des Lymphocytes intra-épithéliaux dans l’intestin grêle

1. Lavez les morceaux d’intestin grêle trois fois avec 25 mL de médias récolte froid en renversant le tube 10 fois, laisser les pièces intestinales s’installer et décanter le liquide surnageant.
   NOTE : Morceaux de tissus devrait facilement déposer au fond du tube. S’ils ne le font pas, c’est une indication que trop mésentère/graisse reste attachée ou elles sont associées à une bulle d’air.
2. Ajouter 20 mL de solution DTE préchauffée dans le tube conique de 50 mL contenant des morceaux intestin et transférer dans une fiole Erlenmeyer mastic de 50 mL contenant un émoi-bar. Remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 20 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre d’émoi et le tissu et la solution de transfert vers le tube conique de 50 mL.
3. Vortex le tube au maximum réglage pour 10 s. transfert le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL conique à travers un tamis de cellule de 70 µm en prenant soin de garder les morceaux de tissus dans le tube d’origine. Ne pas jeter le surnageant ; le surnageant contient des lymphocytes intra-épithéliaux. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de froid récolte et stockage sur glace.
4. Ajouter 20 mL de solution DTE préchauffée dans le tube conique de 50 mL contenant des morceaux intestin et transférer vers le 50 mL mastic erlenmeyer contenant un émoi-bar. Remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 20 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre d’émoi et le tissu et la solution de transfert vers le tube conique de 50 mL.
   NOTE : DTE est un agent réducteur qui enrichit les lymphocytes intra-épithéliaux.
5. Vortex le tube au maximum réglage pour 10 s. transfert le surnageant à travers un tamis de cellule de 70 µm dans le tube précédent contenant des cellules du surnageant du premier traitement DTE (de l’étape 4.3).
   Remarque : Les pièces restantes intestinales sont utilisés pour isoler les lymphocytes de la lamina propria. Contrôle de la qualité : Un morceau de tissu pourra être enlevé et vérifié histologiquement pour s’assurer que les cellules épithéliales sont présents et la membrane basale est intacte.
6. Cellules de pellet en centrifugeant le surnageant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 8 mL de solution DG de 44 % à la température ambiante (RT).
7. Transvaser la suspension 8 mL de solution/cellules sur les DG 44 % dans un ø 17 mm x 100 mm style tube fond rond polypropylène de 14 mL. Sous-couche avec 5 mL de solution DG RT 67 %. Centrifuger à 1600 × g pendant 20 min à ta sans frein.
   NOTE : Les Tubes peuvent être prétraités avec sérum bovin pour empêcher les cellules de coller aux parois du tube.
8. Notez que des cellules viables forment une bande (couche leuco-plaquettaire) à l’interface de 44 à 67 %, les cellules mortes et certaines cellules épithéliales sont dans un film mucoïde en haut de la pente et les globules rouges sont dans le culot. Enlever la couche supérieure de la pente à environ 2 cm de l’interface par aspiration sous vide. Utiliser une pipette Pasteur pour récolter la couche leuco-plaquettaire à l’interface et les transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de milieu de récolte froid.
9. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.

5. isolement des Lymphocytes de la Lamina Propria de l’intestin grêle

1. Retirer les cellules épithéliales de morceaux de tissu intestinal en ajoutant 25 mL de solution d’EDTA préchauffée à la fiole contenant les pièces restantes intestinales. Fiole de remuer à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 30 min. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour tenir la barre de remuer et soigneusement éliminer le liquide surnageant tout en gardant des morceaux intestinale dans la fiole.
   NOTE : (i) l’EDTA est un chélateur du calcium qui cible les jonctions dépendant du calcium et favorise le détachement des cellules épithéliales intestinales. (ii) le surnageant doit être nuageux et peut être utilisé pour isoler la CEI si leur collection est souhaitée.
2. Répétez l’étape 5.1.
   Remarque : Le liquide surnageant doit être moins nuageux après cette incubation. Contrôle de la qualité : Un morceau de tissu pourra être enlevé et vérifié histologiquement afin de s’assurer que les cellules épithéliales intestinales ont été supprimées et la membrane basale est intacte. Un échantillon du surnageant peut également être mesurée par cytométrie pour confirmer que les leucocytes (CD45⁺ cellules) sont absents.
3. Ajouter 50 mL de médias récolte RT dans le ballon. Remuer brièvement avec un aimant. Laisser les morceaux intestinale reposer et soigneusement éliminer le surnageant.
   Remarque : Cette étape assure l’enlèvement de l’EDTA avant la digestion de collagénase comme l’EDTA inactive collagénase par chélation du calcium qui est critique pour la fonction de collagénase.
4. Ajouter 30 mL de solution de collagènase préchauffée dans le ballon et remuer les morceaux intestinale à 37 ° C et 220 tr/mn sur un agitateur magnétique pendant 45 min.
5. Transfert tissus digérés et surnageant dans un tube conique de 50 mL en filtrant à travers un tamis de cellule de 70 µm. Doucement se dissocient les morceaux de tissu restant en utilisant le piston d’une seringue de 3 mL pour écraser à travers le filtre. Laver le filtre avec 10 mL de médias récolte froid.
6. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 8 mL de solution de DG de 44 % la température ambiante.
7. Transvaser la suspension 8 mL de solution/cellules sur les DG 44 % dans un ø 17 mm x 100 mm style tube fond rond polypropylène de 14 mL. Sous-couche avec 5 mL de solution de DG de 67 % la température ambiante. Centrifuger les gradients à température ambiante et 1600 × g pendant 20 min avec pas de frein.
8. Enlever la couche de graisse sur le dessus de l’aspiration intra-utérine. Utiliser une pipette Pasteur pour récolter la couche leuco-plaquettaire à l’interface et les transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de milieu de récolte froid.
9. Culot de cellules par centrifugation à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte froid. Compter les cellules viables en utilisant le bleu trypan exclusion.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Une représentation schématique du protocole est représentée (Figure 1). Lymphocytes dans la muqueuse intestinale inductive et sites effecteurs sont organisés distinctement. Peyer de correctifs (PP) et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) contiennent des lymphocytes dans les zones de cellules T bien organisées et follicules de cellules B, tandis que l’épithélium intestinal contient des lymphocytes qui sont distribués de façon plus diffu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Un protocole détaillé est présenté pour l’isolement des lymphocytes de l’intestin muqueuses inductive (MLN et PP) et sites de l’effecteur (LP et IEL compartiment). Le protocole a été élaboré afin d’équilibrer les entrées (temps) et sorties (viabilité et le rendement) pour maximiser la productivité et des résultats. Le protocole garantit également la contamination croisée compartimentale minime entre compartiments LP et IEL.

Plusieurs protocoles d’isolement de cellules ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148