Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Özet

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Özet

Bağırsak bağışıklık sistemi etkili bağışıklık yanıtlarını enteropathogenic montaj sırasında hoşgörülü yanıt diyet antijenleri ve Komensal bakteriler oluşturarak gastrointestinal sistem bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar mikroplar. Buna ek olarak, yerel bağırsak dokunulmazlık uzak ve sistemik bağışıklık üzerinde derin bir etkisi vardır açık hale gelmiştir. Bu nedenle, çalışma nasıl bir bağırsak bağışıklık yanıtı indüklenen ve immünolojik sonuç yanıtın ne önemlidir. Burada, detaylı bir protokol gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri gibi ince bağırsak endüktif sitelerinden ve lamina propria gibi siteler efektör lenfositler yalıtım için açıklanan ve bağırsak epitel. Bu teknik en uygun saflık ve canlılığı ve kabul edilebilir zaman kısıtlamaları içinde en az çapraz compartmental bulaşma ile yalıtım lenfositler küçük bağırsak dokulara gelen çok sayıda sağlar. Lenfositler ve bağırsak dokularında diğer bağışıklık hücreleri izole etmek için teknik yeteneği gastrointestinal enfeksiyonlar, kanser ve inflamatuar hastalıklar bağışıklık yanıtlarını anlayış sağlar.

Giriş

Gastrointestinal (GI) sistem birçok kıvrımlar ve iç vücut ve dış çevre ayıran en büyük arabirimini gösterir çıkıntılar vardır. Bağırsak bağışıklık sistemi GI yolu bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar. Sürekli diyet antijenleri, Komensal bakteriler ve patojenik mikroplar maruz. Bu nedenle, bu hızla enteropathogenic mikroplar¹etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kapasite koruyarak gıda antijenleri ve Komensal bakteriler için dayanıklı kalması gerekir. Bağırsak bağışıklık sisteminin anatomik olarak sunulması antijenleri bağırsak mukoza üzerinden taşıyan hücreler antijen tarafından saf lenfositler etkinleştirdiğiniz yere, endüktif ve nerede aktive lenfositler belirli sarfetmek efektör siteleri, bölünmüş olabilir efektör fonksiyonları². Endüktif siteleri doğrudan eylem özel M hücreler ve bölgesel boşaltma Mezenterik lenf düğümleri (milyon) yoluyla intestinal Lümen anketler organize lenfoid yapı Peyer's yamalar (PP) oluşturmaktadır. Membran ve bağırsak epiteli, intraepitelyal lenfosit (IEL) içeren membran yer alan bir tek hücre katmanı altındaki bağ dokusu olan lamina propria (LP), efektör siteleri oluşur. Lenfositler enfeksiyonlar ve kanser karşı koruma aracılık ve immunopathology inflamatuar hastalıklarda da katkıda büyük oyuncular edinilmiş bağışıklığın vardır. Bu önemlidir ve bu farklı lenfosit çalışmaya son derece alakalı anatomik Mukozal bölmeleri için daha iyi indüksiyon ve efektör fonksiyonları anlıyorum.

Bağırsaklarda oluşan bağışıklık olaylar keşfetmek müfettişler sayısı hızlandırılması gibi nispeten basit ve Birleşik iletişim kuralı üzerinden bu bölmeleri lenfositlerin yalıtım için gereklidir. Birkaç araştırma grubu fare küçük bağırsak bölmeleri^{3,4,5,6,7 bağışıklık hücreleri izole için birkaç benzer işlemler paylaşır protokolleri yayınladık} . Ancak, tek iletişim kuralı odak bağlı olarak aralarında birkaç teknik farklar vardır. Örneğin, LP üzerinden bağışıklık hücreleri izole odaklı, bir protokol hücre canlılığı, hücre yüzey marker ifade ve izole bağışıklık hücreleri⁵kompozisyon çeşitli Enzimatik sindirim etkisini inceliyor. Başka bir protokol için yalıtım lenfositler yoğunluğu Santrifüjü⁶olmadan hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi vurgulamaktadır. Son olarak, belirli protokoller Ayrıca bağırsağın⁷farklı doku katmanlarından Mononükleer fagositler yalıtma amacıyla bulunmaktadır. Burada, ince bağırsak milyon, s, LP ve IEL kartı yuvası üzerinden lenfosit nüfusun sıralı yalıtım sağlayan son derece tekrarlanabilir bir protokol sunulmuştur.

