Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Resumo

O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto gastrointestinal, gerando respostas tolerantes aos antígenos alimentares e bactérias comensais enquanto montagem eficazes respostas imunes a enteropatogênica micróbios. Além disso, é evidente que a imunidade intestinal local tem um profundo impacto na imunidade sistêmica e distante. Portanto, é importante estudar como uma resposta imune intestinal é induzida e qual é o resultado da resposta imunológico. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o isolamento de linfócitos de intestino sites indutivo como o tecido linfoide associado intestino de Peyer e a drenagem de linfonodos mesentéricos e efetoras sites como a propria do lamina e o epitélio intestinal. Essa técnica garante o isolamento de um grande número de linfócitos pequenos tecidos intestinais com pureza ideal e viabilidade e mínima contaminação compartimental dentro de restrições de tempo aceitável. A capacidade técnica para isolar linfócitos e outras células do sistema imunológico dos tecidos intestinais permite a compreensão das respostas imunes, infecções gastrintestinais, cancros e doenças inflamatórias.

Introdução

Tracto gastrointestinal (GI) tem muitas dobras e saliências que representa a maior interface separando o corpo interno e o ambiente externo. O sistema imunitário intestinal desempenha um papel essencial na manutenção da função de barreira do tracto GI. Ele é constantemente exposto a antígenos alimentares, bactérias comensais e micróbios patogênicos. Como tal, deve continuar a ser tolerante aos antígenos alimentares e bactérias comensais, preservando a capacidade de rapidamente gerar uma resposta imune eficaz para micróbios enteropatogênica¹. O sistema imunitário intestinal pode ser dividido anatomicamente em sites indutivos, onde ingênuo linfócitos são ativados por transportar antígenos da mucosa intestinal de células apresentadoras, e efetoras sites, onde os linfócitos ativados exercem específicas de funções efetoras². Os sites indutivos compõem a estrutura linfoide organizada de Peyer (PP) que examina o lúmen intestinal diretamente através da ação de células especializadas de M e os regionais drenagem linfonodos mesentéricos (MLN). Os sites de efetor consistem na lâmina própria (LP), que é o tecido conjuntivo abaixo da membrana basal e o epitélio intestinal, uma camada única célula localizada acima da membrana basal que contém linfócitos intraepiteliais (IEL). Os linfócitos são grandes jogadores de imunidade adaptativa que mediam a proteção contra infecções e cancros e também podem contribuir para Imunopatologia em doenças inflamatórias. É importante e altamente relevantes para o estudo de linfócitos nestes distintos compartimentos da mucosa anatômicos para melhor entendem suas funções efetoras e de indução.

Um protocolo relativamente simples e unificado para o isolamento de linfócitos desses compartimentos é necessário que o número de investigadores explorar imunes eventos que ocorrem no intestino está acelerando. Diversos grupos de pesquisa tem publicado os protocolos que compartilham diversos processos semelhantes para isolar as células imunes do rato pequenos compartimentos intestinal^3,4,5,6,7 . No entanto, existem várias diferenças técnicas entre eles dependendo do foco do protocolo individual. Por exemplo, com o foco em isolar as células imunes do LP, um protocolo examina o impacto de vários digestões enzimáticas na viabilidade celular, expressão marcador de superfície de célula e a composição das células imunes isolado⁵. Outro protocolo destaca um método rápido e reprodutível para isolamento dos linfócitos sem densidade centrifugação⁶. Finalmente, protocolos específicos também existem com a finalidade de isolar os fagócitos mononucleares de camadas de tecido diferente do intestino delgado⁷. Aqui, apresenta-se um protocolo altamente reprodutível que permite isolamento sequencial das populações de linfócitos do compartimento do MLN, PP, LP e IEL do intestino delgado.

Focamos em isolar populações altamente purificadas de compartimentos do LP e do IEL, que são em grande parte livres de contaminantes de outros compartimentos intestinais. Isto amplamente utilizado protocolo produz um alto rendimento de linfócitos màxima puros e viáveis dentro de tempo aceitável restrições^{4,8,9,10,11,12}. Este protocolo também garante o isolamento dos linfócitos do compartimento do LP e IEL com mínima contaminação cruzada compartimental, permitindo uma oportunidade genuína estudar os linfócitos nesses compartimentos distintos. Os linfócitos isolados podem ser submetidos a outras manipulações como fluxo cytometric análise ou análise funcional. Este protocolo foi aplicado sucesso ao isolamento de linfócitos de rato do intestino delgado e cólon durante infecções bacterianas como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume pseudotuberculosis Yersinia infecções e condições inflamatórias, como a colite química e patógeno-induzida. Este protocolo também pode ser usado para isolar as células imunes inatas como células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e monócitos do rato do intestino delgado e cólon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações do Instituto Nacional de saúde e aprovados pelo Comitê de uso e Stony Brook University institucional Cuidado Animal.