Biz yüksek oranda saflaştırılmış örneğin alınma olasılığını büyük ölçüde kirletici bağırsak diğer bölmeleri üzerinden ücretsiz LP ve IEL bölmeleri izole odaklanır. Bu yaygın kullanılan iletişim kuralı üretir kabul edilebilir saat kısıtlamaları^{4,8,9,10,11,12}içinde sonuna kadar saf ve uygun lenfositlerin yüksek bir verim. Bu iletişim kuralı da iyi niyetli bir fırsat bu ayrı bölmeleri lenfosit çalışma izin en az çapraz compartmental bulaşma ile LP ve IEL yuvası üzerinden lenfositlerin yalıtım sağlar. İzole lenfositler akış sitometrik çözümlemesi veya fonksiyonel analiz gibi daha fazla manipülasyonlar tabi. Bu iletişim kuralı başarıyla lenfositler yalıtım için fare ince bağırsak ve kolon Listeria Monositogenez, Salmonella typhimuriumve Yersinia pseudotuberculosis gibi bakteriyel enfeksiyonlar sırasında uygulanmış enfeksiyonlar ve kimyasal ve patojen bağlı kolit gibi inflamatuar koşulları. Bu iletişim kuralı, dendritik hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit fare ince bağırsak ve kolon gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri izole etmek için de kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüsü kılavuzlarınıza uygun olarak yapılan ve Stony Brook Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış.

Not: tüm onayları yordamları gerçekleştirmeden önce sahip olduğunuzdan emin olun.

1. çözüm hazırlık

1. HGPG (HEPES, L-glutamine, penisilin/streptomisin ve viomisin), 100 ×
   1. 14.6 g L-glutamin (200 mM son), 1 × 10 59.6 g HEPES (500 mM son), mix⁶ U penisilin (2.000 U/mL son), 1 g streptomisin (2 mg/mL son) ve 2.5 mg gentamisin (5 µg/mL son). RPMI ekleyin 1640-500 mL. PH 7.5 NaOH kullanarak için ayarlamak (önce ayarlama, arabellek sarı/pH yaklaşık 6.0 ile turuncu). Filtre sterilize 0,45 µm filtre kullanarak. Aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 1 yıl veya 4 ° c ilâ 1 ay için.
2. Bikarbonat HEPES tampon, 10 x
   1. 23,8 g HEPES (100 mM son), 21 g NaHCO₃ (250 mM son) mix ve 1000 mL su ekleyin. 7,2 pH HCl. filtresiyle ayarlamak 0,45 mikron filtre sterilize. Oda sıcaklığında saklayın. PH zaman içinde değişir. PH düzenli olarak yeniden ayarlayın.
3. Hasat medya (~ 1 şişe/2 fareler)
   1. 500 mL RPMI 1640, 25 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 5) son ve 5 mL 100 × HGPG ekleyin. 6 ay 4 ° C'de depolayın
4. Dithioerythritol (DTE) çözüm (40 mL/küçük bağırsak)
   1. Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca₂⁺- ve Mg₂⁺-özgür, 50 mL 10 × bikarbonat HEPES tampon ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum (% 10 final). 350 mL H₂O ve 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM son) ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
5. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm (50 mL/küçük bağırsak)
   1. Mix 50 mL 10 × Hanks dengeli tuz solüsyonu, Ca₂⁺- ve Mg₂⁺-5 mL 100 × HGPG ile ücretsiz. 445 mL H₂O. eklemek 260 µL 0,5 M EDTA ekleyin/100 mL (1.3 mM son). Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
6. Collagenase çözüm (30 mL/LP)
   1. 500 mL RPMI, 50 mL FBS ekleyin (% 10 FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl₂ (1 mM son) ve 1 mL 0.5 M CaCl₂ (1 mM son). Tip ı (100 U/mL final), collagenase ekleyin. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
7. Yoğunluk gradient (DG) çözümleri
   1. 90 mL DG hisse senedi çözüm karıştırarak 1 × DG hisse senedi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) 10 mL 10 × PBS ile. 4 ° C'de steril tutmak
   2. % 44 DG çözüm (8 mL/IEL, 8 mL/LP) 44 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 56 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.
   3. % 67 DG çözüm (5 mL/IEL, 5 mL/LP) 67 mL 1 × DG hisse senedi çözüm ve 33 mL RPMI 1640 karıştırarak hazırlayın. Bu taze kullanmadan önce hazırlayın.