Nota: Certifique-se que todas as aprovações são concedidas antes da realização de procedimentos.

1. preparação da solução

1. HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e gentamicina), 100 ×
   1. Misturar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g L-glutamina (200 mM final), 1 × 10⁶ U penicilina (2.000 U/mL final), estreptomicina 1G (2 mg/mL final) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL final). Adicionar RPMI 1640 para 500 mL. Ajustar o pH a 7,5 usando NaOH (antes do ajuste, o buffer é amarelo/laranja com um pH em torno de 6.0). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,45 µm. Alíquota e loja a-20 ° C por até 1 ano ou a 4 ° C por até 1 mês.
2. Tampão HEPES-bicarbonato, 10 x
   1. Misturar 23,8 g HEPES (100mm final), 21 g NaHCO₃ (250 mM final) e adicionar água para 1.000 mL. Ajustar o pH para 7.2 com HCl. filtro esterilizar usando um filtro de 0,45 μm. Armazenar em temperatura ambiente. O pH é alterado ao longo do tempo. Re-ajuste o pH periodicamente.
3. Colheita de mídia (~ 1 garrafa/2 ratos)
   1. A 500 mL de RPMI 1640, adicione 25 mL inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (5% final) e 5 mL 100 × HGPG. Armazenar até 6 meses a 4 ° C.
4. Solução de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeno intestino)
   1. Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca₂⁺- Mg₂⁺-grátis 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino (10% no final). Adicione 350 mL H₂O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM no final). Prepare este fresco antes da utilização.
5. Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (50 mL/pequeno intestino)
   1. Mix 50 mL 10 × solução salina balanceada de Hanks e Ca₂⁺- Mg₂⁺-livre com 5 mL 100 × HGPG. Adicionar 445 mL H₂O. Adicionar 260 µ l EDTA de 0,5 M/100 mL (final de 1,3 mM). Prepare este fresco antes da utilização.
6. Solução de colagenase (30 mL/LP)
   1. A RPMI de 500 mL, adicionar 50 mL FBS (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl₂ (final de 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl₂ (final de 1 mM). Adicionar a colagenase, tipo I (final de 100 U/mL). Prepare este fresco antes da utilização.
7. Soluções de (DG) gradientes de densidade
   1. Preparar 1 × DG solução misturando DG de 90 mL de solução (consulte a Tabela de materiais) com 10 mL de 10 × PBS. Manter estéril a 4 ° C.
   2. Prepare a solução DG de 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP), misturando 44 mL da solução-mãe 1 × DG e 56 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.
   3. Prepare a solução DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP), misturando 67 mL da solução-mãe 1 × DG e 33 mL de RPMI 1640. Prepare este fresco antes da utilização.