2. Mezenterik lenf düğümleri, bağırsak, yalıtım ve Peyer's yamalar

1. Karbondioksit narkozu ve ikincil servikal çıkığı kullanarak fare ötenazi. Sırtında fareyi getirin ve % 70 etanol ile sprey. Cilt ve Periton boşluğu ortaya çıkarmak için karın duvarı açmak ve makas bir ensizyon yapmak için kullanın.
2. Caecum bulun ve caecum yavaşça çekmeye forseps kullanın. Forseps dikkatli bir şekilde sağa, iki nokta üst üste ile uyumlu tüm MLN zinciri açığa bağırsağın taşımak için kullanın.
   Not:¹³zincir ve lenfatik drenaj bağırsaklar daha önce oldu Mezenterik lenf düğümlerinin bir harita tasvir.
3. Zincirdeki en yakın çekum için bulunan alt düğümü tanımlamak. Forseps kümesi bıçaklanmasından/fat etrafında kavramak ve yavaşça MLN zinciri alttan yukarı FAT'tan başka bir set Forseps ile lenf nodu çevresinde tweezing tarafından kaldırmak için kullanın.
4. MLN zinciri hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu. Zinciri kağıt kule üzerinde haddeleme ve forseps iki kümesini içeren yağ çekme bıçaklanmasından/yağ çıkarmak. Yer soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için MLN.
   Not: (i) doğrudan düğümleri kullanımı önerilmez. Bunun yerine, bıçaklanmasından/fat çevrelerindeki kavramak. (ii) bu kadar bıçaklanmasından/yağ hücre canlılık geliştirmek için mümkün olduğunca çıkarmak için önemlidir.
5. İnce bağırsak Pilor sfinkter altındaki ve üstündeki makas kullanarak çekum kesti. Bağırsak yavaş yavaş ileum için ekli bıçaklanmasından/fat forseps başka bir set kullanarak kaldırma sırasında bir forseps kümesi kullanarak oniki parmak bağırsağı çekin.
6. Bağırsak hasat medya ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirin ve kalan bıçaklanmasından/yağ kapalı Forseps ile iki alay.
   Not: (i) optimum hücre verim ve canlılık için mümkün olduğu kadar bıçaklanmasından/fat kaldırdığınızdan emin olun. (ii) bu ve aşağıdaki adımları düzenli aralıklarla hasat medya uygulayarak nemlendirilmiş bağırsak tutun.
7. Peyer's yamalar yanında izale onları--dan bağırsak eğri makas ile toplamak. Bir diseksiyon kapsamı veya Büyüteç (yeni başlayanlar); gerekirse kullanın çoğu Peyer's yamalar eğitimli gözle görünür olmalıdır. 5-11 (tipik) Peyer's yamalar bağırsağın toplamak. Daha sonra izolasyon adımlar için soğuk hasat medyada yer Peyer'ın yamalar.
   Not: Peyer's yamalar küçük, öncelikle yuvarlak çıkıntı yolun bıçaklanmasından ekin karşısında dış bağırsak duvarında.
8. Fekal içerik ve mukus sınırdışı duodenum ileum doğru forseps ve yavaşça slayttan düz tarafını kullanıyorsunuz. Mukus çoğunu kaldırmak için bir kez yineleyin.
   Not: Eksik mukus kaldırılması hücre canlılığı azaltmak ve verim. Yine de, yavaşça villus sıyırma veya Membran zarar önlemek için bağırsak slayt emin olun.
9. Bir noktada bir künt ucuyla iyi makas kullanın, künt sonuna bağırsak yerleştirin ve bağırsak ileum için boyuna duodenum arasında açık kesti. Yan yana açılan bağırsak ~ 2 cm parçalar halinde kesin. Bağırsak adet 25 mL soğuk hasat medya daha sonra izolasyon adımlar için bir 50 mL konik boru yerleştirin.
   Not: medya ile nemlendirilmiş makas tutma zahmetsizce bağırsak slayt yardımcı olacaktır.

3. yalıtım lenfositleri endüktif sitelerden

1. Lenfositler MLN dan yavaşça 3 mL şırınga pistonu kullanarak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla dissociating tarafından izole et. Hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
2. Pelet MLN-hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.
   Not: kırmızı kan hücre lizis arabellek kanama kaldırma işlemi sırasında oluşursa, kırmızı kan hücreleri kaldırmak için kullanılabilir.
3. Lenfositler Peyer's yamalar dan Peyer's yamalar 37 ° C ve 30 dk için 220 devir/dakika 5 mL prewarmed collagenase solüsyon içeren 15 mL konik tüp içinde kuluçka tarafından izole et.
4. Girdap 15 s maksimum ayar ve filtre doku ve süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine sindirmek. Yavaşça bir 3-mL şırınga pistonu kullanarak kalan doku parçaları ayırmak ve hücre süzgeç 5 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
5. 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Peyer's yama hücreleri cips ve hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.
   Not: yamalar yalıtım Peyer bazı bulaşıcı lamina propria lenfositler ve intraepitelyal lenfositlerin olabilir.

4. ince bağırsak üzerinden intraepitelyal lenfositlerin yalıtım

1. Tüpü 10 kat ters çevirme, bağırsak adet yerleşmek izin ve süpernatant dökme ince bağırsak parçalar üç kez 25 mL soğuk hasat medya ile yıkayın.
   Not: Doku parçaları kolayca tüp altına yerleşmek. Eğer onlar yapmak değil, çok fazla bıçaklanmasından/fat bağlı kalır veya bunların bir hava kabarcığı ile ilişkili olduğu bir gösterge 's.
2. Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve bir 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren şişesi için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın.
3. Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant bir yeni 50 mL konik tüp içine orijinal tüpte doku parçaları tutmak için dikkatli olmak bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla ayarlama maksimumda. Süpernatant; atmayın süpernatant intraepitelyal lenfosit içerir. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 10 mL soğuk hasat medyada resuspend ve buz üzerinde saklayabilirsiniz.
4. Bağırsak parçaları içeren 50mL konik tüp 20 mL prewarmed DTE çözeltisi ekleyin ve geri 50 mL siliconized Erlenmeyer bir heyecan-bar içeren balon için transfer. 37 ° C'de karıştırın ve bir manyetik karıştırıcı 20 dakika süreyle üzerinde 220 devir/dakika büyük bir mıknatıs balonun dışarıdan heyecan-bar tutun ve doku ve çözüm 50 mL konik tüp geri aktarmak için kullanın.
   Not: DTE intraepitelyal lenfositlerin zenginleştiren bir indirgeyici var.
5. Girdap tüp için 10 s. Transfer süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süpernatant ilk DTE tedavi (Kimden adım 4.3) hücrelerden içeren önceki tüp içine ayarlama maksimumda.
   Not: Kalan bağırsak adet lenfositler lamina propria dan izole etmek için kullanılır. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak epitel hücresi varsa ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim.
6. Pelet hücreleri süpernatant 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL % 44 DG çözeltisi (RT) oda sıcaklığında resuspend.
7. Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL RT % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. 1600 × g 20 dk, RT için de freni kullanmadan santrifüj kapasitesi.
   Not: Tüpler hücreleri tüp duvarlara yapışmasını önlemek için sığır serum ile pretreated.
8. Not hücrelerin bir grup (buffy ceket) %44 67 arayüzü oluşturmak, geçişin en üstündeki mukoid bir filmde ölü hücreleri ve bazı epitel hücreleri vardır ve kırmızı kan hücreleri içinde Pelet vardır. Degradeye ~ 2 cm arabiriminin üst tabakası tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Pasteur pipet buffy mantoyu arayüz hasat ve bir 50 mL konik tüp 40 mL soğuk hasat ortamı içeren aktarmak için kullanın.
9. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.