2. isolamento dos linfonodos mesentéricos, intestinos e do Peyer Patches

1. Eutanásia o mouse usando narcose de dióxido de carbono e deslocamento cervical secundário. Coloque o mouse em suas costas e pulverizar com etanol a 70%. Use a tesoura para fazer uma incisão e abrir a pele e a parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.
2. Localize o ceco e use a pinça para puxar delicadamente o ceco. Use fórceps para deslocar cuidadosamente o intestino delgado para a direita, expondo toda a cadeia MLN, que é alinhada com o cólon.
   Nota: Um mapa dos gânglios linfáticos mesentéricos, cadeia e drenagem linfática do intestino foi anteriormente descrito¹³.
3. Identifica o nó inferior da cadeia, localizado mais próximo ao ceco. Use um conjunto de pinças para agarrar o mesentério ou a gordura em torno dele e remova cuidadosamente a cadeia MLN do fundo ao topo por arrancas a gordura ao redor do nó de linfa com outro conjunto de pinças.
4. Colocar a cadeia MLN sobre uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita. Remova o mesentério/gordura por rolando a cadeia da torre de papel e retirar a gordura com dois conjuntos de pinças. Coloque o MLN em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento.
   Nota: (i) direta manipulação de nós é desencorajada. Em vez disso, segure o mesentério ou a gordura em torno deles. (ii) é essencial para remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para melhorar a viabilidade celular.
5. Corte o intestino abaixo do esfíncter piloro e acima o ceco com uma tesoura. Retire o intestino lentamente do íleo ao duodeno, usando um conjunto de pinças enquanto retira o mesentério/gordura anexado usando um outro conjunto de pinças.
6. Coloque uma toalha de papel umedecida com mídia de colheita o intestino e provocar qualquer mesentério/gordura restante fora com dois conjuntos de pinças.
   Nota: (i) Certifique-se de remover o mesentério/gordura, tanto quanto possível para o rendimento da célula ideal e viabilidade. (ii) manter o intestino umedecido durante esta e as etapas a seguir aplicando colheita mídia periodicamente.
7. Colete de Peyer, removendo-as do intestino com uma tesoura curva. Use uma dissecação escopo ou lupa se necessário (iniciantes); a maioria de Peyer deve estar visíveis para o olho treinado. Colete 5-11 (típico) de Peyer do intestino. Patches do lugar Peyer em meios de colheita de frio para etapas posteriores de isolamento.
   Nota: De Peyer patches são pequenos, principalmente por protuberâncias na parede intestinal exterior em frente a linha de fixação do mesentério.
8. Use o lado liso da pinça e delicadamente slide do duodeno para íleo para expelir muco e conteúdo fecal. Repeti uma vez para remover a maioria do muco.
   Nota: Remoção incompleta de muco pode diminuir a viabilidade celular e rendimento. No entanto, certifique-se de deslizar o intestino com cuidado para evitar descascamento vilosidades ou danificar a membrana basal.
9. Use tesoura bem com um fim brusco em um ponto, insira a extremidade sem corte no intestino e corte o intestino aberto longitudinalmente do duodeno ao íleo. Lateralmente, corte o intestino aberto em ~ 2 cm. Coloque as peças intestinais em um tubo cónico de 50 mL com mídia de colheita frio 25 mL para etapas posteriores de isolamento.
   Nota: Manter a tesoura umedecida com mídia irá ajudá-los deslizar facilmente através do intestino.

3. isolamento de linfócitos de Sites indutivos

1. Isole os linfócitos do MLN, dissociando suavemente através de um filtro de célula de 70 µm usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL. Lave o filtro de célula com 5 mL de mídia colheita frio.
2. Pelota MLN-células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
   Nota: tampão de lise de células vermelhas do sangue pode ser usado para remover células vermelhas do sangue se o sangramento ocorreu durante a remoção.
3. Isole os linfócitos de Peyer incubando de Peyer em um tubo cônico de 15 mL contendo solução de colagenase 5 mL pré-aquecido a 37 ° C e 220 rpm por 30 min.
4. Vórtice por 15 s na configuração máxima e filtro digerido tecido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente, dissociar as restantes peças de tecido, usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL e lavar o filtro célula com 5 mL de mídia colheita frio.
5. Células de Peyer remendo de pelotas por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.
   Nota: Peyer do isolamento de patches pode ter algum contaminante linfócitos da lâmina própria e linfócitos intraepiteliais.

4. isolamento de linfócitos intraepiteliais do intestino

1. Lave os pedaços de intestino três vezes com 25 mL de mídia colheita frio por inversão do tubo 10 vezes, deixando as peças intestinais resolver e decantar o líquido sobrenadante.
   Nota: Peças de tecido devem resolver prontamente à parte inferior do tubo. Se não o fizerem, é uma indicação que demasiada mesentério/gordura permanece anexada ou eles estão associados com uma bolha de ar.
2. Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir para um balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.
3. O tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mL através de um filtro de célula de 70 µm tendo o cuidado de manter as peças de tecido no tubo original de vórtice. Não descartar o sobrenadante; o sobrenadante contém linfócitos intraepiteliais. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de células em meios de colheita de frio de 10 mL e armazenar no gelo.
4. Adicionar 20 mL de solução DTE escaldada ao tubo cónico de 50 mL contendo pedaços de intestino e transferir de volta para o balão de Erlenmeyer siliconizado da 50 mL contendo uma barra de agitação. Mexa a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 20 min. Use um ímã grande do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e transferir o tecido e a solução volta para o tubo cónico de 50 mL.
   Nota: DTE é um agente redutor que enriquece linfócitos intraepiteliais.
5. Vórtice do tubo no máximo configuração para transferência s. 10 o sobrenadante através de um filtro de célula de 70 µm no tubo anterior contendo células do sobrenadante do primeiro tratamento DTE (da etapa 4.3).
   Nota: As peças restantes intestinais são usadas para isolar linfócitos da propria do lamina. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais estão presentes e a membrana basal está intacta.
6. Pellet de células por centrifugação o sobrenadante em 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% na temperatura de quarto (RT).
7. A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min no RT sem usar o freio.
   Nota: Os tubos podem ser pré-tratados com soro bovino para impedir que as células aderindo às paredes do tubo.
8. Note-se que células viáveis formam uma banda (buffy coat) na interface de 44% para 67%, células mortas e algumas células epiteliais estão em um filme mucoide na parte superior do gradiente e células vermelhas do sangue está na pelota. Remova a camada superior do gradiente para dentro de ~ 2 cm da interface por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco buffy na interface e transferi-los para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.
9. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.

5. isolamento de linfócitos da lâmina própria do intestino

1. Remova células epiteliais de pedaços de tecido intestinal adicionando-se 25 mL da solução de EDTA escaldada para o frasco contendo as peças restantes intestinais. Frasco de agitar a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético durante 30 min. Use um grande ímã do lado de fora do frasco para segurar a barra de agitação e cuidadosamente, desprezar o sobrenadante, mantendo intestinais pedaços dentro do frasco.
   Nota: (i) o EDTA é um quelante de cálcio metas entroncamentos de cálcio-dependente e promove o desprendimento das células epiteliais intestinais. (ii) o sobrenadante deve ser nublado e pode ser usado para isolar o IEC se sua coleção for desejada.
2. Repita a etapa 5.1.
   Nota: O sobrenadante deve ser menos nublado após esta incubação. Controle de qualidade: Um pedaço de tecido pode ser removido e verificado histologicamente para garantir que as células epiteliais intestinais foram removidas e a membrana basal está intacta. Uma amostra do líquido sobrenadante também pode ser avaliada por citometria de fluxo para confirmar que leucócitos (CD45⁺ células) estão ausentes.
3. Adicione 50 mL de mídia de colheita de RT no balão. Mexa rapidamente com um ímã. Deixe pedaços intestinais resolver e cuidadosamente descartar o sobrenadante.
   Nota: Este passo garante a remoção de EDTA antes da digestão de colagenase EDTA inactivates colagenase por quelantes do cálcio que é essencial para a função de colagenase.
4. Adicionar 30 mL de solução de colagenase escaldadas no balão e misture pedaços intestinais a 37 ° C e 220 rpm em um agitador magnético por 45 min.
5. Transferi tecido digerido e o sobrenadante para um tubo cónico de 50 mL por filtragem através de um filtro de célula de 70 µm. Delicadamente dissocia os pedaços restantes do tecido usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL de mash através do filtro. Lave o filtro com 10 mL de mídia colheita frio.
6. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 8 mL de solução DG de 44% de temperatura ambiente.
7. A suspensão de solução/célula DG de 44% de 8 mL de transferência em um 17 mm ø x 100 mm estilo 14 mL tubo polipropileno de fundo redondo. Subjacência com 5 mL de solução DG de 67% de temperatura ambiente. Centrifugue os gradientes em temperatura ambiente e 1600 × g por 20 min com sem freio.
8. Remova a camada de gordura na parte superior por vácuo-aspiração. Use uma pipeta Pasteur para colher o casaco de buffy para a interface e a transferência para um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL frio colheita meios de comunicação.
9. Pellet de células por centrifugação a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet de célula em mídia de frio colheita de 1 mL. Contagem de células viáveis usando trypan azul exclusão.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Uma representação esquemática do protocolo é retratada (Figura 1). Linfócitos dentro da mucosa intestinal indutivo e sites effector organizam-se distintamente. Peyer do patches (PP) e linfonodos mesentéricos (MLN) contêm linfócitos em áreas bem organizadas de células T e células B folículos, enquanto que o epitélio intestinal contém linfócitos que são mais difusamente distribuídos. A lâmina própria (LP) contém linfócitos difusamente distr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Um protocolo detalhado é apresentado para o isolamento de linfócitos do intestinal da mucosa indutivo (MLN e PP) e sites effector (compartimento de LP e IEL). O protocolo foi desenvolvido para equilibrar (tempo) de entrada e saída (viabilidade e rendimento) para maximizar a produtividade e resultados. O protocolo também garante mínima contaminação compartimental entre compartimentos LP e IEL.

Vários protocolos para o isolamento de células do sistema imunológico do intestino de rato f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148