5. yalıtım üzerinden ince bağırsak Lamina Propria lenfositlerin

1. Epitel hücreleri kalan bağırsak parçayı içeren şişeye 25 mL prewarmed EDTA çözeltisi ekleyerek bağırsak doku parçaları kaldırın. Heyecan şişesi 37 ° C ve üzerinde 30 dakika süreyle bir manyetik karıştırıcı 220 devir/dakika, heyecan-bar tutun ve dikkatle süpernatant balonun içinde bağırsak adet tutarken atmak için balonun dışarıdan büyük bir mıknatıs kullanın.
   Not: kalsiyum-bağımlı kavşak hedefler ve dekolmanı bağırsak epitel hücrelerinin bir kalsiyum şelatör EDTA (i) dir. (ii) süpernatant bulutlu olmalı ve onların toplama istenirse IEC yalıtmak için kullanılabilir.
2. 5.1 arasındaki adımları yineleyin.
   Not: Süpernatant bu kuluçka takip daha az bulutlu olması gerekir. Kalite kontrol: Doku bir parça kaldırıldı ve histolojik olarak bağırsak epitel hücreleri kaldırıldı ve membran sağlamdır emin olmak için kontrol ettim. Bir örnek üzerinden süpernatant Ayrıca onaylamak için Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir o lökosit (CD45⁺ hücreleri) yok.
3. RT hasat Medya 50 mL şişe için ekleyin. Kısaca bir mıknatıs ile karıştırın. Yerleşmek ve dikkatle süpernatant atın bağırsak adet izin.
   Not: EDTA collagenase için collagenase işlevi önemlidir kalsiyum şelat tarafından inaktive gibi EDTA kaldırma collagenase sindirim önce bu adım sağlar.
4. Şişesi için 30 mL prewarmed collagenase çözeltisi ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı 45 dakika için üzerinde bağırsak adet 37 ° C ve 220 devir/dakika karıştırın.
5. Transferi doku ve 50 mL konik tüp süpernatant 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla süzme yoluyla sindirmek. Yavaşça kalan doku adet filtreden püre için 3 mL şırınga pistonu kullanarak ayırmak. 10 mL soğuk hasat medya filtresiyle yıkayın.
6. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 8 mL ortam sıcaklığı % 44 DG çözüm resuspend.
7. Transfer 8 mL % 44 DG çözüm/hücre süspansiyon 17 mm ø x 100 içine mm 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp tarzı. 5 mL ortam sıcaklığı % 67 DG çözeltisi ile altına koymak. Oda sıcaklığında ve 1600 × g 20 dk için hiçbir fren degradeler santrifüj kapasitesi.
8. Şişman katmanın üst tarafından vakum aspirasyon kaldırın. Buffy mantoyu arabirimi ve 40 mL soğuk hasat ortamı içeren bir 50 mL konik tüp aktarmak, hasat için bir Pasteur pipet kullanın.
9. Pelet hücreleri 400 × g 4 ° C'de 5 min için de centrifuging tarafından Hücre Pelet 1 mL soğuk hasat medyada resuspend. Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri hesaplama.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokol şematik gösterimi tasvir edilir (şekil 1). Lenfositler efektör siteleri ve bağırsak mukoza endüktif içinde belirgin bir biçimde düzenlenir. Peyer's yamalar (PP) ve Mezenterik lenf düğümleri (milyon) içerir lenfositler iyi organize edilmiş T-hücre ve B-hücre köklerinin, bağırsak epitel daha diffüz dağıtılır lenfosit içerir, ancak. Lamina propria (LP) havza dağıtılmış lenfositler ve izole lenfoid follikül (IIf) ve crypto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Detaylı bir protokol endüktif (milyon ve PP) Mukozal lenfosit gelen bağırsak yalıtım için sunulur ve efektör (LP ve IEL yuvası) siteleri. Protokol giriş (zaman) ve çıkış (canlılık ve verim) verimlilik ve sonuçları maksimize etmek için dengelemek için geliştirilmiştir. Protokol Ayrıca LP ve IEL bölmeleri arasında en az çapraz compartmental bulaşma sağlar.

Fare bağırsağı bağışıklık hücreleri yalıtım için birkaç protokol-si olmak be yayınlanan

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148